蘇秀麗， 李惠敏， 唐 輝， 李良波, 劉寶玉

( 1. 廣西壯族自治區(qū)中國科學院 廣西植物研究所， 廣西 桂林 541006； 2. 廣西植物功能物質與資源持續(xù)利用重點實驗室， 廣西 桂林 541006； 3. 廣西師范大學珍稀瀕危動植物生態(tài)與環(huán)境保護教育部重點實驗室， 廣西 桂林 541006； 4. 廣西中醫(yī)藥大學 藥學院， 南寧 530200 )

植物內生真菌是指長期生活在健康植物體內，但在體內生活的這段時間不會引起宿主產生病害的一類真菌(隋麗等，2021)。藥用植物內生真菌具有良好的抗氧化活性、抑菌活性等，在農醫(yī)藥行業(yè)的活性產物開發(fā)中發(fā)揮重要作用。研究表明，鏈格孢屬、間座殼屬等內生真菌具有良好的抗氧化活性，殷娜等(2022)從藥用植物馬利筋中發(fā)現(xiàn)具有抗氧化活性的鏈格孢屬和間座殼屬內生真菌；程庭峰等(2021)從野生麻花艽的一株Cadophorasp.內生真菌Gs-6發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)槲皮素等黃酮類物質，DPPH清除自由基的IC50為0.039 9 mg?mL-1，具有較強的清除活性；寇曉琳等(2020)從青錢柳中發(fā)現(xiàn)3株能產生黃酮的鏈格孢屬真菌。此外，鐮刀菌屬、木霉屬等對病原菌具有良好的抑制作用，Zhao等(2020)研究發(fā)現(xiàn)1株內生真菌Seimatosporiumsp. M7SB 41能夠增強宿主植物抵抗薔薇白粉病的能力，降低感染薔薇白粉病的風險。Bucarei等(2019)將一種白僵菌(Beauveriabassiana)定殖在西紅柿和辣椒植株根部一段時間后發(fā)現(xiàn)，其能夠減輕由灰霉病菌(Botrytiscinerea)引起的灰霉病病害發(fā)生程度。此外，內生真菌燕麥鐮刀菌(Fusariumavenaceum)和木霉屬(Trichoderma)的康寧木霉(T.koningii)和深綠木霉(T.atroviride)對柑橘青霉病，煙曲霉(Aspergillusfumigatus)和黑曲霉(A.niger)具有良好的防治作用(郭東升等，2020；Erfandoust et al., 2020)。因此，從藥用植物內生真菌中獲得具有生物活性的次級代謝產物是可行的，藥用植物內生真菌次級代謝產物為天然產物的開發(fā)提供了強大動力。

黃花倒水蓮(Polygalafallax)，別稱黃花遠志，遠志科(Polygalaceae)遠志屬(Polygala)植物，是一種深受少數(shù)民族喜愛的藥用植物(翁穎妮等，2020)。其根部富含皂苷、黃酮、多糖類等物質，具有抗衰老、降血糖等多種生物活性(姚志仁等，2020；李根等，2022)。目前，雖然國內外已有許多有關黃花倒水蓮化學成分和藥理活性的研究，但未曾見到有關黃花倒水蓮內生真菌及其次級代謝產物生物活性的研究。有研究表明，從藥用植物遠志中分離得到的鏈格孢屬內生真菌不僅具有抑菌活性，而且能夠產生皂苷類物質、香豆素等抗氧化物質，具有重要的研究價值(王玉君等，2009；付建紅和熊東蘭，2013)。據(jù)此，我們提出黃花倒水蓮內生真菌也具有抗氧化活性、抑菌活性的推測。在內生真菌與宿主有著相似活性的基礎上，以黃花倒水蓮內生真菌為研究對象，以香蕉?；怄哏牭毒?Fusariunoxysporunf. sp.cubense)、香蕉具條葉斑病菌(Mycosphaerellafijiensis)、柑橘樹脂病菌(Diaporthecitri)、三七根腐病菌(Fusariumoxysporum)、茄病鐮刀菌(F.solani)、葉點霉菌為指示菌(Phyllostictazingiberi)，評價內生真菌的抑菌效果，并通過測定內生真菌發(fā)酵液DPPH清除自由基能力和總還原能力等指標，評價其抗氧化活性，為下一步從高活性菌株中篩選活性化合物奠定基礎，也為民族用藥黃花倒水蓮資源的綜合利用提供了另一條途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1供試菌株 供試21株黃花倒水蓮內生真菌：實驗室前期于2020年8—11月從廣西靈川、湖南永州、云南文山等地采集的野生黃花倒水蓮植株中分離得到。

