王瑤， 陳士坤， 段晨陽(yáng)， 梁筱晗， 周成富， 秦珺， 侯東堯， 杜權(quán)，2△

Sirt6通過(guò)調(diào)控P53/SLC7A11/GPX4通路抑制骨骼肌細(xì)胞鐵死亡*

王瑤1， 陳士坤1， 段晨陽(yáng)1， 梁筱晗1， 周成富1， 秦珺1， 侯東堯1， 杜權(quán)1，2△

（1重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院麻醉科，重慶 400010；2重慶市老年醫(yī)學(xué)臨床研究中心，重慶 400010）

探討骨骼肌細(xì)胞鐵死亡的發(fā)生及sirtuin 6 （Sirt6）對(duì)其調(diào)控的分子機(jī)制。將C2C12小鼠成肌細(xì)胞分為對(duì)照組、erastin（Era；鐵死亡誘導(dǎo)劑）組、Era+ferrostatin-1（鐵死亡拮抗劑）組、Era+MDL-800（Sirt6激動(dòng)劑）組和Era+OSS-128167（Sirt6抑制劑）組；通過(guò)細(xì)胞活力和C2C12成肌細(xì)胞肌源性分化情況觀察鐵死亡誘導(dǎo)劑及拮抗劑的影響；RT-qPCR和Western blot測(cè)定成肌細(xì)胞及肌管中Sirt6、肌萎縮標(biāo)志物、鐵死亡標(biāo)志物的mRNA及蛋白表達(dá)水平；進(jìn)一步檢測(cè)P53蛋白乙?；?、胞內(nèi)亞鐵離子（Fe2+）、活性氧（ROS）、谷胱甘肽（GSH）及脂質(zhì)過(guò)氧化指標(biāo)Liperfluo；免疫熒光法檢測(cè)肌管分化標(biāo)志物肌球蛋白重鏈（MHC）熒光信號(hào)。Era降低成肌細(xì)胞活力和肌管分化質(zhì)量，伴有Sirt6的mRNA和蛋白水平下降（<0.05），肌萎縮標(biāo)志物肌肉環(huán)指蛋白1（MuRF1）和肌萎縮F盒蛋白（MAFbx）表達(dá)增加（<0.05）。激活Sirt6可抑制P53蛋白第381位賴(lài)氨酸乙?；档蚉53表達(dá)水平，提高溶質(zhì)載體家族7成員11（SLC7A11）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4（GPX4）水平，改善ROS、GSH、Fe2+和脂質(zhì)過(guò)氧化等鐵死亡特異性指標(biāo)（<0.05），逆轉(zhuǎn)鐵死亡導(dǎo)致的肌肉負(fù)性變化。反之，抑制Sirt6將進(jìn)一步加重鐵死亡。Sirt6可抑制P53蛋白乙酰化使其活性降低，通過(guò)調(diào)控P53/SLC7A11/GPX4信號(hào)通路抑制成肌細(xì)胞鐵死亡，進(jìn)而改善肌肉質(zhì)量。

肌肉減少癥；sirtuin 6；鐵死亡；去乙?；?/p>

隨著老齡化社會(huì)的到來(lái)，年齡相關(guān)的進(jìn)行性骨骼肌變化引發(fā)的一系列負(fù)面影響越發(fā)突出。肌肉減少癥（sarcopenia；簡(jiǎn)稱(chēng)肌少癥）作為一種以骨骼肌質(zhì)量降低、力量下降、功能退化為特征的全身性肌肉綜合征，是衰老的特征性表現(xiàn)［1-2］?；疾±夏耆后w自主活動(dòng)能力下降、術(shù)后并發(fā)癥增加及住院時(shí)間延長(zhǎng)［3］，給個(gè)人、家庭及社會(huì)帶來(lái)巨大的心理壓力和醫(yī)療經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。肌少癥雖然已經(jīng)被WHO定義為一種疾病，但對(duì)它的認(rèn)識(shí)還遠(yuǎn)不清楚，值得我們進(jìn)一步探索。

氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、肌蛋白合成與代謝失調(diào)等均被認(rèn)為是肌少癥發(fā)生的原因［4-5］。骨骼肌是機(jī)體質(zhì)量最大的組織，通過(guò)有氧代謝維持生命活動(dòng)，其鐵元素含量豐富并隨年齡增長(zhǎng)不斷累積［6-8］。這一特性讓鐵死亡（ferroptosis）這種鐵依賴(lài)的、胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化物和活性氧簇（reactive oxygen species， ROS）急劇增加為特征的全新細(xì)胞死亡方式也參與到肌少癥發(fā)生中［9-11］。鐵死亡涉及多種基因信號(hào)表達(dá)變化，腫瘤抑制因子P53不僅參與腫瘤調(diào)控，近來(lái)也被發(fā)現(xiàn)在鐵死亡誘導(dǎo)劑erastin （Era）作用后表達(dá)增強(qiáng)［12］，抑制下游胱氨酸/谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)（System XC-）中的輕鏈亞基溶質(zhì)載體家族7成員11（solute carrier family 7 member 11， SLC7A11）表達(dá)和胱氨酸攝取，導(dǎo)致谷胱甘肽（glutathione， GSH）依賴(lài)的谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4（glutathione peroxidase 4， GPX4）活性降低，促進(jìn)細(xì)胞膜上高表達(dá)的多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化，從而發(fā)生細(xì)胞鐵死亡［13-14］。

sirtuins是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide， NAD+）依賴(lài)性脫乙酰酶，共有7個(gè)亞型。sirtuin 6 （Sirt6）是位于細(xì)胞核中的多效賴(lài)氨酸脫乙酰酶，在能量代謝、衰老、炎癥、應(yīng)激反應(yīng)和癌癥等多方面發(fā)揮重要作用［15-17］。近期有研究發(fā)現(xiàn)Sirt6能夠調(diào)控胃癌［18］和胰腺癌［19］中的鐵死亡，但在肌少癥領(lǐng)域中鮮有報(bào)道。使用生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)P53蛋白是肌少癥和鐵死亡交叉的關(guān)鍵信號(hào)之一。P53表達(dá)受多種翻譯后修飾影響，在其C末端區(qū)域中多個(gè)賴(lài)氨酸位點(diǎn)受乙?；饔谜{(diào)控并提高P53穩(wěn)定性［20］。Sirt6通過(guò)使P53的C末端區(qū)域關(guān)鍵乙?；稽c(diǎn)——第381位賴(lài)氨酸（Lys381）去乙酰化，降低P53活性，影響下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［21］。因此，本研究假設(shè)Sirt6通過(guò)去乙?；饔媒档蚉53表達(dá)，經(jīng)P53/SLC7A11/GPX4信號(hào)通路抑制肌細(xì)胞鐵死亡而改善骨骼肌質(zhì)量，并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

材料與方法

1　實(shí)驗(yàn)材料及主要試劑

C2C12小鼠成肌細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。C2C12專(zhuān)用培養(yǎng)液購(gòu)自Procell；DMEM basic培養(yǎng)液和馬血清均購(gòu)自Gibco；鐵死亡誘導(dǎo)劑Era、鐵死亡特異性拮抗劑鐵抑素1（ferrostatin-1， Fer-1）和Sirt6抑制劑OSS-128167 （OSS）均購(gòu)自MedChemExpress；Sirt6激動(dòng)劑MDL-800 （MDL）購(gòu)自APExBIO；CCK-8試劑及抗Sirt6、肌肉環(huán)指蛋白1（muscle ring-finger protein 1， MuRF1）、SLC7A11、GPX4和GAPDH抗體均購(gòu)自ABclonal；抗肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain， MHC）抗體購(gòu)自Santa Cruz；抗乙酰化P53 （Lys381）蛋白［Ac-P53 （Lys381）］抗體購(gòu)自Immumoway；抗肌萎縮F盒蛋白（muscle atrophy F-box protein， MAFbx）抗體購(gòu)自Proteintech；快速RNA提取試劑盒、Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄預(yù)混型試劑盒及SYBR Green PCR試劑盒均購(gòu)自湖南艾科瑞生物工程有限公司；抗P53抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology；DCFH-DA熒光探針購(gòu)自Biosharp；GSH測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司；胞內(nèi)亞鐵離子熒光探針FerroOrange及脂質(zhì)過(guò)氧化物熒光探針Liperfluo均購(gòu)自Dojindo。

2　細(xì)胞培養(yǎng)及分組

2.1細(xì)胞培養(yǎng)與肌管分化C2C12小鼠成肌細(xì)胞在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中使用C2C12專(zhuān)用培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞密度達(dá)70%～80%進(jìn)行傳代或分化。分化培養(yǎng)液由DMEM basic培養(yǎng)液和2%馬血清組成，每天更換分化培養(yǎng)液，分化5 d形成肌管用于實(shí)驗(yàn)。

