周 堅， 潘曉冉， 李小娟

(湖南省腦科醫(yī)院/湖南省第二人民醫(yī)院神經內科， 湖南 長沙 410000)

原發(fā)性中樞神經系統淋巴瘤(primary central nervous system lymphoma，PCNSL)是一種罕見的非霍奇金淋巴瘤，僅影響包括大腦、脊髓、軟腦膜和眼睛在內的中樞神經系統，占所有原發(fā)性顱內腫瘤的3-4%[1]。彌漫性大B細胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma,DLBCL)是PCNSL最常見的類型之一。與其他惡性中樞神經系統腫瘤相比，PCNSL對放療和化療更為敏感。但由于藥物難以穿過血腦屏障，所以目前尚無最佳的治療方法。此外，神經毒性、診斷和治療延誤導致復發(fā)，大多數PCNSL患者的預后仍然很差[2]。因此，尋找可靠的PCNSL診斷和治療標志物已成為當務之急。微小核糖核酸(microRNAs，miRNAs)是一種長度為21-23個核苷酸的非編碼RNA，通過與靶信使RNA特異結合，從而抑制轉錄后基因表達或者介導mRNA的降解。miRNAs參與多種生理和病理過程，例如細胞分化、增殖、細胞周期、炎癥和代謝[3]。此外，在包括PCNSL在內的許多癌癥中都觀察到了一些miRNAs表達失調[4]。研究報道m(xù)iRNA-34a與神經系統腫瘤有關。例如，過表達miR-34a抑制兒童神經母細胞瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力[5]。然而，miR-34a在PCNSL中的作用目前尚不清楚。性別決定區(qū)Y框蛋白4(sex-determining region Y-box 4，SOX4)是SOX轉錄因子家族的成員，參與多種生理過程。近來，SOX4由于與多種惡性腫瘤相關而受到了越來越多的關注。此外，研究還證實了SOX4過表達是癌癥患者的惡性預后因素，SOX4具有致癌基因的功能[6]。但SOX4在PCNSL中的具體功能尚未報道。因此，本研究將探討miR-34a與SOX4的關系以及在PCNSL中的作用，以期為PCNSL的治療和診斷提供新的靶點和生物標志物。

1 材料與方法

1.1材料:人Burkitt's淋巴瘤細胞Raji購自中國科學院細胞庫；Trizol試劑購自Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒和SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒均購自日本Takara公司；miRNA逆轉錄試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司；CCK-8試劑盒購自上海滬震實業(yè)有限公司；Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；miR-34a模擬物(miR-34a mimic)、模擬物對照(NC mimic)、miR-34a抑制劑(miR-34a inhibitor)、抑制劑對照(NC inhibitor)、SOX4過表達質粒(pcDNA-SOX4)、空白質粒(Vector)均購自上海吉瑪制藥技術有限公司；SOX4、Raf-1、p-Raf-1、MEK、p-MEK蛋白抗體均購自美國Abcam公司。FACSCalibur流式細胞儀購自美國BD公司；光學顯微鏡購自日本Olympus公司；酶標儀購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2方 法

1.2.1收集患者組織樣本：收集從2018年3月至2021年2月入住我院的80例PCNSL樣本(PCNSL組)和40例頸部淋巴結組織(Control組)，所有納入的PCNSL患者均通過經病理活檢確診。通過手術切除或活檢獲得樣本，并立即在液氮中冷凍。所有患者均簽署了知情同意書。本研究經我院倫理委員會批準。

1.2.2細胞培養(yǎng)與轉染：將Raji細胞在含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中置于5% CO2、37℃環(huán)境下的培養(yǎng)箱中孵育。將Raji細胞接種至96孔板中。24h后，按照廠家說明書，使用Lipofectamine 2000轉染試劑分別將miR-34a mimic、NC mimic、miR-34a inhibitor、NC inhibitor、pcDNA-SOX4、Vector轉染至細胞中。48h后收集細胞進行下一步研究。

1.2.3實時熒光定量PCR實驗(RT-qPCR)：使用TRIzol提取試劑盒從組織和細胞中提取總RNA。使用紫外分光光度計在260和280nm處測定光密度(OD)值和RNA濃度。OD260/OD280比值為1.8-2.0被用于后續(xù)實驗。用RT逆轉錄試劑盒或miRNA逆轉錄試劑盒將總RNA逆轉錄為cDNA。隨后，使用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒進行qPCR反應。反應條件為：95℃預變性5min，95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，循環(huán)40次。使用2-ΔΔCt方法定量mRNA和miRNA的表達水平，GAPDH和U6分別作為mRNA和miRNA的內參基因。

