尼魯帕爾·謝甫開提， 阿曼古麗·如則△， 唐婧， 趙翎， 趙幫豪， 高曉明，2△

基于蛋白質組學的缺血預適應心肌保護相關機理研究*

尼魯帕爾·謝甫開提1， 阿曼古麗·如則1△， 唐婧1， 趙翎1， 趙幫豪1， 高曉明1，2△

（1省部共建中亞高發(fā)病成因與防治國家重點實驗室，新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院心內科，新疆醫(yī)學動物模型研究重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830054；2新疆醫(yī)科大學臨床醫(yī)學研究院，新疆 烏魯木齊 830054）

缺血預適應（IPC）是強有力的對抗心肌缺血/再灌注（I/R）損傷的心肌保護措施，但其保護作用相關的機制仍不完全清楚。本研究旨在識別缺血預適應處理后小鼠心肌差異表達蛋白，為缺血預適應進一步的基礎及臨床研究提供新思路。用雄性成年C57BL/6小鼠建立心肌I/R損傷模型（缺血60 min/再灌注24 h）和IPC模型［3個（缺血5 min/再灌注5 min）循環(huán)的預適應+缺血60 min/再灌注24 h］，用伊文思藍和2，3，5-三苯基氯化四氮唑雙重染色的方法測量心肌梗死面積。提取各組心肌總蛋白，通過將串聯(lián)質譜標簽、高效液相色譜分級技術以及基于質譜的定量蛋白質組學技術相結合，以差異表達量變化>1.2倍作為顯著上調的閾值，<1/1.2作為顯著下調的閾值，篩選差異表達蛋白。對差異表達蛋白進行同源蛋白簇功能分類統(tǒng)計。分別用qPCR和Western blot技術對差異顯著的蛋白β-羥丁酸脫氫酶1（Bdh1）進行mRNA及蛋白水平上的驗證。與單純I/R組相比，IPC干預后心梗面積降低33%（0.05）。定量蛋白質組學結果顯示，與假手術組比較，I/R組表達下調的蛋白有91個，其中酮體氧化代謝關鍵酶Bdh1在下調蛋白中的表達倍數為0.708（<1/1.2）；與I/R組相比，IPC組表達上調的蛋白有14個，其中Bdh1差異表達倍數最高（1.95倍）。qPCR及Western blot驗證實驗表明，與假手術組相比，I/R組Bdh1的mRNA及蛋白水平明顯降低；IPC組Bdh1的mRNA及蛋白表達水平較I/R組明顯升高，進一步驗證了蛋白組學結果。I/R損傷顯著降低心肌Bdh1的mRNA及蛋白表達水平，而IPC處理顯著恢復了Bdh1的mRNA及蛋白表達，表明酮體氧化代謝可能參與了缺血預適應介導的缺血心肌的保護。