2.2細(xì)胞、肌管治療及分組將Era、Fer-1、OSS和MDL溶于二甲亞砜（dimethyl sulfoxide， DMSO）中，DMSO作為對(duì)照（control， Con）組。細(xì)胞和肌管用藥物處理24或48 h，F(xiàn)er-1、OSS或MDL提前預(yù)處理2 h。實(shí)驗(yàn)分組：Con組、Era （1 μmol/L）組、Era （1 μmol/L）+Fer-1 （1 μmol/L）組、Era （1 μmol/L）+OSS （100 μmol/L）組和Era （1 μmol/L）+MDL （5 μmol/L）組。

3　主要方法

3.1CCK-8實(shí)驗(yàn)按每孔5 000個(gè)細(xì)胞種板，細(xì)胞密度達(dá)80%加藥反應(yīng)不同時(shí)間。換液后每孔加入CCK-8試劑10 μL，反應(yīng)0.5～4 h，使用多功能酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm波長(zhǎng)下吸光度，用以反映細(xì)胞活力。

3.2肌源性分化形態(tài)學(xué)觀察6孔板中細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)80%，更換含不同藥物的分化培養(yǎng)液，每天換液，共分化5 d。使用倒置熒光顯微鏡對(duì)肌管形態(tài)和數(shù)量進(jìn)行可視化觀察。

3.3肌管免疫熒光染色成肌細(xì)胞用含有不同藥物的分化培養(yǎng)液處理5 d形成肌管。PBS溶液洗滌，冰甲醇固定20 min，0.5% Triton X-100冰上透膜15 min。5% BSA室溫封閉1 h。MHC抗體（1：50）4 ℃孵育過(guò)夜，熒光二抗室溫孵育1 h，滴加含DAPI抗熒光淬滅劑封片。使用正置熒光顯微鏡觀察拍照，并用ImageJ軟件分析。

3.4RT-qPCR實(shí)驗(yàn)使用快速RNA提取試劑盒從細(xì)胞或肌管中提取總RNA并測(cè)定濃度。再用反轉(zhuǎn)錄試劑盒去除gDNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。最后加入SYBR Green PCR試劑，擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，39個(gè)循環(huán)；95 ℃ 5 s，65 ℃ 5 s，95 ℃ 50 s，1個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法分析數(shù)據(jù)。引物序列見(jiàn)表1。

表1　RT-qPCR引物序列

3.5蛋白印跡分析細(xì)胞或肌管藥物處理48 h后，PBS洗滌，按100∶1∶1的比例加入細(xì)胞裂解液、蛋白酶抑制劑和去乙酰酶抑制劑混合物，提取總蛋白。BCA法定量蛋白濃度。配制12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，恒壓100 V濕轉(zhuǎn)1 h，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h；加入抗Sirt6、P53、MAFbx、MuRF1、SLC7A11和GPX4抗體（1∶1 000），抗Ac-P53 （Lys381）抗體（1∶1 500），抗GAPDH抗體（1∶2 000），4 ℃孵育過(guò)夜；加入Ⅱ抗（1∶10 000），室溫孵育1 h。使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光劑顯影記錄分析。

3.6ROS熒光強(qiáng)度測(cè)定96孔板中細(xì)胞密度達(dá)80%左右或肌管分化5 d，藥物作用24 h。按1∶1 000稀釋DCFH-DA熒光探針，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中避光孵育30 min，PBS洗滌后使用酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光信號(hào)（激發(fā)光波長(zhǎng)：488 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)：524 nm）。

3.7GSH測(cè)定按說(shuō)明書(shū)配制所需試劑，超聲處理收集的細(xì)胞上清液，去除內(nèi)源性GSH；混勻反應(yīng)試劑，室溫反應(yīng)5 min；再加入50 μL NADPH溶液（0.5 g/L），室溫反應(yīng)25 min，用酶標(biāo)儀檢測(cè)。單點(diǎn)法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算出GSH含量。

