張銘， 吳天宇， 劉小碣， 張妍， 何曉宇， 劉賽賽， 趙士弟，，陳莉秋， 陳傳好， 張小楠，△

甘草附子湯加減方通過抑制GSDMD介導的焦亡治療CIA大鼠的作用機制研究*

張銘1，2， 吳天宇3， 劉小碣1， 張妍4， 何曉宇1， 劉賽賽5， 趙士弟1，5，陳莉秋6， 陳傳好2△， 張小楠1，5△

（1蚌埠醫(yī)學院心腦血管疾病基礎與臨床重點實驗室，2蚌埠醫(yī)學院人體解剖學教研室，3蚌埠醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院，4蚌埠醫(yī)學院臨床醫(yī)學院，5蚌埠醫(yī)學院病理生理學教研室，6蚌埠醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院中醫(yī)科，安徽 蚌埠 233030）

探討甘草附子湯加減方（GCFZD）抑制gasdermin D （GSDMD）介導細胞焦亡途徑對膠原誘導性關節(jié)炎（CIA）大鼠的治療效果。SD大鼠尾跟部注射由牛Ⅱ型膠原與弗氏佐劑混合形成的乳化劑，構(gòu)建CIA大鼠模型并對其關節(jié)炎指數(shù)進行評估，將成功誘發(fā)關節(jié)炎的30只雄性SD大鼠隨機分為模型組、甘草附子湯低（4 g/kg）、中（8 g/kg）和高（16 g/kg）劑量組及甲氨蝶呤（1 mg/kg）組，每組6只，連續(xù)給藥30 d。測定大鼠的體重、關節(jié)炎指數(shù)和足爪腫脹指數(shù)；X線影像學觀察骨質(zhì)破壞和軟組織厚度改變；HE染色觀察脾臟和關節(jié)組織病理學改變；番紅O-固綠染色觀察關節(jié)軟骨改變；TUNEL染色觀察關節(jié)內(nèi)細胞焦亡發(fā)生情況；Western blot測定TLR4、caspase-1、NLRP3和GSDMD蛋白表達；real-time PCR和ELISA測定IL-1β、IL-6和IL-10細胞因子表達。與模型組相比，GCFZD治療顯著改善CIA大鼠軟組織腫脹和骨質(zhì)破壞，降低脾臟和胸腺指數(shù)；HE染色結(jié)果顯示，GCFZD治療減輕CIA大鼠脾臟和踝關節(jié)組織病理學改變；番紅O-固綠染色結(jié)果顯示，GCFZD治療減少軟骨組織破壞，修復軟骨結(jié)構(gòu)；TUNEL染色結(jié)果顯示，GCFZD顯著抑制關節(jié)組織內(nèi)的細胞焦亡；Western blot結(jié)果表明，GCFZD降低CIA大鼠脾臟中TLR4、cleaved caspase-1、NLRP3和GSDMD-N的蛋白表達；real-time PCR和ELISA結(jié)果顯示，GCFZD減少CIA大鼠IL-1β和IL-6的mRNA和蛋白水平的表達，上調(diào)IL-10的mRNA和蛋白水平的表達。GCFZD能夠抑制GSDMD介導的細胞焦亡，減少IL-1β和IL-6分泌，促進IL-10分泌，有效減輕CIA大鼠的類風濕關節(jié)炎癥狀。

甘草附子湯；類風濕關節(jié)炎；gasdermin D；細胞焦亡

類風濕關節(jié)炎（rheumatoid arthritis， RA）是一種慢性自身免疫性疾病，以關節(jié)骨質(zhì)破壞和侵蝕性滑膜炎癥為主要病理特征，致殘率高且預后較差，尚缺乏有效防治措施［1］。RA臨床藥物治療常通過免疫抑制劑與非甾體藥物的聯(lián)合應用緩解患者病情，但常規(guī)藥物治療導致的治療耐受和毒副作用致使其臨床應用受限［2］。因此，探索RA治療新途徑尤為重要。

