賈 凱， 劉 俊， 耿曉桐， 張耀洲， 肖 穎

( 信陽農(nóng)林學(xué)院 制藥工程學(xué)院， 河南 信陽464000 )

細(xì)葉十大功勞(Mahoniafortunei)系小檗科(Berberidaceae)十大功勞屬(MahoniaNutt.)常綠灌木，是一種常見的藥用植物，具有清熱解毒、滋陰強(qiáng)壯之功效(中國科學(xué)院《中國植物志》編委會，2001)，用于治療痢疾、腹瀉、咽炎、牙痛等?，F(xiàn)代藥理表明，該屬植物具有抗菌(蒲忠慧等，2016)、抗炎(Hu et al.，2016)及抗腫瘤(Wong et al.，2009)等生物活性，臨床上主要用于濕疹(Donsky & Clarke，2007)和牛皮癬(Janeczek et al.，2018)的治療?！吨袊幍洹?2020年版)收載的細(xì)葉十大功勞藥用部分為其干燥莖，有效成分主要為小檗堿、藥根堿、巴馬汀等生物堿(國家藥典委員會，2020)。研究表明該植物的葉同樣也含有此類成分(樊麗博等，2011；張耀洲等，2017)。目前，對于十大功勞總生物堿的化學(xué)研究多集中在含量測定(張耀洲等，2017；鐘南海，2019)、提取工藝(周先強(qiáng)等，2015；嚴(yán)志偉等，2015)方面，純化工藝研究多見于用一些色譜方法進(jìn)行單體的分離(崔澤旭等，2018)，而對于總生物堿有效部位的純化研究尚未見報道。據(jù)統(tǒng)計，我國2009—2018年獲得生產(chǎn)批準(zhǔn)的5 類中藥新藥共18項(xiàng)(張廣斌等，2021)，可見對中藥有效部位的開發(fā)已成為中藥創(chuàng)新藥物研發(fā)的重要方向。然而，為達(dá)到5 類中藥新藥有效部位含量必須高于50%的要求，建立適用于工業(yè)化生產(chǎn)的純化工藝就成為新藥研發(fā)成功與否的關(guān)鍵問題。在獲批生產(chǎn)的5 類中藥新藥中，應(yīng)用大孔樹脂純化工藝的占50%(張廣斌等，2021)，可見大孔樹脂純化技術(shù)已成為中藥有效部位純化的常用且有效手段。

另外，Hu等(2011)報道同屬植物闊葉十大功勞葉的水提物表現(xiàn)出良好的抗氧化活性，但未對抗氧化活性物質(zhì)基礎(chǔ)做進(jìn)一步研究，而功勞木生物堿類成分具有一定的抗氧化能力，且總生物堿抗氧化能力強(qiáng)于單體成分(朱姮等，2016)。為給工業(yè)生產(chǎn)上簡便、高效地獲得高純度、高活性的細(xì)葉十大功勞總生物堿提供參考，促進(jìn)細(xì)葉十大功勞葉部資源的開發(fā)利用，本研究以其葉中總生物堿有效部位為研究對象，采用大孔樹脂純化技術(shù)和DPPH抗氧化性能評價方法，通過比較6種不同極性大孔樹脂對總生物堿的吸附和解吸特性以及總生物堿純化前后的抗氧化活性變化，擬探討以下問題：(1)細(xì)葉十大功勞葉總生物堿有效部位大孔樹脂純化工藝參數(shù)的優(yōu)化；(2)細(xì)葉十大功勞葉總生物堿的體外抗氧化活性的初步評價。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：TU-1810型紫外-可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；AB135-S型電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；DKZ-1型恒溫振蕩水槽(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)。

試劑：D101、AB-8、ADS-3、DA201、NKA-9、LD605大孔樹脂(天津浩聚樹脂科技有限公司)；鹽酸小檗堿對照品(批號為HB03313，純度≥98%，供含量測定用，陜西華昱生物科技有限公司)；1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH，分析純，上海麥克林生化科技有限公司)；Vc(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；乙醇(分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠)；水為純化水。

鮮細(xì)葉十大功勞葉12月下旬采自信陽農(nóng)林學(xué)院校園內(nèi)，經(jīng)信陽農(nóng)林學(xué)院中藥資源與開發(fā)教研室梁利香副教授鑒定為小檗科十大功勞屬植物細(xì)葉十大功勞(Mahoniafortunei)。樣品處理：洗凈，陰干，除去葉柄，粉碎，過40目篩備用。