3.8胞內(nèi)Fe2+測(cè)定96孔板培育細(xì)胞或肌管，密度達(dá)標(biāo)后加藥處理24h。去除培養(yǎng)液用PBS洗滌后，每孔中加入1 μmol/L FerroOrange工作液100 μL，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中避光孵育30 min。吸盡工作液后使用多功能酶標(biāo)儀（激發(fā)光波長(zhǎng)：543 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)：580 nm）檢測(cè)樣品熒光強(qiáng)度，通過(guò)相對(duì)熒光強(qiáng)度反映胞內(nèi)Fe2+變化。

3.9胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化測(cè)定96孔板中藥物處理細(xì)胞或肌管24 h。無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌后，每孔中加入5 μmol/L Liperfluo工作液100 μL，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中避光孵育30 min。PBS洗滌2次，使用多功能酶標(biāo)儀（激發(fā)光波長(zhǎng)：488 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)：545 nm）測(cè)定熒光強(qiáng)度。

4　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用GraphPad Prism 9.2軟件進(jìn)行分析作圖，數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，≥3。兩組間均數(shù)比較采用檢驗(yàn)；多組間均數(shù)比較使用單因素方差分析，用Tukey法進(jìn)行多組間兩兩比較分析。<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1　鐵死亡誘導(dǎo)劑降低成肌細(xì)胞活力及肌源性分化能力

為明確鐵死亡是否影響成肌細(xì)胞活力，并確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)藥物作用濃度，采用不同濃度（0～5 μmol/L）的Era處理C2C12成肌細(xì)胞不同時(shí)間（12、24和48 h）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨Era濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞活力顯著下降；不同濃度作用12 h細(xì)胞相對(duì)活力均大于50%；當(dāng)藥物濃度大于1 μmol/L時(shí)，作用24和48 h細(xì)胞活力過(guò)低，因此選擇1 μmol/L作用48 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)（圖1A）。而Era引起的細(xì)胞活力降低能被鐵死亡拮抗劑Fer-1逆轉(zhuǎn)（圖1B）。

在鐵死亡對(duì)C2C12成肌細(xì)胞肌源性分化影響的研究中，細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到80%時(shí)更換分化培養(yǎng)液、含Era的分化培養(yǎng)液或含Era+Fer-1的分化培養(yǎng)液作用5 d，每天換液。顯微鏡下可見(jiàn)，與Con組相比，Era處理后C2C12成肌細(xì)胞數(shù)量和分化能力下降，胞核減少、肌管變短、形態(tài)異常、排列紊亂，但添加Fer-1后能部分恢復(fù)肌源性分化能力（圖1C）。

Figure 1.　Effects of erastin （Era） on C2C12 myoblasts and myotubes. A： the viability of C2C12 myoblasts treated with different concentrations of Era for 48 h； B： the viability of C2C12 myoblasts at 48 h in control （Con）， Era and Era+ferrostatin-1 （Fer-1） groups； C： the morphological changes of myoblasts differentiating into myotubes in different groups. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs Con group； #P<0.05 vs Era group.

2　Era作用的成肌細(xì)胞和肌管中Sirt6表達(dá)下降

加入Era作用C2C12成肌細(xì)胞48 h，RT-qPCR顯示P53的mRNA表達(dá)水平升高，Sitr6及P53下游鐵死亡相關(guān)分子SLC7A11和GPX4的mRNA表達(dá)水平卻隨之降低（圖2A），且Sirt6會(huì)隨藥物作用時(shí)間延長(zhǎng)（48 h和72 h比較）下降得愈發(fā)明顯（圖2A、B）。在蛋白層面也發(fā)現(xiàn)相同的變化（圖2C）。

Figure 2.　The mRNA and protein levels of Sirt6， P53， SLC7A11 and GPX4 in C2C12 myoblasts treated with different concentrations of erastin （Era）. A： the mRNA levels of Sirt6， P53， SLC7A11 and GPX4 at 48 h； B： the mRNA level of Sirt6 at 72 h； C： the protein levels of Sirt6， P53， SLC7A11 and GPX4 at 48 h. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs control （Con） or 0 μmol/L group.

在肌管中，Era會(huì)導(dǎo)致肌萎縮相關(guān)分子MAFbx和MuRF1的mRNA和蛋白水平升高，同時(shí)P53的蛋白水平升高，而Sirt6的mRNA和蛋白水平及鐵死亡相關(guān)分子SLC7A11和GPX4蛋白水平下降（圖3）。

Figure 3.　Myotrophic specific E3 ubiquitin ligases were up-regulated and Sirt6 declined after erastin （Era） treatment in C2C12 myotubes. A： the mRNA expression of Sirt6， MAFbx and MuRF1 in myotubes； B： the protein expression of MAFbx， MuRF1， P53， SLC7A11， GPX4 and Sirt6 in myotubes. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs control （Con） group.