甘草附子湯源于張仲景的《傷寒論》，包含甘草、附子、白術(shù)和桂枝四種中藥，制附子補火助陽、逐風驅(qū)濕；桂枝助陽化氣、溫經(jīng)散寒；白術(shù)除濕益燥、健脾益氣；甘草通血利痹、調(diào)和諸藥，全方共奏除濕祛風、溫經(jīng)散寒之效，能夠有效緩解關節(jié)腫脹、疼痛、僵直等癥狀，臨床已有報道其對RA具有較好治療效果［3-4］，本研究前期根據(jù)臨床患者實際癥狀和兼癥，在原方劑的基礎上加入了知母、白芍、威靈仙、雞血藤、木瓜和伸筋草等六味中藥，臨床治療效果較好，但其具體機制不明。細胞焦亡是一種由Gasdermin D（GSDMD）蛋白介導的溶解性細胞程序性死亡，研究表明，依賴GSDMD誘導的細胞焦亡途徑與RA滑膜炎癥的發(fā)生密切相關，通過抑制GSDMD的表達有助于緩解RA［5-6］。已有研究證明甘草附子湯能夠通過抑制滑膜成纖維細胞增殖、炎癥因子分泌等減輕RA疾病活動度［7-8］，但從細胞焦亡層面探究GCFZD的藥效學機制尚缺乏文獻報道。因此，本研究對CIA模型大鼠給予不同劑量的GCFZD處理后，通過檢測TLR4、caspase-1、NLRP3、GSDMD等焦亡相關蛋白的表達水平，首次探討了GCFZD是否能夠抑制GSDMD誘導的焦亡途徑對CIA大鼠起到治療作用，旨在進一步探究GCFZD治療RA的作用機制，為RA治療方法的創(chuàng)新發(fā)展提供理論依據(jù)。

材料和方法

1　實驗動物

雄性SD大鼠45只，5～6周，體重（200±20） g，購自安徽醫(yī)科大學，飼養(yǎng)于SPF環(huán)境，保證充足食物與飲水，保持12 h光照周期。動物實驗開始前，經(jīng)過6～7 d適應飼養(yǎng)環(huán)境，動物方案經(jīng)過蚌埠醫(yī)學院動物實驗中心倫理委員會的批準。

2　主要試劑

牛Ⅱ型膠原和完全弗氏佐劑（貨號20022、貨號7009，chondrex）；甲氨蝶呤（國藥準字H31020644，上海上藥信誼藥廠有限公司）；異氟烷（R510-22，RWD）；4%多聚甲醛通用型組織固定液、RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑和BCA蛋白濃度測定試劑盒（貨號BL359A、BL504A、BL612A、BL521A，biosharp）；兔抗β-Actin和兔抗GSDMD抗體（貨號WX766117、A20728，ABclonal）；兔抗cleaved caspase-1、兔抗GSDMD N-Terminal抗體（貨號AF4005、DF13758，Affinity）；鼠抗TLR4（貨號sc-293072，SANTA）；兔抗caspase-1、兔抗NLRP3、HRP-羊抗兔IgG、HRP-羊抗小鼠IgG（貨號BA2220、A00034、BA1054、BA1050，BOSTER）；Trizol（貨號：15596026，ambion）；FastKing RT Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SuperReal PreMix Plus 試劑盒（貨號KR116、FP205，TIANGEN）；大鼠白細胞介素-1β （interleukin-1β，IL-1β）ELISA試劑盒、大鼠IL-6 ELISA試劑盒和大鼠IL-10 ELISA試劑盒（貨號JM-01454R2、JM-01597R2、JM-01602R2，江蘇晶美生物科技）；TUNEL試劑盒（貨號G1501，武漢賽維爾生物科技有限公司）。

3　主要方法

3.1甘草附子湯制備制附子（15 g）、桂枝（10 g）、甘草（9 g）、知母（12 g）、白芍（20 g）、威靈仙（12 g）、雞血藤（20 g）、白術(shù)（15 g）、木瓜（12 g）和伸筋草（20 g）購自山東。按照2020版《中華人民共和國藥典》制備甘草附子湯，藥材提前浸入20倍量水浸泡，武火煎煮1次，轉(zhuǎn)文火蒸煮至藥液至300 mL，取出后濾過，放入4 ℃冰箱備用。