缺血預適應；缺血再灌注；蛋白質組學；β-羥丁酸脫氫酶1

缺血性心臟病（ischemic heart disease）是當今嚴重危害人類健康的主要疾病之一，為發(fā)達國家和發(fā)展中國家導致死亡的主要原因，可以引起心肌梗死、心力衰竭、心律失常及猝死等嚴重并發(fā)癥［1］。2019 年在《中國循環(huán)雜志》發(fā)表的一項研究報告顯示，2016年我國居民因心血管疾病死亡人數為397.5萬，較1990年增加了近150萬，其中缺血性心臟病增加了111.7萬［2］。對于心肌缺血性損傷，臨床上常采用各種方法及早恢復并重建血流，以便挽救缺血的心肌減少不可逆的心肌壞死。然而缺血心肌的血流突然恢復，往往會導致缺血/再灌注（ischemia/reperfusion， I/R）損傷，心肌I/R損傷可導致心肌頓抑，出現(xiàn)變性、壞死，細胞內無氧代謝加強，血漿中高密度脂蛋白增加［3］，無復流現(xiàn)象、致死性再灌注損傷以及再灌注性心律失常等反而降低了心肌再灌注的療效。因此，如何減輕心肌I/R損傷，保護心臟功能成為目前心血管基礎及臨床研究的重要導向及研究熱點。經過多年臨床及基礎研究探索出多種減輕心肌I/R損傷的措施，缺血預適應（ischemic preconditioning， IPC）就是其中一種。IPC是指在持續(xù)缺血前多次、反復、短暫的缺血/再灌注刺激對心肌產生一定保護效應的一種內源性保護措施［4-5］。Murry等［6］于1986年首次提出IPC的概念，他們在開胸實驗犬模型中發(fā)現(xiàn)持續(xù)缺血前幾個循環(huán)的短暫、間歇的冠脈阻斷與開放可以減輕因長時間缺血造成的心肌損傷以及顯著減小心梗面積達75%，IPC是通過增加心肌缺血損傷時的“損害閾值”，減小心肌梗死面積，從而保護心臟功能［7-9］。急性心肌梗塞事件是不可預測的，但IPC必須在缺血開始前實施，所以大多數IPC的臨床應用僅限于各種心血管外科手術，其中也存在老年患者心臟手術期間通過重復夾閉主動脈而使鈣化或動脈粥樣硬化斑塊脫落而導致中風的風險。因此，探索能夠模擬IPC保護而不產生不良反應的新靶點已成為現(xiàn)代心臟病學的挑戰(zhàn)［10］。本研究通過分析并驗證小鼠心肌IPC處理后的差異表達蛋白，從蛋白組學角度探索IPC對心肌的保護機制，為IPC的進一步研究以及臨床應用提供新的思路。

材料和方法

1　實驗動物

選擇10～12周齡、體重24～30 g的雄性C57BL/6小鼠作為研究對象，購自新疆醫(yī)科大學實驗動物中心，所有動物實驗程序均經新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準，符合實驗動物照料和使用原則（倫理委員會審批號：IACUC-20200318-95）。

2　主要試劑與儀器

RIPA裂解液和串聯(lián)質譜標簽（tandem mass tag， TMT）試劑盒（Thermo）；BCA蛋白定量試劑盒（碧云天）；蛋白電泳Marker（Fermentas）；氯仿（北京百泰克公司）；RNA提?。═RIzolTM）試劑和β-羥丁酸脫氫酶1（β-hydroxybutyrate dehydrogenase 1， Bdh1）抗體（Abcam）；GAPDH抗體（Cell Signaling Technology）；胰酶（Promega）；三氟乙酸（Sigma-Aldrich）。小動物687型呼吸機（Harvard），組織勻漿機（PRO Scientific）；數字化凝膠成像分析儀（Bio-Rad）；外科實體雙目顯微鏡（上海精密光學儀器公司）；凝膠電泳裝置（Bio-Rad）；7900實時熒光定量PCR儀（ABI）。

3　實驗方法

3.1實驗動物分組C57BL/6小鼠隨機分為3組：（1）假手術（sham）組：小鼠麻醉后打開胸腔隨即縫合，無任何特殊處理；（2）缺血/再灌注（I/R）組：缺血60 min，再灌注24 h；（3）缺血預適應（IPC）組：在60 min持續(xù)缺血及24 h再灌注之前，實施3個循環(huán)的5 min缺血，5 min再灌注；每組樣本量為20只，具體實驗條件見圖1。

Figure 1.　Schematic diagram of experiment. （5 min/5 min）×3 cycles： ischemia for 5 min and reperfusion for 5 min， 3 cycles in total.