以上結(jié)果表明在鐵死亡參與的肌肉病理改變中存在Sirt6的降低。Era作用使P53表達(dá)增加，可能通過(guò)影響P53/SLC7A11/GPX4鐵死亡通路的信號(hào)變化，參與肌細(xì)胞和肌管鐵死亡發(fā)生。

3　激活或抑制Sirt6對(duì)Era作用下成肌細(xì)胞活力、細(xì)胞肌源性分化和肌管的影響

3.1激活Sirt6能抑制Era引起的成肌細(xì)胞活力下降和肌管變化為探索Sirt6在鐵死亡引起的肌質(zhì)量下降中是否發(fā)揮作用，在Era處理的基礎(chǔ)上預(yù)先加入Sirt6特異性激動(dòng)劑MDL或抑制劑OSS處理成肌細(xì)胞和肌管。在成肌細(xì)胞中，MDL激動(dòng)Sirt6會(huì)部分逆轉(zhuǎn)Era引起的細(xì)胞活力降低（圖4A），使P53的mRNA表達(dá)水平下降，SLC7A11和GPX4的mRNA表達(dá)水平升高（圖4B），改善脂質(zhì)過(guò)氧化等鐵死亡指標(biāo)（圖5），與Fer-1作用類(lèi)似；OSS處理后，伴隨Sirt6表達(dá)下降，P53的mRNA表達(dá)水平升高，而SLC7A11的mRNA表達(dá)水平降低，肌細(xì)胞鐵死亡指標(biāo)反映鐵死亡加重（圖4B及圖5）。以上結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)在Era誘導(dǎo)的鐵死亡細(xì)胞模型中，P53可抑制SLC7A11表達(dá)并出現(xiàn)GPX4下降，Sirt6通過(guò)P53/SLC7A11/GPX4通路抑制肌細(xì)胞鐵死亡。

Figure 4.　The cell viability （A） and the mRNA levels of ferroptosis markers （B） after adding ferrostatin-1 （Fer-1）， OSS-128167 （OSS） or MDL-800 （MDL） based on erastin （Era） treatment in C2C12 myoblasts. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs control （Con） group； #P<0.05， ##P<0.01 vs Era group； &&P<0.01 vs Era+OSS group.

Figure 5.　Lipid peroxidation indicators， Liperfluo （A）， ROS （B）， GSH （C） and FerroOrange/Fe2+（D）， in C2C12 myoblasts treated with erastin （Era）-based addition of ferrostatin-1 （Fer-1）， OSS-128167 （OSS） or MDL-800 （MDL）. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs control （Con） group； ##P<0.01 vs Era group； &&P<0.01 vs Era+OSS group.

C2C12肌管用不同藥物處理48 h，RT-qPCR顯示Era使MAFbx和MuRF1的mRNA表達(dá)增加（圖6A），鐵死亡脂質(zhì)過(guò)氧化指標(biāo)和胞內(nèi)Fe2+升高，GSH下降（圖6B）；OSS會(huì)加重鐵死亡改變，但MDL與Fer-1相似，能部分逆轉(zhuǎn)Era誘導(dǎo)的肌管變化（圖6）。這些結(jié)果證實(shí)鐵死亡降低肌管質(zhì)量，使促肌蛋白分解分子表達(dá)增加，Sirt6的激活對(duì)此有抑制作用。

Figure 6.　Changes of amatrophy-related genes （A） and lipid peroxidation indexes （B） in C2C12 myotubes after addition ferrostatin-1 （Fer-1）， OSS-128167 （OSS） or MDL-800 （MDL） based on erastin （Era） treatment. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs control （Con） group； #P<0.05， ##P<0.01 vs Era group； &&P<0.01 vs Era+OSS group.