3.2大鼠CIA模型構(gòu)建膠原誘導性關節(jié)炎（CIA）大鼠模型的建立在課題組前期經(jīng)驗及參考文獻中的方法優(yōu)化進行［9］。步驟簡述如下：動物實驗開始前，經(jīng)過6～7 d適應飼養(yǎng)環(huán)境，取弗氏不完全佐劑1∶1分次滴加至2 g/L牛II型膠原中，使用沃信手持式勻漿機冰上配制乳化液；配置的 2 g/L的牛Ⅱ型膠原-弗氏佐劑乳化液，在大鼠尾根前1 cm處采用皮內(nèi)注射，針斜面朝上平行進針，初次免疫劑量200 μL，7 d后進行加強免疫，每只SD大鼠注射乳化劑量100 μL，加強免疫5～8 d后，出現(xiàn)關節(jié)紅腫，關節(jié)炎評分、足爪 X-ray、大體照片、足跖厚度證明成模。

3.3實驗分組和藥物治療從初始免疫后第15天開始，每隔3 d對大鼠關節(jié)炎指數(shù)（arthritis index，AI）評分，實驗組大鼠AI>4 分，認定為關節(jié)炎誘導成功，分入實驗組；按照隨機分組原則，每組6只，分為正常（vehicle）組，模型組（CIA），甘草附子湯低（GCFZD-L）、中（GCFZD-M）、高劑量組（GCFZD-H）和MTX組，各組連續(xù)灌胃給藥30 d。甘草附子湯低、中、高劑量組給藥量分別為4、8和16 g/kg ；MTX組給藥量為1 mg/kg，每周1次；正常組和模型組給予2 mL的PBS溶液。

3.4關節(jié)炎指數(shù)評估根據(jù)大鼠關節(jié)紅腫程度、范圍及關節(jié)腫大、變形情況，采用五級評分法進行關節(jié)炎指數(shù)評分，每個關節(jié)的炎癥最高分為4分，4個關節(jié)炎癥的總和最高為16分（0分，無關節(jié)炎；1分，個別足趾發(fā)紅、腫脹；2分，大部分足趾及足底腫脹；3分，踝關節(jié)及以下腫脹；4分，腫脹累及踝關節(jié)以上且不能負重）。

3.5胸腺和脾指數(shù)評估大鼠脫頸處死后，剝離胸腺和脾臟，無菌PBS清洗組織血液，無菌吸水紙吸去多余水分，分別稱量胸腺和脾臟重量，其與大鼠體重比值即為胸腺和脾臟指數(shù)。

3.6X線影像學評估處死前3 d，異氟烷麻醉大鼠，固定大鼠四肢，使用數(shù)字診斷DR系統(tǒng)（飛利浦醫(yī)療），對CIA大鼠后肢軟組織腫脹情況及骨質(zhì)情況進行數(shù)字放射成像檢查。

3.7酶聯(lián)免疫吸附試驗異氟烷麻醉大鼠后，將SD大鼠置于仰臥位，固定四肢，用無菌剪刀剪開腹部皮膚，無菌鑷撥開腸組織，暴露腹后壁，使用玻璃分針分開腹主靜脈和腹主動脈，刺入腹主動脈后接入無菌采血管采血。血液室溫放置20～30 min后，低溫離心機4 ℃，3 000 r/min，離心10 min，取得血清。按照說明書，用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（江蘇晶美）檢測CIA大鼠血清中IL-1β、IL-6和IL-10的表達水平。

3.8組織病理學染色脾組織和關節(jié)滑膜組織在4%多聚甲醛中固定后，關節(jié)脫鈣后與脾組織進行脫水和包埋處理。切片5 μm厚，蘇木精伊紅（H&E）染色、番紅固綠染色及TUNEL染色。對脾組織切片進行外周動脈淋巴鞘密度、淋巴結(jié)節(jié)增生、邊緣帶增生和紅髓等參數(shù)的評估；對踝關節(jié)的滑膜組織、炎細胞浸潤、軟骨破壞、骨質(zhì)侵蝕、血管翳形成和滑膜增生等變化進行評估；通過TUNEL染色陽性率對關節(jié)組織中是否發(fā)生細胞焦亡進行評估。公式：TUNEL陽性率（%）=TUNEL染色陽性細胞數(shù)/Hoechst陽性細胞數(shù)×100%。