3.2小鼠心肌缺血再灌注損傷及缺血預適應模型的建立采用我們前期已建立的在體小鼠I/R損傷及IPC保護模型［10］。（1）I/R模型建立：小鼠用4%～5%的異氟烷吸入進行誘導麻醉后，在1%～1.5%的流量下維持麻醉。在呼吸機輔助下，左側開胸暴露心臟（左心室前壁），在距離左心耳下緣2 mm處，用7-0無損傷絲線貫穿左前降支冠狀動脈的下方心肌層，在結扎線的兩端各穿入一個5-0絲線做成的松解環(huán)，然后用活節(jié)結扎冠狀動脈造成缺血，然后逐層關胸并復蘇小鼠。待實施缺血1 h后，在體外通過牽拉兩個松解環(huán)，松解結扎線實施再灌注24 h完成I/R模型的建立。（2）IPC+I/R模型建立：小鼠麻醉開胸后，采用7-0絲線貫穿左前降支冠狀動脈的下方心肌層，通過交叉兩端結扎線形成心肌對冠狀動脈的臨時擠壓造成5 min短暫缺血，然后解除交叉恢復血流灌注5 min，這樣重復3次（共30 min）完成IPC實施，之后進行1 h持續(xù)缺血及24 h再灌注（手術持續(xù)同前）完成IPC+I/R模型建立。

3.3心肌梗死面積測定24 h再灌注結束后，麻醉小鼠，開胸暴露心臟并行升主動脈遠端插管1 mm逆行灌注生理鹽水1 mL，沖洗心肌內的殘存血液。在原位結扎左前降支冠狀動脈。經主動緩慢推注5% Evans藍染料以藍染正常灌注的心肌并勾勒出主要位于左心室前壁的缺血心肌輪廓。隨后立刻取下心臟，生理鹽水沖洗干凈。顯微鏡下分離左心室并置于干冰上冷凍。從心尖到心底以1 mm的厚度持續(xù)切6～8片，浸入1%的TTC溶液中放置在37 ℃恒溫箱孵育45 min。染色后的心臟薄片夾壓于兩個載玻片中，數字成像。黑藍色區(qū)為正常心肌，蒼白色區(qū)為梗死區(qū)，紅色區(qū)為缺血但仍存活心肌。用ImageJ軟件測定左不同染色區(qū)域的面積分析心肌梗死范圍［10］。風險區(qū)域（area at risk，AAR）面積，以非藍染區(qū)占整個左心室切片的面積百分比表示。心肌梗死面積（infarct size，IS）以梗死區(qū)域（蒼白區(qū)）面積/缺血區(qū)域（紅色區(qū)+蒼白區(qū)）的百分比表示［10］。

3.4心肌差異表達蛋白的篩選另一組小鼠在24 h再灌注結束后，取出心臟，分離左心室，提取心肌總蛋白，利用BCA試劑盒進行蛋白濃度測定。蛋白通過胰酶酶解過夜，酶解的肽段用Strata X C18（Phenomenex）除鹽后真空冷凍干燥。以0.5 mol/L TEAB溶解肽段，根據TMT試劑盒操作說明標記肽段。肽段用高pH反向HPLC分級，隨之用液相色譜流動相A相溶解后使用EASY-nLC 1000超高效液相系統(tǒng)進行分離，再經由超高效液相系統(tǒng)分離后被注入NSI離子源中進行電離然后Q Exactive TM質譜進行分析，通過質譜定量分析檢測出肽段對應在每個樣本中的定量值。兩個不同樣本之間蛋白定量值取比值作為比較組差異表達量（Ratio）。計算該蛋白在兩個樣本中的差異表達顯著性值，首先將兩個樣本中蛋白對應特異性肽段的定量值取log2（以使得數據符合正態(tài)分布），然后用雙樣本雙尾檢驗方法計算值。當<0.05時，以差異表達量變化>1.2倍作為顯著上調的變化閾值，小于1/1.2倍作為顯著下調的變化閾值。基于鑒定到和定量到的關鍵蛋白質數據，對這些蛋白的功能、特征等，從基因本論（gene ontology， GO）、蛋白結構域、KEGG通路、同源蛋白簇（clusters of orthologous of proteins， COG/KOG）功能分類以及亞細胞結構定位等方面進行了詳細的注釋。