1.2.4Western blot：收集轉染后的細胞，在含蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液中裂解細胞。在4℃、14000 rpm離心10min后，收集上清液，使用BCA蛋白檢測試劑盒定量蛋白濃度。然后，在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳上分離20μg蛋白質，并轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用5%脫脂牛奶封閉以阻斷非特異性結合。然后在4℃下與一抗孵育過夜。用TBST洗滌膜3次，然后與辣根過氧化物酶(HRP)結合的二抗在室溫下孵育2h。最后利用增強型化學發(fā)光試劑對蛋白條帶進行可視化，分析條帶相對灰度值，以目標條帶與內參條帶灰度值的比值作為蛋白的相對表達量。

1.2.5CCK-8實驗：采用細胞計數試劑盒-8(CCK-8)法檢測Raji細胞增殖能力。將轉染后的細胞(5×104個細胞/孔)接種到96孔板中，在不同時間點(0h、24h、48h、72h)于每孔加入10μL CCK-8試劑，放入培養(yǎng)箱中再孵育4h。然后使用酶標儀測量波長為450nm處的吸光度值。

1.2.6克隆形成實驗：將轉染后的Raji細胞接種于6孔板中，每孔300個細胞。每3d更換一次培養(yǎng)液。培養(yǎng)10d后，當出現肉眼可見的克隆時，終止培養(yǎng)。隨后用甲醇固定細胞15min，再用結晶紫溶液染色30min并干燥。在顯微鏡下拍照并計數菌落數量。

1.2.7流式細胞術：使用Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒檢測Raji細胞凋亡率。收集轉染后的Raji細胞，用預冷PBS洗滌2次，隨后與5μL Annexin V-FITC和10μL 碘化丙啶(PI)染色液在室溫下避光孵育15min。然后，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，并使用Flowjo軟件分析數據。

1.2.8雙熒光素酶報告基因實驗：通過生物信息學軟件預測miR-34a和SOX4 mRNA之間的結合序列。為了驗證miR-34a和SOX4 mRNA的結合關系，設計含有與miR-34a結合位點的SOX4 3'UTR序列，并將其插入pmirGLO報告載體以構建野生型熒光素酶載體。通過突變miR-34a和SOX4 mRNA之間的結合序列從而構建突變型熒光素酶載體。將報告載體與 miR-34a mimic或NC mimic共轉染至細胞中。48h后，收集細胞，使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒測定細胞中的熒光素酶活性。

2 結 果

2.1miR-34a和SOX4在PCNSL組織中的表達:結果顯示，與Control組比較，PCNSL組織中miR-34a表達水平明顯降低，SOX4 mRNA和蛋白表達水平明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 miR-34a和SOX4在PCNSL組織中的表達注：與Control組比較，*P<0.05

2.2過表達或敲低miR-34a對PCNSL細胞增殖能力的影響:CCK-8實驗和克隆形成實驗結果顯示，與NC mimic組比較，miR-34a mimic組細胞中miR-34a表達顯著升高，細胞增殖能力顯著降低；與NC inhibitor組比較，miR-34a inhibitor組細胞中miR-34a表達顯著降低，細胞增殖能力顯著升高，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 過表達或敲低miR-34a對PCNSL細胞增殖能力的影響注：A-B.RT-qPCR檢測各組細胞中miR-34a的表達；C-D.CCK-8實驗檢測；E-F.克隆形成實驗。與NC mimic組、NC inhibitor組比較，*P<0.05

2.3過表達或敲低miR-34a對PCNSL細胞凋亡的影響:流式細胞術結果顯示，與NC mimic組比較，miR-34a mimic組細胞凋亡率顯著升高；與NC inhibitor組比較，miR-34a inhibitor組細胞凋亡率顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖3。

圖3 過表達或敲低miR-34a對PCNSL細胞凋亡的影響注：A.流式細胞術檢測過表達miR-34a對細胞凋亡率的影響；B.流式細胞術檢測敲低miR-34a對細胞凋亡率的影響。與NC mimic組、NC inhibitor組比較，*P<0.05

2.4miR-34a靶向并調控SOX4的表達:生物信息學軟件預測miR-34a與SOX4 3′UTR序列之間具有特殊的結合位點。雙熒光素酶報告基因結果顯示，與NC mimic組比較，共轉染miR-34a mimic和WT-SOX4的細胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)，而共轉染miR-34a mimic和MUT-SOX4的細胞熒光素酶活性無顯著性變化(P>0.05)。此外，與NC mimic組比較，miR-34a mimic組細胞中SOX4 mRNA和蛋白表達顯著降低；與NC inhibitor組比較，miR-34a inhibitor組細胞中SOX4 mRNA和蛋白水平顯著升高(P<0.05)，見圖4。

圖4 miR-34a靶向并調控SOX4的表達注：A.miR-34a與SOX4 3′UTR的結合位點；B.雙熒光素酶報告基因實驗；C.RT-qPCR檢測SOX4 mRNA的表達；D.Western blot檢測SOX4蛋白的表達。與NC mimic組比較，*P<0.05；與NC inhibitor組比較，#P<0.05