3.9real-time PCR在盛放組織的無菌EP管中加入Trizol裂解液，采用超微量組織研磨機充分研磨組織，按照5∶1加入氯仿充分震蕩，低溫12 000 r/min×15 min，取上清后等比例加入異丙醇，顛倒混勻后低溫12 000 r/min×10 min，棄上清后加入75%乙醇低溫7 500 r/min×5 min洗滌兩次，加入無水乙醇低溫7 500 r/min×5 min洗滌兩次，無菌吸水紙吸干多余液體，加入DEPC水溶解。按照FastKing RT Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒要求操作合成cDNA，以cDNA 為模板，按照SuperReal PreMix Plus試劑盒要求操作加樣，試驗所用引物均由安徽華曉基因科技有限公司合成，引物序列信息見表1。選擇β-actin作為內(nèi)參照，用相對定量（2-ΔΔCt）法計算目的基因的相對表達量。

表1　real-time PCR引物序列

F： forward； R： reverse.

3.10Western blot提取各組大鼠脾臟組織蛋白，使用BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度，上樣后120 V電泳1.5 h，200 mA轉(zhuǎn)膜2 h，5%脫脂牛奶封閉2 h，Ⅰ抗（均1∶1 000；TLR4抗體， Santa Cruz； NLRP3和caspase-1抗體，Boster；cleaved caspase-1和GSDMD N-Terminal抗體，Affinity； GSDMD抗體， ABclonal）4 °C搖床孵育過夜，Ⅱ抗室溫封閉2 h，使用超敏ECL化學發(fā)光底物在凝膠成像系統(tǒng)曝光，采集曝光圖像并使用ImageJ軟件分析灰度值。

4　統(tǒng)計學處理

采用SPSS 21.0分析數(shù)據(jù)，以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析及LSD-檢驗。以<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1　大鼠的一般情況

各組大鼠造模前基本狀態(tài)良好，毛發(fā)正常有光澤，排便正常，關節(jié)活動自由。加強免疫一周后，除對照組外，各組大鼠的足爪和踝關節(jié)出現(xiàn)不同程度的紅腫，體重增長不明顯，毛發(fā)雜亂。加強免疫兩周后，除對照組外，各組大鼠足爪厚度明顯增加，踝關節(jié)紅腫明顯，關節(jié)活動受限，體重出現(xiàn)下降趨勢，毛發(fā)灰暗無光澤。經(jīng)藥物治療4周后，各治療組大鼠精神狀態(tài)較好，體重增長趨勢明顯，毛發(fā)整齊有光澤，關節(jié)腫脹度減輕，關節(jié)活動尚可。

2　GCFZD降低CIA大鼠關節(jié)腫脹及骨質(zhì)破壞

X線影像學結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組大鼠踝關節(jié)軟組織腫脹明顯，關節(jié)間隙增寬，骨密度降低；GCFZD中、高劑量組和甲氨蝶呤組處理后大鼠關節(jié)腫脹程度明顯降低，骨質(zhì)破壞程度減輕，見圖1。

Figure 1.　Imaging data of joint swelling and bone changes in different groups of rats. ↓： Soft tissue swelling；↑： Bone erosion；←： Joint space.

3　GCFZD對CIA大鼠體質(zhì)量、關節(jié)炎指數(shù)和足爪腫脹指數(shù)的影響

模型組大鼠的體重增長緩慢，明顯低于對照組大鼠（<0.01）；GCFZD中、高劑量和甲氨蝶呤治療后大鼠體重增加（<0.01），見圖2A。與模型組大鼠相比，GCFZD低、中、高劑量和甲氨蝶呤治療可以顯著降低大鼠關節(jié)炎指數(shù)（<0.01），減輕足爪腫脹程度（<0.01），見圖2B、C。

Figure 2.　Changes of joint weight， arthritis score and paw swelling index in each group. A： body weight； B： arthritis score； C： degree of foot swelling. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs CIA group.