3.5實時熒光定量PCR檢測差異表達蛋白mRNA表達水平取24 h再灌注后的左心室，用TRIzol法提取心肌總RNA，紫外分光光度計測定其濃度和純度。按照逆轉錄試劑盒說明書將RNA反轉成cDNA，使用實時熒光定量PCR檢測試劑盒擴增基因片段，反應條件：95 ℃ 10 min； 95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，循環(huán)40次。以18S作為內參照，采用2-ΔΔCt法進行計算。其中所用引物：β-羥丁酸脫氫酶1（β-hydroxybutyrate dehydrogenase 1，Bdh1）上游引物為5’-TCTCGGACTGCCTGCGCTAT-3’，下游引物為5’-ACCGCTGTTGCAGTAGGTTT-3’； 18S上游引物為5’-TTGACGGAAGGGCACCACCAG-3’ ，下游引物為5’-GCACCACCACCCACGGAATCG-3’。

3.6Western blot 驗證差異表達蛋白水平取24 h再灌注后的左心室，提取心肌總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。100 ℃煮沸使蛋白變性。取40 μg蛋白提取液，室溫下SDS-PAGE分離蛋白。用濕轉法將蛋白電轉到PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉液中封閉1 h，0.1% TBST洗膜3次。隨后孵育相應Ⅰ抗，Bdh1（1∶1 000）及GAPDH（1∶2 000），4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次，孵育Ⅱ抗（1∶3 000）2 h，并進行堿性磷酸酶試劑顯色。用Image Lab 圖像分析系統(tǒng)對Western blot圖片進行分析，目的蛋白的表達采用其與內參照蛋白GAPDH條帶的灰度比值表示。

4　統(tǒng)計學處理

使用Graph Pad 7.0軟件統(tǒng)計數據，計量資料以均數±標準誤（mean±SEM）表示。兩組間比較用獨立樣本檢驗；多組間均數比較采用單因素方差分析或多因素方差分析，兩兩比較采用SNK-檢驗。以?0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1　I/R與IPC組心肌梗死面積比較

通過測量各組心肌梗死面積，發(fā)現(xiàn)在各組冠狀動脈結扎水平相當的前提下，即各組AAR之間沒有差別時，60 min缺血及24 h復灌造成45.3%左心室（LV）梗死。在I/R之前，實施3個循環(huán)5 min缺血5 min復灌的IPC措施后，心梗面積為30 %，較單純I/R損傷減少了33%（?0.05），證明IPC能夠顯著減小缺血再灌注損傷導致的心梗面積，見圖2。

Figure 2.　Infarct size measurement in ischemia/reperfusion （I/R） and ischemic preconditioning （IPC） groups. Representative left ventricular （LV） sections stained by Evans blue and TTC （the dark blue area is normal myocardium， the pale area is infarcted myocardium， and the red area is ischemic myocardium） were shown. Mean±SEM. n=7～9. *P<0.05 vs I/R group.

2　差異表達蛋白篩選及亞細胞結構定位

通過將TMT、高效液相色譜分級技術以及基于質譜的定量蛋白質組學技術相結合，以差異表達量變化>1.2倍作為顯著上調的變化閾值，<1/1.2作為顯著下調的變化閾值。其中，與sham組比較，I/R組上調的蛋白47個，下調的蛋白91個，其中Bdh1在下調蛋白中，表達倍數為0.708（<1/1.2，<0.05），差異表達蛋白火山圖見圖3A。與I/R組比較IPC組表達上調的蛋白14個，差異倍數最高的蛋白Bdh1（1.95倍，<0.05），表達下調的蛋白16個。上調與下調前10的蛋白見表1，差異表達蛋白火山圖見圖3A。針對差異蛋白的亞細胞結構定位預測和分類結果顯示，sham組與I/R組分類結果如圖3B所示，差異表達蛋白主要位于細胞質（28.3%）、細胞外基質（23.2%）和細胞核（23.2%）和線粒體（13.0%）等；I/R組與IPC組分類結果如圖3B所示，差異表達蛋白主要位于細胞質（43.3%）、細胞外基質（26.7%）、細胞核（10.0%）和線粒體（6.7%）等。