3.2Sirt6激活能部分恢復(fù)因Era受損的細(xì)胞肌源性分化能力使用含不同藥物的分化培養(yǎng)液作用細(xì)胞5 d，利用免疫熒光染色檢測(cè)肌分化末期標(biāo)志分子MHC，觀察肌管分化的數(shù)量和形態(tài)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Era引起肌管胞核融合下降、數(shù)量變少、長(zhǎng)度變短、直徑變細(xì)、排列紊亂，MHC熒光信號(hào)降低；而MDL激活Sirt6后，與Fer-1相似，能減輕上述肌管變化（圖7A），說(shuō)明Sirt6能抑制鐵死亡引起的肌源性分化能力退化。

3.3Sirt6的去乙酰化作用可降低P53表達(dá)，通過(guò)P53/SLC7A11/GPX4信號(hào)通路抑制鐵死亡肌管變化用Era處理肌管48 h，Sirt6蛋白水平下降，P53、Ac-P53 （Lys381）和肌萎縮標(biāo)志蛋白（MAFbx和MuRF1）表達(dá)增強(qiáng)，SLC7A11和GPX4下降；在此基礎(chǔ)上加入MDL，則P53、Ac-P53 （Lys381）、MAFbx和MuRF1蛋白降低，SLC7A11和GPX4升高，與Fer-1相似，均能逆轉(zhuǎn)肌管鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)；而加用OSS使P53、Ac-P53 （Lys381）、MAFbx和MuRF1表達(dá)進(jìn)一步增加，Sirt6、SLC7A11和GPX4表達(dá)減少（圖7B）。這些結(jié)果表明，Sirt6抑制鐵死亡和改善鐵死亡相關(guān)肌管改變是通過(guò)使Ac-P53 （Lys381）去乙?；档蚉53活性，進(jìn)而影響下游P53/SLC7A11/GPX4信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

Figure 7.　Effects of Sirt6 on MHC and P53/SLC7A11/GPX4 signaling pathway in C2C12 myotubes. A： immunofluorescence staining of MHC； B： the protein levels of P53， Ac-P53 （Lys381）， SLC7A11， GPX4， MAFbx and MuRF1. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs Con group； #P<0.05， ##P<0.01 vs Era group； &P<0.05， &&P<0.01 vs Era+OSS group.

此外，在Era作用C2C12成肌細(xì)胞或肌管后ROS水平增高；Fer-1及MDL使ROS生成有不同程度下降；聯(lián)用OSS后ROS又進(jìn)一步增加（圖5B、6B）。因此，考慮Sirt6對(duì)肌細(xì)胞和肌管鐵死亡變化的調(diào)控存在多個(gè)作用機(jī)制，除了去乙酰化作用外，對(duì)ROS生成的影響也可能輔助抑制鐵死亡。

討論

肌少癥相關(guān)的研究已經(jīng)成為老年化社會(huì)的一個(gè)重點(diǎn)方向，其發(fā)生機(jī)制已有大量研究報(bào)道［2， 22］，隨著對(duì)衰老研究的深入，鐵死亡與肌少癥的關(guān)聯(lián)也走進(jìn)我們的視野。C2C12細(xì)胞系屬于衛(wèi)星細(xì)胞（satellite cells， SCs），能夠在充分刺激下從成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化成可分化的肌纖維最終形成可伸縮的肌管，是用以研究肌肉分化和再生的理想體外模型。成肌分化在肌肉再生中起重要作用，通過(guò)高度協(xié)調(diào)的序列程序產(chǎn)生成熟的骨骼肌，因此成肌細(xì)胞活力、肌源性分化能力和肌管質(zhì)量下降更能從源頭反映肌肉功能、力量和質(zhì)量改變［23］。本研究發(fā)現(xiàn)，使用Era處理后，C2C12成肌細(xì)胞發(fā)生鐵死亡，肌管分化能力下降，可對(duì)骨骼肌產(chǎn)生負(fù)性影響。

鐵作為人體重要的微量元素，伴隨年齡增長(zhǎng)在身體機(jī)能調(diào)節(jié)中成為一把雙刃劍［9， 24］，讓鐵死亡從多方面對(duì)骨骼肌質(zhì)量產(chǎn)生影響。發(fā)生鐵死亡的肌細(xì)胞中，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1（transferrin receptor 1， Tfr1）明顯減少會(huì)影響SCs蛋白合成，使SCs不可逆消耗，導(dǎo)致肌細(xì)胞活力下降、骨骼肌再生能力變差甚至肌萎縮發(fā)生［25］。肌細(xì)胞中鐵積累增加，GPX4和核因子E2相關(guān)因子2蛋白水平降低導(dǎo)致細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化、ROS清除障礙，加重肌細(xì)胞損傷［26-27］。P53在細(xì)胞鐵死亡中也發(fā)揮重要作用，應(yīng)激條件下被大量激活，介導(dǎo)下游靶基因轉(zhuǎn)錄抑制，調(diào)節(jié)System XC-、GPX4促進(jìn)肌細(xì)胞鐵死亡變化［12， 28-29］。此外，作為肌肉蛋白分解代謝最重要酶類(lèi)，部分E3泛素連接酶參與鐵死亡發(fā)生［30］，而肌萎縮特異性E3泛素連接酶（MAFbx和MuRF1）在衰老個(gè)體骨骼肌中隨鐵累積表達(dá)增加［9， 31］。研究中也發(fā)現(xiàn)Era處理后MHC表達(dá)下降，MAFbx和MuRF1含量大幅升高，鐵死亡影響肌管分化，促進(jìn)肌肉蛋白分解。