4　GCFZD降低CIA大鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)

與對照組相比，模型組大鼠脾臟明顯肥大，GCFZD中、高劑量和甲氨蝶呤治療后CIA大鼠脾臟增大得到緩解，形態(tài)大小接近對照組（圖3A）。進一步對各組大鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)進行測定，結(jié)果顯示，模型組大鼠較對照組脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)明顯升高（<0.01）；GCFZD中、高劑量和甲氨蝶呤治療后可降低CIA大鼠脾臟指數(shù)（<0.01）和胸腺指數(shù)（<0.01），甘草附子湯低劑量組對CIA大鼠胸腺指數(shù)無明顯影響（>0.05），見圖3B、C。

Figure 3.　Effect of GCFZD on spleen and thymus index of CIA rats. A： spleen samples of rats in each group； B： index of spleen； C： index of thymus. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs vehicle group； ##P<0.01 vs CIA group.

5　GCFZD改善CIA大鼠脾臟組織病理學改變

脾臟HE染色鏡下結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組大鼠脾臟組織紅髓著色較深，周圍動脈淋巴鞘密度顯著增高，邊緣區(qū)增寬和淋巴結(jié)節(jié)增生明顯；與模型組相比，GCFZD中、高劑量和甲氨蝶呤治療組大鼠脾組織白髓和主要生發(fā)中心未見明顯增生，但經(jīng)GCFZD低劑量處理的CIA大鼠仍可見邊緣區(qū)和淋巴結(jié)節(jié)增生（圖4A）。脾組織病理學評估顯示，GCFZD低、中、高劑量治療組大鼠各項病理參數(shù)評分均低于模型組大鼠（圖4B）。

Figure 4.　Spleen HE staining images （A） and histopathological scores （B） of rats in each group. a： peripheral arterial lymphatic sheath density； b： marginal zone hyperplasia； c： lymphoid nodular hyperplasia； d： red pulp. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs vehicle group； #P<0.05， ##P<0.01 vs CIA group.

6　GCFZD改善CIA大鼠關節(jié)組織病理學改變

踝關節(jié)HE染色鏡下結(jié)果顯示，對照組大鼠關節(jié)內(nèi)組織結(jié)構(gòu)完整，關節(jié)面光滑無破損，滑膜組織和軟骨組織未見增生；與對照組相比，模型組大鼠關節(jié)軟骨和滑膜組織增生明顯，骨質(zhì)侵蝕程度較重，可見大量炎癥細胞浸潤和血管翳產(chǎn)生；經(jīng)GCFZD低、中、高劑量和甲氨蝶呤治療后，CIA大鼠關節(jié)破壞程度顯著降低，軟骨面相對完整，滑膜組織厚度增生不明顯，炎癥細胞浸潤減少（圖5A、B）。踝關節(jié)組織病理學評分顯示，GCFZD低、中、高劑量治療組大鼠滑膜增生、骨質(zhì)侵蝕、血管翳和炎癥細胞浸潤水平得到不同程度緩解，中、高劑量治療組效果與甲氨蝶呤治療組相似，沒有顯著性差異（圖5C）。

Figure 5.　Images of H&E and Safranine O-Fast Green staining of the ankle joint in various groups of rats. A： HE staining of ankle joint； B： HE staining of synovial tissue； C： statistical chart of ankle pathological score； D： safranin O-Fast Green staining of ankle joint. e： synovium hyperplasia； f： carilage damage； g： vascular pannus； h： inflammatory cellular infiltration. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs vehicle group； #P<0.05， ##P<0.01 vs CIA group.