Figure 3.　Volcano plot and subcellular localization chart of differentially expressed proteins. A （I/R vs sham and IPC vs I/R）： the X-axis is the difference in multiple， the base number is 2， and the logarithm value is taken； the Y-axis is the P value， with 10 as the base， and the value of negative logarithm is taken. B （I/R vs sham and IPC vs I/R）： localization and distribution of subcellular structure.

表1　IPC與I/R組心肌上調、下調前10位的差異蛋白

3　差異表達蛋白的GO注釋及COG/KOG功能分類

通過GO數據庫對差異表達蛋白進行GO功能注釋，從生物學過程，細胞成分和分子功能三個不同角度進行分析（圖4A）。結果顯示，分子功能主要富集在NADPH結合、細胞黏附分子結合、ATP結合、硫醇依賴性泛素特異性蛋白酶活性、抗氧化活性、Bdh活性等；生物學過程主要富集在抗氧化調控、細胞代謝過程的正向調控、白細胞的激活調控、跨膜運輸調控等；細胞成分主要富集在細胞膜、細胞外區(qū)域、線粒體內膜等。為進一步分析數據中檢測和定量的蛋白質，我們對差異表達蛋白進行了COG/KOG功能分類統(tǒng)計，sham組與I/R組分類，見圖4B。I/R組與IPC組分類見圖4C。結果顯示，COG/KOG功能分布主要涉及能量生成和轉換、氨基酸轉運和代謝、翻譯后修飾、蛋白轉換、分子伴侶、信號傳導機制等。

Figure 4.　Distribution chart of differentially expressed proteins under GO and COG/KOG functional classification. A： classification and statistical results of biological processes， cell composition and molecular function between sham and I/R groups or between IPC and I/R groups. B（I/R vs sham） and C（IPC vs I/R）： the X axis is the letter number of COG classification， each letter represents COG classified individual biological function which is given in the legend； the Y-axis represents the number of differential proteins involved in the denoted biological functions.

眾所周知，生理狀態(tài)下的心臟主要依靠脂肪酸和葡萄糖的氧化代謝來提供能量。然而，在心肌梗死、心肌肥厚、心力衰竭等各種病理狀態(tài)下，心肌細胞內的脂肪酸和葡萄糖的代謝路徑出現(xiàn)障礙，心肌細胞能量供應不足，直接導致心肌不可逆壞死以及心臟的病理性重構。心臟重構往往伴隨著能量代謝的病理性重構，即脂肪酸和葡萄糖的氧化利用率明顯下降，而其他能量底物來補充心臟做功時所需的能量供應，包括酮體、乳酸及氨基酸等。其中，酮體氧化代謝在疾病心臟中的能量供給是近幾年來心臟代謝重構的研究熱點。特別地，本研究對sham，I/R及IPC組心臟差異表達蛋白的檢測及功能富集分析結果發(fā)現(xiàn)，與I/R組相比，IPC組酮體氧化代謝過程中的關鍵線粒體蛋白Bdh1顯著上調，差異表達倍數最高（1.95倍；?0.01），而與sham組相比，I/R組Bdh1的表達明顯下調，差異倍數為0.708（<1/1.2；?0.05）。此結果表明，發(fā)生I/R損傷時，Bdh1表達顯著降低，而在給予IPC處理后，Bdh1的表達明顯恢復。提示Bdh1可能是IPC介導的缺血心肌保護中的關鍵蛋白。因此，下一步實驗中，我們將對該分子進行mRNA及蛋白水平上表達的驗證。