1.2 方法

1.2.1細(xì)葉十大功勞葉中總生物堿的含量測定 按照文獻(xiàn)方法測定(張耀洲等，2017)。以鹽酸小檗堿為對照品，測定波長為345 nm，采用紫外分光光度法測定總生物堿質(zhì)量濃度，鹽酸小檗堿線性回歸方程A=0.063 73C- 0.006 81(R2=0.999 9)。

1.2.2 上樣溶液及總生物堿粗品的制備 取細(xì)葉十大功勞葉粉末約100 g(過40目篩)，精密稱定，加8倍生藥體積的75%乙醇加熱回流提取3次，每次2 h。冷至40 ℃，濾過，濾液合并，減壓濃縮至無醇味，靜置過夜。過濾除去析出的黑色膠狀物質(zhì)，濾液加水定容至相當(dāng)于原生藥25倍體積(相當(dāng)于含生藥量40 mg·mL-1)，即得上樣溶液。依法可制得其他濃度的上樣溶液。按相同的提取方法，濾液經(jīng)濃縮、真空干燥至恒重，即得總生物堿粗品(純度13.33%)，置于干燥器中備用。

1.2.3 大孔吸附樹脂型號的選擇

1.2.3.1樹脂的預(yù)處理 分別取一定量的不同型號樹脂(D101、AB-8、ADS-3、DA201、NKA-9、LD605)置于95%乙醇中浸泡12 h，充分溶脹后，濕法裝柱，95%乙醇洗至流出液加適量水無白色渾濁出現(xiàn)，再用純化水洗至無乙醇味為止，備用。

1.2.3.2 不同樹脂的靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)和解吸實(shí)驗(yàn)考察 精密稱取上述已處理好的樹脂各1.0 g，分別置于100 mL錐形瓶中，加入上樣溶液20 mL(生藥濃度為40 mg·mL-1)，置恒溫振蕩水槽中振蕩吸附2 h(30 ℃，120 r·min-1)，然后靜置24 h。濾過，濾液經(jīng)適當(dāng)稀釋后測定吸光度計算出總生物堿質(zhì)量濃度，計算飽和吸附量和靜態(tài)吸附率。將抽濾后的樹脂吸干表面水分后分別轉(zhuǎn)移至100 mL錐形瓶中，加入95%乙醇30 mL，置恒溫振蕩水槽中振蕩解吸2 h(30 ℃，120 r·min-1)，然后靜置24 h。濾過，濾液經(jīng)適當(dāng)稀釋后測定吸光度計算出總生物堿質(zhì)量濃度，計算吸附率與解吸率。

1.2.3.3 不同樹脂的動態(tài)吸附、洗脫實(shí)驗(yàn)考察 分別將預(yù)處理過的D101、AB-8、LD605樹脂濕法裝柱(1.0 cm × 20 cm，裝柱量10 mL)。緩慢加入上樣溶液100 mL(生藥濃度為40 mg·mL-1)，控制流速為2 BV·h-1，收集流出液。將吸附后的各樹脂柱先后用純化水50 mL、80%乙醇100 mL洗脫，控制流速為2 BV·h-1，收集流出液。各流出液經(jīng)適當(dāng)稀釋后測定吸光度，計算出總生物堿質(zhì)量濃度、動態(tài)吸附率、動態(tài)解吸率。

1.2.4 AB-8大孔吸附樹脂純化總生物堿的工藝研究

1.2.4.1 上樣溶液濃度的確定 取預(yù)處理過的AB-8大孔吸附樹脂，濕法裝柱(1.0 cm × 20 cm，裝柱量10 mL)。將不同生藥濃度的十大功勞上樣液以2 BV·h-1的流速上樣，每2 BV為1個流分，經(jīng)適當(dāng)稀釋后測定各流分中的總生物堿質(zhì)量濃度，進(jìn)行不同上樣濃度對樹脂飽和吸附量的實(shí)驗(yàn)。

1.2.4.2 上樣流速和上樣量的確定 取相同質(zhì)量預(yù)處理過的AB-8大孔吸附樹脂，濕法裝柱(1.0 cm × 20 cm，裝柱量10 mL)。將上樣溶液(生藥濃度為50 mg·mL-1)以不同流速上樣，進(jìn)行不同上樣流速對樹脂飽和吸附量的實(shí)驗(yàn)。