為進一步反映關節(jié)內(nèi)軟骨及軟骨下骨的組織形態(tài)學變化，對踝關節(jié)進行番紅O-固綠染色。鏡下結(jié)果顯示，對照組大鼠關節(jié)軟骨及軟骨下組織結(jié)構(gòu)完整，軟骨潮線清晰，軟骨基質(zhì)分布均勻；與對照組相比，模型組大鼠軟骨面不完整并伴有糜爛、脫落，軟骨下骨組織受侵襲程度較重，軟骨潮線模糊，軟骨基質(zhì)分布不均勻；經(jīng)GCFZD低、中、高劑量和甲氨蝶呤處理后大鼠關節(jié)內(nèi)軟骨結(jié)構(gòu)相對完整，軟骨及軟骨下組織分界清晰，軟骨潮線較規(guī)則清晰，軟骨面相對完整（圖5D）。

7　GCFZD抑制細胞焦亡并降低TLR4、caspase-1和NLRP3蛋白水平抑制GSDMD表達

踝關節(jié)TUNEL染色結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組大鼠關節(jié)可見大量膨大、變形的TUNEL陽性細胞；經(jīng)GCFZD治療后，TUNEL陽性細胞率明顯降低（<0.05），見圖6A。Western blot結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組大鼠脾臟中TLR4蛋白表達增高，同時伴有cleaved caspase-1、NLRP3和GSDMD-N的表達升高，這提示TLR4通過激活caspase-1，活化的caspase-1剪切端和NLRP3炎癥小體導致GSDMD-N與胞膜磷脂蛋白結(jié)合后形成孔洞，誘發(fā)細胞焦亡（<0.05），經(jīng)GCFZD和甲氨蝶呤處理后，TLR4、cleaved caspase-1、NLRP3等焦亡相關蛋白表達下調(diào)，并降低GSDMD-N蛋白表達，且GCFZD對GSDMD-N降低較MTX相比更明顯（<0.05），見圖6B、C。

Figure 6.　GCFZD decreased TLR4， caspase1 and NLRP3 protein levels and inhibited GSDMD expression. A： the TLR4， caspase-1， NLRP3 and GSDMD protein gray bands in different groups； B： gray scale statistics of TLR4， caspase-1， NLRP3 and GSDMD proteins in different groups. GSDMD-FL： full length of GSDMD； GSDMD-N： N-terminal of GSDMD. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs vehicle group； #P<0.05， ##P<0.01 vs CIA group.

8　GCFZD減少CIA大鼠IL-1β和IL-6分泌，并促進IL-10表達抑制RA進展

與模型組相比，GCFZD低、中、高劑量治療組大鼠血清中IL-1β和IL-6的mRNA和蛋白水平表達下調(diào)（<0.05），見圖7A，且治療效果呈現(xiàn)劑量依賴性；甲氨蝶呤治療組IL-1β表達水平與高劑量組相比沒有顯著差異（>0.05），但甲氨蝶呤治療組IL-6的mRNA水平明顯低于GCFZD高劑量治療組（<0.01）；低、中、高劑量和甲氨蝶呤組治療后可增加CIA大鼠IL-10的mRNA和蛋白表達水平（<0.01），但高劑量治療組比甲氨蝶呤組升高更為明顯（<0.01），見圖7B。

Figure 7.　GCFZD reduced the secretion of IL-1β and IL-6， and increased IL-10 in CIA rats to inhibit the progression of rheumatoid arthritis. A： the protein levels of IL-1β， IL-6 and IL-10 were detected by ELISA； B： the mRNA levels of IL-1β， IL-6 and IL-10 were detected by real-time PCR. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs vehicle group； #P<0.05， ##P<0.01 vs CIA group.

討論

RA是一種中老年人群?；嫉穆苑莻魅拘约膊。膊≡缙诔Ｍㄟ^單獨使用甲氨蝶呤或甲氨蝶呤聯(lián)合非甾體類抗炎藥、糖皮質(zhì)激素、靶向藥等降低疾病活動度［10］。甲氨蝶呤作為常規(guī)治療藥物雖然能夠改善部分患者的臨床癥狀，但因其安全窗口窄、早期耐受性差、毒副作用明顯等弊端導致臨床上應用受限［11］。因此，迫切需要探索RA治療新途徑、新方法。甘草附子湯原方劑由甘草、附子、白術(shù)和桂枝4味主藥組成，具有散寒止痛、溫通經(jīng)脈、補脾益氣的作用，是治療RA的經(jīng)典湯劑。結(jié)合中醫(yī)辨證論治的整體觀念，本研究在原方劑的基礎上加入知母止渴除煩、通便潤燥；白芍斂陰止汗、柔肝止痛；威靈仙祛風濕、通經(jīng)絡；雞血藤舒筋活絡；木瓜祛濕除痹；伸筋草活血化瘀，以加強方劑活血通絡、祛風散寒、補氣益血的功效。CIA大鼠是常用的RA動物模型，與RA患者具有高度一致的免疫和病理學改變［9］。本研究通過尾部注射牛Ⅱ型膠原與弗氏佐劑形成的乳化劑來構(gòu)建CIA大鼠模型，給予不同劑量甘草附子湯加減方，觀察了甘草附子湯加減方對RA的治療效果，并對其作用機制進行了探究。