供試植物病原真菌：香蕉?；怄哏牭毒?Fusariumoxysporumf. sp.cubense)、茄病鐮刀菌(F.solani)、三七根腐病菌(F.oxysporum)、香蕉具條葉斑病菌(Mycosphaerellafijiensis)、葉點霉菌(Phyllostictazingiberi)、柑橘樹脂病菌(Diaporthecitri)，由廣西大學農學院提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基和PDB培養(yǎng)基：購于北京暖溪匯智科技有限公司，前者100 mL的培養(yǎng)基中含有2 g馬鈴薯淀粉、0.6 g葡萄糖、2 g瓊脂；后者100 mL的培養(yǎng)基中含有2 g馬鈴薯淀粉、0.6 g葡萄糖。

1.2 方法

1.2.1 供試菌株抑菌活性測定 初篩和復篩過程均采用平板對峙法(楊帆等，2021)，區(qū)別在于初篩過程采用五點對峙法，復篩過程采用兩點對峙法。將對峙的PDA平板在光照培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)5～7 d后，測量對照組菌落的半徑(R)和實驗組病原真菌菌落朝內生真菌方向生長的半徑(r)，抑菌率取3次重復的平均值。抑菌率(%)=(R-r)/R×100

1.2.2 供試菌株液體發(fā)酵培養(yǎng) 將抑菌活性復篩的13株內生真菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 ～7 d后，用0.5 cm的無菌打孔器在菌落邊緣打取大小一致的菌塊，在含有100 mL PDB液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中加入菌塊3個，于25 ℃，140 r·min-1的恒溫搖床中進行培養(yǎng)15 d。培養(yǎng)結束后，利用抽濾的方法將菌絲體和發(fā)酵液分開，然后將獲得的發(fā)酵濾液依次用0.45、0.22 μm濾膜過濾，獲得無菌發(fā)酵濾液，保存于4 ℃冰箱備用。

1.2.3 供試菌株抗氧化活性測定 DPPH清除能力和總還原力是評價抗氧化活性的重要指標，參照前人的研究方法(宋新月等，2018；金宏杰等，2019)對1.2.2中的無菌發(fā)酵濾液進行DPPH清除能力和總還原力測定。

1.2.4 HNLF-44菌株的鑒定 采用透明膠帶法在萊卡顯微鏡下觀察HNLF-44菌株的菌絲體和孢子形態(tài)，根據(jù)真菌形態(tài)對照相關資料對菌株進行初步鑒定。分子鑒定則根據(jù)真菌ITS序列的保守性來進行，根據(jù)真菌DNA提取試劑盒說明書提取內生真菌HNLF-44的總DNA，以引物ITS1(序列為TCCGTAGGTGAACCTGCGG)和引物ITS4(序列為TCCTCCGCTTATTGATATGC)進行PCR擴增，用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物的純度，將PCR產物送到上海生物工程有限公司進行測序。對測序結果進行處理，然后將處理好的序列上傳到NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對，尋找與其相似性最高的菌株序列，下載與其相似性最高的幾組序列作為參考序列，利用MEGA7.0軟件進行序列對齊、鄰接法(neighbor-joining)構建HNLF-44菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹，在分支上顯示Bootstrap重復1 000次的數(shù)值。

2 結果與分析

2.1 供試菌株抑菌活性初篩測定

黃花倒水蓮供試菌株抑菌初篩結果如表1所示，供試菌株對6種植物病原真菌具有不同程度的拮抗作用(圖1)。從抑制的病原菌來看，HNLF-7、HNLF-26、HNLF-44、YNLF-32對香蕉專化尖孢鐮刀菌的抑制效果較強，其中HNLF-44對香蕉?；怄哏牭毒囊种菩Ч詈?，抑菌率為69.3%。除HNLF-9和LCRXY-26對柑橘樹脂病菌的抑菌率分別為49.1%和45.9%外，其余菌株的抑菌率均超過50.8%。HNBA-9對香蕉具條葉斑病菌抑制效果最強，抑菌率為69.1%。HNLF-44對三七根腐病菌具有58.9%的抑菌率。LCPH-5對茄病鐮刀菌抑制效果最好，抑菌率為59.0%。所有供試菌株均對葉點霉菌具有較強的抑菌效果，抑菌率均超過53.6%。綜上表明，HNLF-44對6種植物病原真菌都具有較強的抑菌活性，抑菌率均超過51.3%。

表 1 黃花倒水蓮內生真菌初篩抑菌率的測定Table 1 Determination of inhibition rate primary screening of endophytic fungi of Polygala fallax