1.2.4.3 洗脫雜質(zhì)用水量的確定 取預(yù)處理過的AB-8大孔吸附樹脂，濕法裝柱(1.0 cm × 20 cm，裝柱量10 mL)。將260 mL上樣溶液(生藥濃度為50 mg·mL-1)以2 BV·h-1流速上樣，吸附完全后，用水洗脫，每1 BV為1個流分，測定總生物堿質(zhì)量濃度，同時將每一流分濃縮干燥，稱其固形物質(zhì)量，以總生物堿在固形物中的含量高低確定洗脫雜質(zhì)用水量。

1.2.4.4 乙醇洗脫劑濃度及用量的確定 取4等份預(yù)處理過的AB-8大孔吸附樹脂，濕法裝柱(1.0 cm × 20 cm，裝柱量10 mL)。將260 mL上樣溶液(生藥濃度為50 mg·mL-1)以2 BV·h-1流速上樣，吸附完全后，用水洗脫3 BV后，分別用30%、40%、50%、60%乙醇洗脫，收集洗脫液，每1 BV為1個流分，繪制洗脫曲線。

1.2.4.5 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn) 取預(yù)處理過的AB-8大孔吸附樹脂，濕法裝柱(2.6 cm×30 cm，裝柱量100 mL)。將2.6 L上樣溶液(生藥濃度為50 mg·mL-1)以2 BV·h-1流速上樣，吸附完全后，用水洗脫3 BV后，再用50%乙醇洗脫4 BV，收集乙醇洗脫液，濃縮、干燥，測定總生物堿質(zhì)量濃度。重復(fù)3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 總生物堿抗氧化活性測定 采用常用的DPPH自由基清除法來評價總生物堿的抗氧化活性。參照文獻(xiàn)(李俠等，2018)方法并略作修改。精密稱取DPPH 10 mg，置250 mL容量瓶中，用95%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得1×10-4mol·L-1(40 μg·mL-1)的DPPH工作液。精密稱取“1.2.2”項(xiàng)中總生物堿粗品(黑綠色固體)、“1.2.4.5”項(xiàng)中總生物堿純化品(黃綠色固體)和陽性對照品VC各10 mg，置于100 mL容量瓶中，用95%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為100 μg·mL-1的各待測溶液。各待測溶液對半稀釋成5個濃度。實(shí)驗(yàn)組精密量取上述不同濃度的待測溶液2 mL與DPPH工作液2 mL置于10 mL具塞試管中，搖勻，室溫下暗處放置30 min。依相同的方法，以不同濃度的待測溶液與95%乙醇混合作為對照組，以95%乙醇與DPPH工作液混合作為空白組。以95%乙醇調(diào)零，測定各組在517 nm處的吸光度。每個濃度平行測定3次。依如下公式計算DPPH自由基清除率。

式中：A0為空白組的吸光度值；A1為實(shí)驗(yàn)組的吸光度值；A2為對照組的吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 總生物堿的含量測定結(jié)果

細(xì)葉十大功勞葉中總生物堿含量以鹽酸小檗堿計為4.16%。按標(biāo)準(zhǔn)曲線法求出上樣溶液中總生物堿質(zhì)量濃度為1.43 mg·mL-1(生藥濃度為40 mg·mL-1)、1.76 mg·mL-1(生藥濃度為50 mg·mL-1)。

2.2 大孔吸附樹脂型號篩選結(jié)果

2.2.1 不同樹脂的靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)和解吸實(shí)驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)十大功勞中生物堿的性質(zhì)及各種樹脂的性能，選取6種樹脂進(jìn)行考察，結(jié)果見表1。

從表1可以看出，D101、AB-8、LD605樹脂的吸附性能和解吸附性能都優(yōu)于ADS-3、DA201及NKA-9，因此需對這3種樹脂做進(jìn)一步考察，優(yōu)選出最佳型號的樹脂。

表 1 不同型號大孔樹脂對細(xì)葉十大功勞總生物堿的靜態(tài)吸附率和解吸率Table 1 Static adsorption and desorption rates of total alkaloids in Mahonia fortunei by different macroporous resins

