李 潔,李美芳,駱 莉,張麗霞,朱曉林

河北省邯鄲市第一醫(yī)院：1.腫瘤內(nèi)科；2.康復(fù)醫(yī)學(xué)科，河北邯鄲 056000

食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)是發(fā)生于食道且病理類型為鱗狀細(xì)胞癌的惡性腫瘤，約占臨床中所有食道癌類型的90%，ESCC患者常表現(xiàn)為吞咽困難，且隨著病情加重還有可能出現(xiàn)病灶轉(zhuǎn)移[1]。有研究顯示在腫瘤復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移過(guò)程中，由于血管生成過(guò)程作為能夠?yàn)槟[瘤生長(zhǎng)提供所需要的營(yíng)養(yǎng)，因此也是造成腫瘤不斷復(fù)發(fā)及病灶持續(xù)轉(zhuǎn)移的重要因素[2]。而血管生成擬態(tài)(VM)作為不同于傳統(tǒng)的腫瘤新生血管，目前臨床證實(shí)其與多種因子如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、遷移誘導(dǎo)蛋白7等具有密切聯(lián)系[3-4]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)作為人體腫瘤組織及體液中存在的一種長(zhǎng)度大于200 bp的核苷酸分子，眾多研究表明其與多數(shù)惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移具有密切聯(lián)系[5-6]。其中腫瘤抑制候選基因7(TUSC7)在ESCC患者中呈現(xiàn)低表達(dá)從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而尿路上皮癌相關(guān)基因1(UCA1)在ESCC患者中的特異性表達(dá)也同樣提示其與腫瘤的發(fā)展存在密切聯(lián)系[7-8]。但兩者與ESCC患者發(fā)生VM之間的關(guān)系暫未有研究闡明，因此本研究通過(guò)選取133例ESCC患者，并采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶聯(lián)反應(yīng)(qPCR)檢測(cè)其血清lncRNA-TUSC7、lncRNA-UCA1，進(jìn)一步分析兩者與VM之間的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性分析2020年3月至2021年12月經(jīng)本院確診為ESCC的133例患者，按照是否形成VM將其分為VM組76例及無(wú)VM組57例，其中VM組男37例，女39例，年齡32～64歲，平均(51.12±7.74)歲；無(wú)VM組中男25例，女32例，年齡33～65歲，平均(51.63±7.52)歲，兩組基線資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。所有納入研究的患者對(duì)本研究所采取的檢測(cè)方式及研究目的均獲得知情權(quán)，并簽署知情同意書，本研究所獲取的臨床資料及一般信息均采取保密措施，不做其他用途。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所選取的ESCC患者符合文獻(xiàn)[9]的ESCC診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)臨床資料及一般信息完整；(3)簽署知情同意書；(4)依從性較高，能夠配合研究進(jìn)行。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)伴有精神類疾??；(2)研究過(guò)程中私自服用藥物導(dǎo)致研究結(jié)果產(chǎn)生偏差；(3)伴有肝、腎、心功能嚴(yán)重障礙；(4)伴有先天性免疫功能缺陷。