A. 葉點霉菌; B. 茄病鐮刀菌; C. 柑橘樹脂病菌; D. 香蕉專化尖孢鐮刀菌。A. Phyllosticta zingiberi; B. Fusarium solani; C. Diaporthe citri; D. Fusarium oxysporum f. sp. cubense. 1. LCLF-7; 2. YNLF-32; 3. LCRXY-26; 4. HNLF-10; 5. HNLF-44; 6. LCSY-43; 7. LCPH-1; 8. LCSXY-9. 圖 1 供試菌株對病原真菌的抑菌作用Fig. 1 Antifungal activity of endophytic fungi isolated from Polygala fallax

其中，對葉點霉菌的抑制效果最強，為70.7%；其次是對香蕉轉化尖孢鐮刀菌，抑制率為69.3%；對茄病鐮刀菌的抑制效果較弱，抑菌率僅為51.3%。

2.2 內生真菌抑菌活性復篩測定結果

黃花倒水蓮供試菌株抑菌活性復篩結果如表2所示，HNLF-5、HNLF-44對6種植物病原真菌的抑制效果比較好，抑菌率在50.3%以上，其余菌株的抑菌效果較差。從抑制的病原菌來看，對香蕉專化尖孢鐮刀菌抑制效果最強的是HNLF-44(91.4%)(圖2)，其次是HNLF-5(54.0%)。HNLF-44對香蕉具條葉斑病菌的抑制效果最強(67.0%)，其次是HNLF-5(59.4%)。對柑橘樹脂病菌、葉點霉菌抑制效果最好的均為HNLF-5，抑菌率分別為73.2%和70.3%；其次是HNLF-44，抑菌率分別為67.7%和67.0%。HNLF-44對三七根腐病菌、茄病鐮刀菌的抑制效果最好，抑制能力均達到60.7%以上。

表 2 黃花倒水蓮內生真菌復篩抑菌率的測定Table 2 Determination of inhibition rate re-screening of endophytic fungi of Polygala fallax

A. 葉點霉菌; B. 香蕉具條葉斑病菌; C. 柑橘樹脂病菌; D. 香蕉專化尖孢鐮刀菌; E. 茄病鐮刀菌; F. 三七根腐病菌。A. Phyllosticta zingiberi; B. Mycosphaerella fijiensis; C. Diaporthe citri; D. Fusarium oxysporum f. sp. cubense; E. F. solani; F. F. oxysporum.圖 2 HNLF-44對6種植物病原真菌的影響Fig. 2 Effects of HNLF-44 on six phytopathogenic fungi

2.3 抗氧化活性分析

內生真菌發(fā)酵液的總還原能力測定結果如圖3所示，菌株HNLF-26、HNLF-44、HNLF-45、LCPH-9、LCSXY-43、LCRXY-26、LCBA-85、YNLF-32的發(fā)酵液還原力的吸光值均大于0.5，其余菌株發(fā)酵液的吸光值小于0.4?？傔€原能力強弱與吸光值大小成正比，由此可知，還原能力最強的菌株是LCBA-85，其次是YNLF-32。

圖 3 發(fā)酵液總還原力測定Fig. 3 Determination of total reducing power of fermentation broth

內生真菌發(fā)酵液清除DPPH自由基的結果如圖4所示，DPPH清除率都很高，除HNLF-7的清除率為86.90%外，其余菌株的清除率均達90%以上。DPPH清除率越大，抗氧化能力越強，表明供試內生真菌發(fā)酵液中含有清除DPPH自由基的物質，具有較強的抗氧化活性。

圖 4 發(fā)酵液DPPH清除能力測定Fig. 4 Determination of DPPH scavenging ability of fermentation broth

2.4 HNLF-44的鑒定

對香蕉?；怄哏牭毒哂袕娨志钚缘腍NLF-44菌株進行鑒定。HNLF-44菌株在PDA平板上生長緩慢，菌落邊緣不規(guī)則，表面有白色絨毛，菌絲上還附有少量的黃色水珠、菌絲易挑取(圖5:A)。菌落背面為黃色，產色素，在培養(yǎng)過程中可看到基質由透明色變?yōu)辄S色(圖5:B)。培養(yǎng)10 d后在顯微鏡下觀察可看到菌絲分支有隔，分生孢子呈淡黃色、倒棒狀，表面有橫隔和縱隔(圖5:C, D)，根據(jù)形態(tài)特點將其鑒定為鏈格孢屬真菌。HNLF-44菌株ITS序列經比對后發(fā)現(xiàn)，其ITS序列與Alternariaburnsii(NR136119.1)的相似性為100%，由系統(tǒng)發(fā)育樹圖6可知，HNLF-44菌株與NR136119.1聚在同一個分支上，且可信度為97，結合形態(tài)特點，將HNLF-44鑒定為鏈格孢屬真菌。