2.2.2 不同樹脂的動態(tài)吸附、洗脫實(shí)驗(yàn)結(jié)果 對D101、AB-8、LD605這3種樹脂做動態(tài)吸附、洗脫實(shí)驗(yàn)考察，結(jié)果見表2。從表2可以看出，3種樹脂洗脫能力差別不大，經(jīng)水、乙醇洗脫后，95%左右的總生物堿都能被洗脫下來。但AB-8樹脂動態(tài)吸附能力要較LD605、D-101好，綜合考慮3種樹脂的動態(tài)吸附和洗脫能力，優(yōu)選AB-8大孔樹脂進(jìn)行細(xì)葉十大功勞提取液的純化工藝實(shí)驗(yàn)。

表 2 不同大孔型號樹脂對細(xì)葉十大功勞總生物堿的動態(tài)吸附率和解吸率Table 2 Dynamic adsorption and desorption rates of total alkaloids in Mahonia fortunei by different macroporous resins

2.3 AB-8大孔吸附樹脂純化總生物堿的工藝研究結(jié)果

2.3.1 上樣溶液濃度的確定 按“1.2.4.1”項(xiàng)的方法收集流分，并測定每流分中總生物堿質(zhì)量濃度，以其與上樣溶液總生物堿質(zhì)量濃度比值為縱坐標(biāo)，流出液體積為橫坐標(biāo)繪制不同上樣溶液濃度下的穿透曲線，并計算各濃度下的飽和吸附量，結(jié)果見圖1和圖2。從圖1和圖2可以看出，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著上樣液濃度增大，穿透時間提前，樹脂對總生物堿的飽和吸附量增大。當(dāng)上樣液濃度超過50 mg·mL-1生藥濃度后，樹脂吸附量略有所下降，可能由于高濃度上樣液中雜質(zhì)與總生物堿競爭吸附導(dǎo)致。另外，高濃度上樣液在靜置后易出現(xiàn)沉淀渾濁現(xiàn)象。綜合以上因素考慮，上樣溶液濃度確定為50 mg·mL-1生藥濃度。

圖 1 不同上樣液濃度下的穿透曲線Fig. 1 Breakthrough curves at different concentrations of sample solution

圖 2 不同上樣溶液濃度下的飽和吸附量Fig. 2 Saturated adsorption capacity at different concentrations of sample solution

2.3.2 上樣流速和上樣量的確定 上樣溶液(生藥濃度為50 mg·mL-1)以不同流速上樣，AB-8樹脂飽和吸附量分別為44.82 mg·mL-1(1 BV·h-1)、43.05 mg·mL-1(2 BV·h-1)、40.83 mg·mL-1(3 BV·h-1)、38.58 mg·mL-1(4 BV·h-1)?？梢钥闯?，流速越小，樹脂的飽和吸附量越大，越有利于生物堿的吸附。但流速過小，上樣時間長，吸附效率低?？紤]到不同流速下樹脂的飽和吸附量相差不大，為提高過柱效率，選擇流速為2 BV·h-1。經(jīng)計算，當(dāng)流速為2 BV·h-1，上樣量為26 BV時，上樣液濃度下降接近50%，樹脂吸附量為飽和吸附量的86.69%。因此，選擇上樣量為26 BV藥液。

2.3.3 洗脫雜質(zhì)用水量的確定 上樣溶液(生藥濃度為50 mg·mL-1)，上樣量26 BV，流速2 BV·h-1條件下，水洗結(jié)果見表3。從表3可以看出，當(dāng)洗脫用水量為3 BV時，固形物中總生物堿含量達(dá)到24.12%，總生物堿損失較大?？紤]到除雜目的及減少總生物堿損失，確定雜質(zhì)洗脫用水量為3 BV。

2.3.4 乙醇洗脫劑濃度及用量的確定 上樣溶液(生藥濃度為50 mg·mL-1)，上樣量26 BV，流速2 BV·h-1條件下，水洗3 BV后，醇洗結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，隨著乙醇洗脫劑濃度的增大，洗脫能力增強(qiáng)，生物堿集中出現(xiàn)在50%及60%乙醇洗脫液中，但60%乙醇洗脫較50%乙醇洗脫增加不明顯。50%乙醇在4 BV內(nèi)可將總生物堿的90%以上洗脫下來，故選擇50%乙醇作為洗脫劑，用量為4 BV。