1.2方法

1.2.1qPCR檢測(cè)血清lncRNA-TUSC7、lncRNA-UCA1表達(dá) lncRNA-TUSC7、lncRNA-UCA1表達(dá)均采用qPCR進(jìn)行檢測(cè)，具體操作如下，兩組患者均于清晨空腹?fàn)顟B(tài)采取外周血5 mL，放入離心機(jī)(美國(guó)Themor公司)中，以3 500 r/min(離心半徑：13.5 cm)離心10 min，離心完畢后分離上層血清并放置于-70 ℃的冰箱中保存以待檢測(cè)。取待測(cè)血清并采用Trizol法提取血清總RNA，在每1 mL的Trizol試劑裂解樣中加入0.2 mL氯仿(成都市科龍化工試劑廠)，并劇烈振蕩15 s后在15～30 ℃的條件下孵育3 min，4 ℃下12 000 r/min離心15 min；離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相，中間層及無(wú)色水相上層； 將水相上層轉(zhuǎn)移到干凈無(wú)RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15～30 ℃孵育10 min后，于4 ℃下12 000 r/min 離心10 min；移去上清液，每1 mLTrizol試劑裂解的樣品中加入至少1 mL的75%乙醇(成都市科龍化工試劑廠)混勻后，4 ℃下7 000 r/min離心5 min；小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5～10 min；溶解RNA時(shí)，先加入無(wú)RNA酶的水40 μL用槍反復(fù)吹打幾次，使其完全溶解，獲得的RNA溶液保存于-80 ℃待用；在4 ℃對(duì)其完整度及純度進(jìn)行檢驗(yàn)，RNA溶液的A260/A280即為RNA純度，比值1.8～2.1；在條件為42 ℃ 60 min，70 ℃ 10 min下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄并在4 ℃下進(jìn)行保存；采用3 g/dL瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物，并用花青素溴化乙錠染色，采用凝膠成像儀獲取Ct值，其變化以ΔCt表示；以18 s作為內(nèi)參，序列為上游5′-CAGCCACCCGAGATTGAGCA-3′，下游5′-TAG TAG CGACGGGCGGTGTG-3′；lncRNA-UCA1序列為上游5′-CTCTCCATTGGGTTCACCATTC-3′，下游5′-GCGGCAGGTCTTAAGAGATGAG-3′；lncRNA-TUSC7序列為上游5′-CATACAGAAGGCACCTCAA-3′，下游5′-GTCAGAGCA GTCACACTT-3′，采用2-ΔΔCt法計(jì)算lncRNA-TUSC7、lncRNA-UCA1的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.2CD34聯(lián)合PAS染色判定VM 取所有ESCC患者腫瘤標(biāo)本并按照流程制成石蠟切片，常規(guī)脫蠟水化后采用CD34染色，在高壓鍋中放入檸檬酸鹽抗原修復(fù)液中進(jìn)行5 min修復(fù)過(guò)程，待冷卻后采用PBS洗滌3次，放入3%H2O2中孵育30 min后PBS洗滌3次，再次重復(fù)以上操作；VE-cadherin抗體孵育過(guò)夜后PBS洗滌3次；加入DAB顯色后蒸餾水終止染色，并在PASI液下氧化10 min，蒸餾水沖洗后PASⅡ避光染色10 min，蘇木素復(fù)染后中性樹膠封片；以管腔壁CD34染色陰性，內(nèi)見紅細(xì)胞，并在外層可觀察到PAS陽(yáng)性物質(zhì)圍繞則可判定為VM陽(yáng)性。

1.3觀察指標(biāo) (1)對(duì)比兩組患者血清合lncRNA-TUSC7、lncRNA-UCA1表達(dá)差異；(2)分別分析lncRNA-TUSC7、lncRNA-UCA1與ESCC患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系；(3)Spearman相關(guān)系數(shù)分析lncRNA-TUSC7、lncRNA-UCA1表達(dá)與VM生成之間的相關(guān)性；(4)受試者工作特征曲線(ROC曲線)分析聯(lián)合lncRNA-TUSC7、lncRNA-UCA1檢測(cè)對(duì)ESCC患者形成VM的預(yù)測(cè)效能。

2 結(jié) 果

2.1對(duì)比兩組患者血清lncRNA-TUSC7、lncRNA-UCA1表達(dá)差異 相比于無(wú)VM組，VM組患者lncRNA-TUSC7表達(dá)顯著降低，而lncRNA-UCA1表達(dá)顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組患者血清lncRNA-TUSC7、lncRNA-UCA1表達(dá)比較

2.2分析lncRNA-TUSC7與ESCC患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系 lncRNA-TUSC7與ESCC患者腫瘤分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及是否發(fā)生VM具有密切聯(lián)系(均P<0.05)，見表2、圖1。