A. 菌落正面; B. 菌落背面; C. 菌絲體; D. 分生孢子。A. Colony front; B. Colony back; C. Mycelium; D. Conidium.圖 5 菌株HNLF-44的菌落及孢子形態(tài)Fig. 5 Morphological characteristics of HNLF-44 strain

3 討論與結論

植物體內具有生物活性的內生真菌是天然產物開發(fā)的重要來源，長期生活在藥用植物體內的內生真菌會趨于與宿主有一致的生物活性，因此藥用植物內生真菌是研究中的重點對象(侯曉強等，2015)。為此我們對黃花倒水蓮內生真菌的抗氧化活性和抑菌活性進行了研究，結果發(fā)現(xiàn)黃花倒水蓮內生真菌不僅具有抑菌活性還具有抗氧化活性，與丹參種子內生真菌具有抑菌活性、抗氧化活性的結果相似(劉玉嬌等，2020)，表明黃花倒水蓮內生真菌具有可開發(fā)利用的基礎。

鏈格孢屬內生真菌在拮抗病原菌方面具有良好的作用，能夠通過產生一些交鏈格孢酚、交替那吡酮等物質對生物產生毒害作用，是一種很好的生物資源(Puntscher et al., 2019)。本研究發(fā)現(xiàn)，黃花倒水蓮的1株鏈格孢屬內生真菌HNLF-44對香蕉?；怄哏牭毒?、柑橘樹脂病菌、葉點霉病菌等具有良好的拮抗活性，特別是對香蕉?；怄哏牭毒哂?1.4%的拮抗活性。這表明HNLF-44菌株在對峙培養(yǎng)的過程中可能產生了一些對植物病原真菌有害的如交鏈格孢酚等物質，進而抑制了病原真菌菌絲的生長。本研究結果與現(xiàn)有的鏈格孢屬內生真菌對植物病原真菌具有拮抗活性的研究結果基本一致，周兵等(2011)研究發(fā)現(xiàn)鏈格孢菌的發(fā)酵液產物對小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、煙草灰霉病菌(Botrytiscinerea)等植物病原真菌具有一定的抑制活性；翟鳳艷等(2011)認為茄鏈格孢菌毒素對小麥赤霉病菌和番茄煤污病菌(Cladosporiumfulvum)的菌絲生長和孢子萌發(fā)均具有抑制作用；陳思杰等(2022)發(fā)現(xiàn)Alternariaalternata的50%濃度發(fā)酵濾液對枸杞根腐病菌(Fusariumoxysporum)的分生孢子抑制率為91.48%，揮發(fā)性物質對菌絲生長的抑制率為94.10%；苗智等(2016)從夾竹桃中篩選到1株對白菜黑斑病菌(Cabbageshadinggerms)、番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)等8種病原菌具有抑制作用的鏈格孢屬真菌SPS-04，從其發(fā)酵產物中發(fā)現(xiàn)了交鏈孢酚的存在。此外，鏈格孢屬內生真菌還可以產生與宿主相同或相似的抗氧化活性物質，如黃酮類物質等。李姝諾等(2009)從越橘中發(fā)現(xiàn)了一株可以產黃酮化合物的細鏈格孢菌(Alternariatenuissima)；寇曉琳等(2020)從藥用植物青柳的內生真菌中發(fā)現(xiàn)了3株能夠產生的黃酮類物質的鏈格孢屬內生真菌。因此，我們認為鏈格孢屬真菌HNLF-44菌株具有抗氧化活性的原因可能是其在進行發(fā)酵培養(yǎng)的過程中產生了諸如黃酮類的抗氧化活性物質，這表明HNLF-44在與黃花倒水蓮長期共存的過程中可能獲得了產抗氧化活性物質的能力。因此，后續(xù)我們需要對HNLF-44的菌株的次級代謝產物進一步研究，找出其中的抗氧化和抑菌活性物質。

圖 6 基于ITS序列構建的HNLF-44菌株的系統(tǒng)進化樹Fig. 6 Phylogenetic tree of HNLF-44 strain constructed based on ITS sequence

綜上所述，本研究從黃花倒水蓮內生真菌中發(fā)現(xiàn)的一株鏈格孢屬HNLF-44菌株具有良好的抑菌、抗氧化活性，為后續(xù)從HNLF-44菌株中深入挖掘抑菌、抗氧化活性物質奠定了優(yōu)良基礎。