4　差異表達蛋白mRNA及蛋白水平上的驗證

qPCR結果顯示，相比sham組，I/R組Bdh1 mRNA表達水平下調79%（<0.05）；而IPC組Bdh1 mRNA表達水平比I/R組上調75%（<0.05）。Western blot 檢測結果顯示，相比sham組，I/R組Bdh1蛋白表達水平降低43%（<0.05）；而IPC組Bdh1蛋白表達水平比I/R組升高25%（<0.05）。見圖5。

Figure 5.　The mRNA （A） and protein （B） expression of Bdh1 in sham， I/R and IPC groups. Mean±SEM. n=2～5. *P<0.05 vs sham group； ?P<0.05 vs I/R group.

討論

本研究通過將串聯(lián)質譜標記、高效液相色譜分級技術以及基于質譜的定量蛋白質組學技術相結合，篩選了假手術組、心肌I/R損傷和IPC處理后的小鼠心肌差異表達蛋白，并用qPCR和Western blot驗證了目標差異表達蛋白Bdh1的 mRNA及蛋白水平的變化差異。

IPC保護功效已在實驗動物包括鼠、兔、狗、豬等哺乳動物以及病人群體得到了驗證，其可有效減少心肌缺血所致心肌梗死范圍，降低室性心律失常發(fā)生頻率及嚴重程度并能夠改善缺血后左心室功能，是如今已經證實的強有力的內源性保護機制［11］。因此，近十年來引起了研究人員極大的興趣，針對其保護作用機制的研究已成為心肌保護領域的一個熱點。隨著最初的IPC保護的發(fā)現(xiàn)，臨床應用的關注點在直接施加缺血于心臟或間接作用于其它相關臟器所產生的潛在風險，應運而生的是廣泛探索藥理性誘發(fā)IPC保護。迄今為止基礎研究已經發(fā)現(xiàn)了許多藥理性因素具有誘發(fā)IPC保護的能力。這些藥理性因子，具有相當的臨床相關性［10-12］；后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)，在應用上述藥理性因子所產生的保護未能完全達到直接施加IPC所產生的減少心梗面積的最大效果，這一現(xiàn)象說明其它分子機制介入IPC保護的可能性。

在用蛋白組學研究檢測到的差異蛋白中，我們關注Bdh1的原因諸多，首先與I/R組相比，IPC組心臟組織中該蛋白的差異表達倍數最高（1.95倍），qPCR與Western blot結果也證實，Bdh1在IPC干預后明顯增高。其次，Bdh1是一種線粒體蛋白，在肝臟通過脂肪酸氧化的乙酰輔酶A合成，參與酮體底物 β-羥丁酸與乙酰乙酸的轉化，為酮體的生成和利用過程中的關鍵氧化還原酶［13-14］。酮體作為重要的補充功能物質，為能量缺乏的衰竭心臟提供能量［15］。研究表明，小鼠心衰早期階段，心臟組織中的酮體氧化代謝關鍵酶Bdh1表達顯著升高。相應地，琥珀酸、乙酰肉堿及羥丁酸?；鈮A等酮體代謝衍生產物含量也隨之升高［14］，提示在心衰早期，心臟可能是借助酮體的分解代謝來代償心肌收縮及舒張時所需的能量。除此之外，近年來的多項研究發(fā)現(xiàn)，酮體氧化代謝通過減輕心肌細胞的氧化應激反應、阻斷活性氧的過度生成和堆積、改善線粒體功能等過程，促進心肌ATP合成效率，從而減輕心肌梗死及心肌缺血再灌注損傷對心臟造成的損傷［16］，提示酮體代謝也可能參與心肌缺血時的能量供給。此外，心臟特異性Bdh1過表達會使小鼠心肌酮體利用率增加，減輕主動脈縮窄誘導的心肌纖維化及氧化損傷程度、改善心肌收縮功能［15， 17］。這些結果提示能量缺乏的心臟依靠酮體作為其主要的替代能源的重要性。