2.5miR-34a通過調控SOX4對PCNSL細胞增殖、凋亡的影響:結果顯示，與NC mimic組比較，miR-34a mimic組細胞中SOX4 mRNA表達顯著降低，細胞增殖能力和細胞活力均顯著降低，細胞凋亡率顯著升高；與miR-34a mimic+Vector組比較，miR-34a mimic+pcDNA-SOX4組細胞中SOX4 mRNA表達顯著升高，細胞增殖能力和細胞活力均顯著升高，細胞凋亡率顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖5。

圖5 miR-34a通過調控SOX4對PCNSL細胞增殖、凋亡的影響注：A.RT-qPCR檢測SOX4 mRNA的表達；B-C.CCK-8和克隆形成實驗檢測細胞增殖能力；D.流式細胞術檢測細胞凋亡率。與NC mimic組比較，*P<0.05；與miR-34a mimic+Vector組比較，#P<0.05

2.6miRNA-34a通過調控SOX4對RAS/MAPK信號通路蛋白的影響:結果顯示，與NC mimic組比較，miR-34a mimic組細胞中Ras、p-Raf-1、p-MEK蛋白表達顯著降低；與miR-34a mimic+Vector組比較，miR-34a mimic+pcDNA-SOX4組細胞中Ras、p-Raf-1、p-MEK蛋白表達顯著升高，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖6。

圖6 miR-34a通過調控SOX4對RAS/MAPK信號通路蛋白的影響注：與NC mimic組比較，*P<0.05；與miR-34a mimic+Vector組比較，#P<0.05

3 討 論

PCNSL是一種罕見的NHL，其臨床特征不具特異性，診斷困難。90%以上的PCNSL為彌漫性大B細胞淋巴瘤，預后較差。目前以大劑量甲氨蝶呤為基礎的化療作為一線治療，還沒有針對PCNSL的標準治療方法。因此，早期診斷對于PCNSL的治療和預后非常重要。

miRNAs在多種類型的癌癥中表達失調，并且miRNAs可能充當癌基因和腫瘤抑制基因，參與許多生物學過程，包括增殖、凋亡、轉移和化療耐藥[7]。因此，miRNAs可被用作癌癥診斷和預后的生物標志物。miR-34家族是一類高度保守的miRNA，包括三個同源基因，即miR-34a、miR-34b和miR-34c。其中，miR-34a是miR-34基因突變的結果，位于人類1p36染色體上。之前研究報道m(xù)iR-34a在胃癌、肝癌、頭頸部鱗狀細胞癌等多種惡性腫瘤中發(fā)揮抑癌功能[8,9]。本研究首次發(fā)現PCNSL組織中miR-34a的表達水平顯著降低。本研究進一步通過體外功能實驗發(fā)現，miR-34a過表達明顯抑制Raji細胞增殖，促進細胞凋亡。敲低miR-34a則促進細胞凋亡，抑制細胞凋亡。以上研究表明miR-34a可能是PCNSL的潛在腫瘤抑制因子。

miRNAs對細胞生物學行為的調控是基于其對下游靶基因的調控。SOX4是一種發(fā)育轉錄因子，在祖細胞的發(fā)育過程中起著重要作用。很多研究表明SOX4在多種惡性腫瘤中異常表達。然而，PCNSL中miR-34a和SOX4之間的關系尚不清楚。本研究使用生物信息學分析和雙熒光素酶報告基因實驗發(fā)現miR-34a靶向并負調控SOX4的表達。為了進一步確定SOX4是否參與miR-34a調控細胞增殖，本研究將miR-34a mimic與pcDNA-SOX4共轉染至Raji細胞。通過功能挽救實驗發(fā)現，SOX4過表達可顯著逆轉miR-34a mimic對Raji細胞增殖的抑制作用，以上研究結果表明miR-34a通過抑制SOX4調控Raji細胞增殖和凋亡。

為了探討miR-34a/SOX4軸在PCNSL中發(fā)揮作用的機制，進一步研究了其潛在的下游信號通路。MAPK也稱為細胞外信號調節(jié)激酶，參與多種細胞過程，如增殖、轉錄調節(jié)、分化和發(fā)育。已有研究表明，SOX4是MAPK信號通路的關鍵激活因子[10]。此外，研究還發(fā)現RAS/MAPK信號通路激活可能會增強PCNSL的致瘤性[11]。本研究發(fā)現，過表達miR-34a可顯著抑制Ras、p-Raf-1、p-MEK蛋白表達，而SOX4過表達可逆轉miR-34a對RAS/MAPK信號通路蛋白表達的抑制作用。以上結果提示過表達miR-34a靶向SOX4調控RAS/MAPK信號通路抑制Raji細胞增殖，促進細胞凋亡。

綜上所述，本研究發(fā)現miR-34a通過靶向SOX4抑制Raji細胞增殖能力，促進細胞凋亡，其機制可能與抑制RAS/MAPK信號通路有關，以上研究結果提示miR-34a可能是PCNSL臨床診斷或預后的潛在生物標志物。