表2 lncRNA-TUSC7與ESCC患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

圖1 lncRNA-TUSC7與ESCC患者臨床病理參數(shù)回歸森林圖

2.3分析lncRNA-UCA1與ESCC患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系 lncRNA-UCA1與ESCC患者腫瘤分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、浸潤(rùn)程度及是否發(fā)生VM具有密切聯(lián)系(均P<0.05)。見表3、圖2。

圖2 lncRNA-UCA1與ESCC患者臨床病理參數(shù)回歸森林圖

表3 lncRNA-UCA1與ESCC患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

2.4分析lncRNA-TUSC7、lncRNA-UCA1表達(dá)與VM生成之間的關(guān)系 Spearmam相關(guān)系數(shù)顯示，lncRNA-TUSC7與VM生成之間呈負(fù)相關(guān)(r=-0.782，P<0.001)，而lncRNA-UCA1與VM生成之間呈正相關(guān)(r=0.766,P<0.001)。

2.5分析lncRNA-TUSC7、lncRNA-UCA1聯(lián)合檢測(cè)對(duì)VM生成的診斷價(jià)值 ROC曲線顯示lncRNA-TUSC7、lncRNA-UCA1聯(lián)合檢測(cè)的曲線下面積(AUC)顯著高于單一檢測(cè)(Z=2.428，P<0.05)，且具有較高的靈敏度與特異度，見表4、圖3。

圖3 ROC曲線分析lncRNA-TUSC7、lncRNA-UCA1聯(lián)合檢測(cè)對(duì)VM生成的診斷價(jià)值

表4 各指標(biāo)診斷效能

3 討 論

ESCC作為一種惡性且伴有侵襲性的腫瘤疾病，臨床上可通過(guò)化療、放療、手術(shù)等多種方式進(jìn)行治療，但由于腫瘤細(xì)胞繁殖速度較快，因此極易發(fā)生腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致患者的生存預(yù)后情況較差[10]。越來(lái)越多的研究表明，腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移與血管生成之間具有密切聯(lián)系，而VM作為一種血液供應(yīng)模式，其不依賴于內(nèi)皮細(xì)胞且與腫瘤細(xì)胞惡性程度之間具有重要關(guān)系，提示VM可能參與ESCC復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，因此通過(guò)對(duì)有效指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)并預(yù)防VM對(duì)改善ESCC患者的預(yù)后生存具有重要意義[11]。由于VM形成過(guò)程有多種因子參與，但目前臨床上對(duì)VM的發(fā)病機(jī)制尚未形成統(tǒng)一定論，且單一因子也不能完全解釋VM發(fā)病機(jī)制，因此探討相關(guān)因子參與VM形成過(guò)程，能夠?yàn)榕R床診療、改善ESCC患者預(yù)后提供新的理論依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，lncRNA-TUSC7在VM患者體內(nèi)呈現(xiàn)低表達(dá)，且lncRNA-TUSC7與VM生成之間呈負(fù)相關(guān)(r=-0.782，P<0.001)?，F(xiàn)如今越來(lái)越多的研究表明，lncRNAs能夠調(diào)控上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化從而參與腫瘤的發(fā)展過(guò)程，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移，lncRNA-TUSC7作為近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種新的抑癌基因，在多種腫瘤組織中呈現(xiàn)低表達(dá)[12]。對(duì)其促進(jìn)ESCC發(fā)展及VM形成的機(jī)制進(jìn)行猜測(cè)后筆者認(rèn)為，lncRNA-TUSC7能夠通過(guò)與miR-211、miR-10a等發(fā)生相互作用，從而調(diào)控上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程，使上皮細(xì)胞失去與基底膜的連接，從而獲得更高的遷移、侵襲率，促使VM的形成及惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[13]。趙珂等[14]報(bào)道基礎(chǔ)研究中也同樣表明，敲低lncRNA-TUSC7后可導(dǎo)致E-cadherin蛋白表達(dá)降低，Vimention蛋白表達(dá)升高，進(jìn)一步提高細(xì)胞遷移及侵襲率，指出過(guò)表達(dá)lncRNA-TUSC7對(duì)ESCC具有逆轉(zhuǎn)作用。而本研究還顯示lncRNA-UCA1在VM患者血清呈高表達(dá)，且lncRNA-UCA1與VM生成之間呈正相關(guān)(r=0.766,P<0.001)。lncRNA-UCA1作為由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成的長(zhǎng)度為2 314 bp染色體，隨著眾多學(xué)者研究的不斷深入，指出其與乳腺癌、膀胱癌、胃癌等多種惡性腫瘤的發(fā)展具有密切關(guān)系[15]。lncRNA-UCA1作為一種致癌基因，可通過(guò)調(diào)控Wnt、AKT等多種通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，侵襲，并在此過(guò)程中逐漸生成VM，另有學(xué)者在研究肝癌中的lncRNA-UCA1表達(dá)時(shí)也同樣表明，lncRNA-UCA1可產(chǎn)生“海綿樣”作用，從而抑制miR-214的表達(dá)，升高Snail2蛋白活性，促進(jìn)肝癌中的內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化作用，與lncRNA-TUSC7功能類似[16]。通過(guò)分別分析lncRNA-TUSC7、lncRNA-UCA1與ESCC不同病理參數(shù)特征也同樣可以表明，以上兩種血清指標(biāo)均與臨床分期、分化程度、是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有密切聯(lián)系，其中臨床分期越高越有可能發(fā)生遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，疾病嚴(yán)重程度也越高，而分化程度越低提示細(xì)胞惡性程度越高，因此lncRNA-TUSC7可通過(guò)降低表達(dá)上調(diào)E-cadherin蛋白表達(dá)，并通過(guò)僅競(jìng)爭(zhēng)性調(diào)控EPHA4進(jìn)一步促進(jìn)ESCC細(xì)胞增殖、侵襲，而lncRNA-UCA1通過(guò)上調(diào)表達(dá)調(diào)控Wnt等通路促進(jìn)腫瘤增殖，兩者共同發(fā)揮調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用，進(jìn)一步促進(jìn)疾病發(fā)展，引起ESCC臨床病理參數(shù)發(fā)生變化[17-18]。