綜上所述，我們的蛋白組學篩選及驗證結果證明IPC抑制了心肌因缺血再灌注損傷導致的酮體氧化代謝關鍵酶Bdh1的表達下調及降解破壞，提示酮體氧化代謝可能參與缺血預適應介導的缺血心肌的保護。當然，這一假設需要更深入縝密的研究來證明，我們在后續(xù)的實驗中，將在在體動物模型中利用基因干預小鼠進一步驗證Bdh1在IPC中對心肌的保護作用及分子機制，探討其能否成為缺血心肌保護藥物研發(fā)的作用靶點，為其臨床應用提供新思路。

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Proteomic-based study to explore cardioprotective mechanism of ischemic preconditioning in mice

XIEFUKAITI Nilupaer1， RUZE Amanguli1△， TANG Jing1， ZHAO Ling1， ZHAO Banghao1， GAO Xiaoming1，2△

（1，，，，，830054，；2，830054，）

Ischemic preconditioning （IPC） is an endogenous protection strategy against myocardial ischemia/reperfusion （I/R） injury， but the mechanism related to its protective effect is still unclear. The purpose of this study is to identify the myocardial differentially expressed proteins after IPC and provide a new idea for further basic and clinical studies of IPC.Male adult C57BL/6 mice were used to establish myocardial I/R injury （ischemia for 60 min and reperfision for 24 h） and IPC （3 cycles of ischemia for 5 min and reperfusion for 5 min， plus ischemia for 60 min and reperfision for 24 h） models. The myocardial infarct size was measured by Evans blue and 2，3，5-triphenyltetrazolium chloride double staining. Tandem mass tag， high-performance liquid chromatography and mass spectrometry based quantitative proteomics were conducted to screen the differentially expressed proteins. The threshold to determine significantly up- or down-regulated proteins was defined as the expression level of proteins more than 1.2-fold or less than 1/1.2-fold between groups. The differentially expressed proteins were classified into clusters of orthologous proteins for functional analysis. Real-time quantitative PCR and Western blot were used to verify identified proteins.Compared with I/R group， IPC intervention significantly reduced the infarct size by 33% （<0.05）. Quantitative proteomics results showed that 91 proteins were down-regulated in I/R group compared with sham group， among which β-hydroxybutyrate dehydrogenase 1 （Bdh1）， a key enzyme of ketone body oxidative metabolism， had 0.708-fold decreased expression （<1/1.2-fold）. Fourteen proteins were up-regulated in IPC group compared with I/R group， among which Bdh1 had the highest expression （1.95-fold）. The qPCR and Western blot results showed that Bdh1 mRNA and protein expression levels were significantly lower in I/R group compared with sham group， and were significantly higher in IPC group compared with I/R group， further validating the proteomic results.The I/R injury significantly reduced Bdh1 expression， while IPC significantly restored the mRNA and protein expression of Bdh1 in the myocardium. Ketone body oxidation may be involved in IPC-mediated protection of ischemic myocardium.

ischemic preconditioning； ischemia/reperfusion； proteomics； β-hydroxybutyrate dehydrogenase 1

R541.4； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2023.02.003

1000-4718（2023）02-0212-08

2022-09-05

2022-12-22

［基金項目］國家自然科學基金資助項目（No. 82060073； No. 81870272）；省部共建中亞高發(fā)病成因與防治國家重點實驗室開放課題項目（No. SKL-HIDCA-2020-46； No. SKL-HIDCA-2021-XXG1）；新疆重點實驗室開放課題項目（No. 2020D04027； No. 2021D04020）

高曉明 Tel： 15899267691； E-mail： xiaominggao2017@163.com； 阿曼古麗·如則 Tel： 18599084656； E-mail： P4919627@xjmu.edu.cn

（責任編輯：余小慧，李淑媛）