表 3 不同體積水洗脫結(jié)果Table 3 Eluting results with different volumes of water

圖 3 不同濃度洗脫溶液下的洗脫曲線Fig. 3 Eluting curves at different elution solution concentrations

2.3.5 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 上樣溶液(生藥濃度為50 mg·mL-1)，上樣量26 BV，流速2 BV·h-1條件下，水洗3 BV后，50%乙醇洗4 BV，驗(yàn)證結(jié)果見表4。

表 4 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Confirmatory test result

2.3.6 總生物堿抗氧化活性 總生物堿抗氧化活性結(jié)果如圖4所示。從圖4可以看出，在測試濃度6.25～100 μg·mL-1范圍內(nèi)， 十大功勞總生物堿粗品、純化品及對照品Vc對DPPH自由基的清除率隨著濃度的增加而增加，其對DPPH自由基半抑制濃度IC50分別為55.28、39.08、10.39 μg·mL-1。說明不同純度的十大功勞總生物堿對DPPH自由基都具有一定的清除作用，且經(jīng)大孔樹脂純化后抗氧化能力有了較大提升，但在相同質(zhì)量濃度時都比對照品Vc低。

圖 4 DPPH自由基清除能力比較Fig. 4 Comparison of DPPH free radical scavenging ability

3 討論與結(jié)論

制備上樣溶液時，提取液濃縮后需靜置一段時間，待黑色膠狀物質(zhì)析出完全去除后再稀釋，否則上樣溶液在放置過程中會有黑色膠狀物質(zhì)析出，影響吸附效果。另外，上樣溶液濃度不宜過高，否則上樣溶液在靜置過程中會出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象，可能為細(xì)葉十大功勞總生物堿在水中溶解度較小所致。

不同類型的大孔樹脂對化合物的吸附及解吸能力不同，因此選擇適當(dāng)?shù)臉渲浅Ｖ匾?。?shí)驗(yàn)選取6種不同極性的大孔樹脂，對比其對總生物堿的靜態(tài)吸附和動態(tài)洗脫能力，結(jié)果顯示弱極性(如AB-8、LD605)及非極性(如D101)樹脂對細(xì)葉十大功勞總生物堿有較大的吸附量。結(jié)合洗脫能力的比較，最終選取AB-8大孔樹脂用于細(xì)葉十大功勞總生物堿的純化實(shí)驗(yàn)。這與文獻(xiàn)(劉麗梅等，2010；林葉新等，2013)報道的同樣含有鹽酸小檗堿的黃柏、黃連藥材總生物堿純化選取的大孔樹脂型號一致。AB-8大孔樹脂純化工藝為：上樣濃度為50 mg·mL-1生藥濃度，上樣量為26 BV，上樣流速為2 BV·h-1，3 BV水洗后經(jīng)4 BV 50%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，濃縮即得總生物堿。經(jīng)AB-8大孔樹脂純化后的總生物堿含量符合5 類中藥新藥有效部位含量應(yīng)高于50%的要求。

同細(xì)葉十大功勞藥用部位莖相似，生物堿也是葉中主要的有效成分。此類生物堿多為季銨型生物堿，如主要成分小檗堿、藥根堿等，具有廣泛的藥理活性。小檗堿既能抑制活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成，又可誘導(dǎo)抗氧化防御能力，又能使病變細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，具備理想抗氧化劑的潛質(zhì)(趙雪莉等，2019)。基于抗氧化劑在神經(jīng)退行性疾病的預(yù)防和治療方面的藥理作用，劉久石(2019)研究發(fā)現(xiàn)，含有大量小檗堿及其衍生物的功勞木藥材作為潛在治療神經(jīng)退行性疾病藥物具有重大潛力。本研究抗氧化活性表明，不同純度的十大功勞總生物堿均具有一定的抗氧化能力，且純化后的總生物堿抗氧化能力也有一定的提高。因此，在細(xì)葉十大功勞藥材的利用過程中，也應(yīng)注重對非藥用部位葉的開發(fā)和利用。

從細(xì)葉十大功勞葉中提取分離總生物堿，為充分利用該藥材非藥用部位資源提供可行性探索。AB-8大孔樹脂純化十大功勞總生物堿工藝條件簡單可行，純化效果好，工藝穩(wěn)定，可為細(xì)葉十大功勞總生物堿開發(fā)、制備及工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。