此外隨著lncRNA作為腫瘤標(biāo)志物的出現(xiàn)，其在機(jī)體的表達(dá)變化早于其他受體、蛋白，因此對(duì)多種腫瘤的早期診斷具有重要意義，本研究ROC曲線顯示，lncRNA-TUSC7、lncRNA-UCA1聯(lián)合檢測(cè)的AUC顯著高于單一檢測(cè)(Z=2.428，P<0.05)，且具有較高的靈敏度與特異度，說(shuō)明ESCC患者lncRNA-TUSC7、lncRNA-UCA1的表達(dá)對(duì)判斷VM生成及疾病發(fā)展具有顯著優(yōu)勢(shì)。但因本研究為小樣本，因此缺乏一定的臨床指導(dǎo)意義，因此可在下一步研究中進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，為lncRNA-TUSC7、lncRNA-UCA1指導(dǎo)ESCC診療提供更加嚴(yán)謹(jǐn)?shù)睦碚撘罁?jù)。

綜上所述lncRNA-TUSC7與ESCC發(fā)生VM呈負(fù)相關(guān)，且lncRNA-UCA1與ESCC發(fā)生VM呈正相關(guān)，聯(lián)合監(jiān)測(cè)能夠有效提高ESCC患者合并VM的檢出率，對(duì)早診斷、早預(yù)防奠定了有效的生物標(biāo)志物基礎(chǔ)，同時(shí)lncRNA-TUSC7、lncRNA-UCA1在ESCC合并VM患者中的特異性表達(dá)也為日后研發(fā)新的治療方式提供了潛在的靶點(diǎn)方向，在預(yù)防及治療方面均具有較為深遠(yuǎn)的影響。