RA作為一種慢性自身免疫病，全身炎癥反應和滑膜成纖維細胞異常增殖導致的關節(jié)腫脹、骨密度降低和關節(jié)畸形等是RA的主要臨床表現(xiàn)和生物學觀測指標［12］。甲氨蝶呤作為傳統(tǒng)抗風濕藥，主要通過抑制二氫葉酸和脫氧胸苷一磷酸的生成進而減少嘌呤和嘧啶的生成，從而發(fā)揮優(yōu)異的免疫抑制和抗炎作用［13］。同傳統(tǒng)抗風濕藥物的治療機制類似，中醫(yī)單藥或復方治療也主要通過抑制過度活躍的免疫應答或維持滑膜細胞正常生理穩(wěn)態(tài)以達到抗炎和骨保護的效果。例如，昆明山海棠通過抑制IL-12、IL-23和MMP-13等炎癥因子的分泌發(fā)揮全身抗炎作用，對RA有較好的治療效果［14］；傳統(tǒng)中草藥青風藤的有效成分青藤堿通過增加miR-23b-3p的表達并下調(diào)其下游靶標成纖維細胞生長因子9（fibroblast growth factor 9，F(xiàn)GF9）的水平，誘導疾病活動期滑膜成纖維細胞的凋亡并抑制其異常增殖［15］。與上述的研究結(jié)果相似，我們通過給予不同實驗劑量的甘草附子湯加減方治療后，CIA大鼠關節(jié)軟組織腫脹和骨質(zhì)破壞程度得到顯著改善，炎癥細胞浸潤減少，關節(jié)炎指數(shù)和足爪腫脹指數(shù)明顯降低，這說明甘草附子湯加減方能夠有效降低RA的疾病活動度。

多種炎癥細胞因子介導的滑膜炎癥在RA的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用［16］。研究證明，GSDMD蛋白介導的免疫細胞焦亡與炎癥因子的釋放密切相關［17］。焦亡發(fā)生過程中，GSDMD的特定結(jié)構(gòu)域被NLRP3激活的caspase-1/-4/-5/-11識別并切割，釋放出GSDMD-N端片段與質(zhì)膜上的磷脂分子相結(jié)合，誘導質(zhì)膜孔洞的形成，破壞細胞膜完整結(jié)構(gòu)，導致質(zhì)膜溶解并釋放IL-1β、IL-6和TNF-α等炎癥因子，誘導滑膜炎癥的發(fā)生［18-19］。本研究結(jié)果顯示，RA發(fā)病過程中存在細胞焦亡，經(jīng)GCFZD處理后，CIA大鼠踝關節(jié)中發(fā)生焦亡的細胞數(shù)明顯降低（<0.05），這提示GCFZD能夠抑制細胞焦亡發(fā)揮治療效果。同時，脾臟中TLR4、cleaved caspase-1、NLRP3、GSDMD-N端蛋白的表達顯著下調(diào)（<0.05），IL-1β和IL-6促炎細胞因子的mRNA和蛋白表達水平降低（<0.01），IL-10抗炎細胞因子的mRNA和蛋白表達水平增加（<0.01），這說明GCFZD能夠抑制GSDMD介導的細胞焦亡途徑，減少炎癥因子的分泌，改善RA的滑膜炎癥。

綜上所述，甘草附子湯能夠抑制GSDMD介導的細胞焦亡，下調(diào)IL-1β和IL-6促炎細胞因子的表達水平，增加IL-10抗炎因子的分泌，顯著抑制RA關節(jié)組織病理學改變和滑膜炎癥的發(fā)生，降低RA的疾病活動度。但本項研究中缺少GCFZD對CIA大鼠成纖維滑膜細胞方面的調(diào)控研究，在后續(xù)的研究中將從細胞層面更加深入探討分析GCFZD對RA干預的作用機制。本研究探究了甘草附子湯加減方對RA的治療效果和作用機制，為RA的創(chuàng)新療法提供理論依據(jù)。

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Mechanism of Gancao-Fuzi Decoction in treatment of collagen-induced arthritis rats via inhibiting GSDMD-mediated pyroptosis

ZHANG Ming1，2， WU Tianyu3， LIU Xiaojie1， ZHANG Yan4， HE Xiaoyu1， LIU Saisai5， ZHAO Shidi1，5， CHEN Liqiu6， CHEN Chuanhao2△， ZHANG Xiaonan1，5△

（1，，2，，3，，4，5，6，，233030，）

To explore the therapeutic effect of Gancao-Fuzi Decoction （GCFZD） on collagen-induced arthritis （CIA） in rats by inhibiting the GSDMD-mediated pyroptosis.The tail heels of rats were injected with an emulsifier formed by mixing the bovine type II collagen with Freund's adjuvant to construct the CIA rat models and evaluate its arthritis indexes. The 30 male CIA rats were randomly divided into the model group， the low- （4 g/kg）， medium- （8 g/kg） and high-dose （16 g/kg） groups of GCFZD and the methotrexate group （1 mg/kg）， 6 rats per group for 30 days. The body weight， arthritis index and paw swelling index were recorded in each group of rats.X-ray imaging to observe the changes in bone destruction and soft tissue thickness， and the spleen and joints were detected by HE staining to observe the histopathological changes.The safranine o-fast green staining was used to observe articular cartilage changes. TUNEL staining was performed to evaluate cellular pyroptosis. Western blot for TLR4， caspase-1， NLRP3 and GSDMD protein expression. Real-time PCR and ELISA for IL-1β， IL-6 and IL-10 cytokine expression.Compared with the model group， there were significant improvements in soft tissue swelling and bone destruction， as well as reduced spleen and thymus indices in CIA rats with GCFZD treatment. HE staining results showed that the histopathological changes in the spleen and ankle joint of CIA rats were significantly improved with GCFZD treated. The safranine o-fast green staining showed that GCFZD could reduce the cartilage tissue destruction and repaired cartilage structure. TUNEL staining results indicated that GCFZD could significantly inhibit joint tissue pyroptosis. Western blot showed that TLR4， cleaved caspase-1， NLRP3 and GSDMD-N were decreased in spleen of CIA rats in GCFZD treatment groups. Real-time PCR and ELISA results showed that the GCFZD decreased the mRNA and protein level expression of IL-1β and IL-6 while upregulating the mRNA and protein level expression of IL-10 in blood serum of CIA rats.GCFZD may inhibit GSDMD-mediated pyroptosis and decrease IL-1β and IL-6 secretion and promote IL-10 secretion， resulting in an effective reduction of rheumatoid arthritis symptoms in CIA rats.

Gancao-Fuzi Decoction； rheumatoid arthritis； gasdermin D； pyroptosis

R593.21； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2023.02.015

1000-4718（2023）02-0325-10

2022-09-07

2022-12-14

［基金項目］安徽省高校自然科學研究項目重點項目（No. KJ2020A0588）；安徽省重點科研平臺開放課題基金項目（No. KLICD-2022-Z5）；蚌埠醫(yī)學院研究生創(chuàng)新項目（No. Byycx21012、21058）；安徽省大學生創(chuàng)新項目（No. S202110367076）

張小楠 Tel： 13609827842； E-mail： zhangxn@bbmc.edu.cn； 陳傳好 Tel： 15212108484； E-mail： cch711124@bbmc.edu.cn

（責任編輯：宋延君，李淑媛）