Sirt6是參與衰老、能量代謝、炎癥等反應(yīng)的重要脫乙酰酶，缺乏的個(gè)體更容易出現(xiàn)體重減少、脊柱前凸、腫瘤發(fā)生率增加、加速衰老，甚至過(guò)早死亡。目前Sirt6與鐵死亡的關(guān)系多數(shù)是圍繞腫瘤相關(guān)的報(bào)道，但在非腫瘤領(lǐng)域中也發(fā)現(xiàn)Sirt6通過(guò)抑制炎癥，減少1型糖尿病小鼠前額葉皮層細(xì)胞的鐵死亡，改善1型糖尿病小鼠的抑郁和焦慮［32］。

結(jié)合P53在鐵死亡調(diào)控中的重要意義和乙?；饔媚芗訌?qiáng)P53蛋白表達(dá)的特性［19， 33］，本研究針對(duì)Era處理后的C2C12成肌細(xì)胞或肌管引入Sirt6特異性激動(dòng)劑MDL［34］和抑制劑OSS［35］，發(fā)現(xiàn)激動(dòng)Sirt6能夠改善成肌細(xì)胞中鐵死亡變化并降低肌萎縮特異性E3泛素連接酶的表達(dá)。

對(duì)P53蛋白C末端第381位賴(lài)氨酸這一關(guān)鍵乙?；稽c(diǎn)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Sirt6激活使P53中第381位賴(lài)氨酸去乙?；瘜?dǎo)致P53活性減弱，SLC7A11和GPX4的mRNA和蛋白表達(dá)增加，鐵死亡和肌萎縮特異性指標(biāo)下降，肌源性分化能力得到一定恢復(fù)。相反，Sirt6抑制會(huì)進(jìn)一步加重鐵死亡引起的變化。這些結(jié)果表明，Sirt6通過(guò)去乙?；饔?，可以影響P53/SLC7A11/GPX4信號(hào)通路表達(dá)，是鐵死亡相關(guān)肌少癥的重要調(diào)控分子。

總之，在這項(xiàng)研究中，我們證明了骨骼肌細(xì)胞中鐵死亡發(fā)生與P53/SLC7A11/GPX4通路中信號(hào)變化關(guān)系密切，并伴有Sirt6表達(dá)下調(diào)，肌管質(zhì)量下降，最終可能導(dǎo)致肌少癥發(fā)生，引起肌肉功能障礙；并從機(jī)制的角度闡明Sirt6對(duì)成肌細(xì)胞和肌管鐵死亡的干預(yù)是通過(guò)促進(jìn)Ac-P53 （Lys381）去乙?；瑥亩绊慞53/SLC7A11/GPX4信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。我們的研究結(jié)果為鐵死亡相關(guān)肌少癥這一新型“流行病”治療提供了新的思考方向和治療策略。

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Sirtuin 6 suppresses ferroptosis in skeletal muscle cells by regulating P53/SLC7A11/GPX4 pathway

WANG Yao1， CHEN Shikun1， DUAN Chenyang1， LIANG Xiaohan1， ZHOU Chengfu1， QIN Jun1， HOU Dongyao1， DU Quan1，2△

（1，，400010，；2，400010，）

To investigate the occurrence of ferroptosis in skeletal muscle cells and its molecular mechanisms.Mouse C2C12 myoblasts were divided into control group， erastin （Era； ferroptosis inducer） group， Era+ferrostatin-1 （ferroptosis antagonist） group， Era+MDL-800 ［sirtuin 6 （Sirt6） agonist］ group， and Era+OSS-128167 （Sirt6 inhibitor） group. The mRNA and protein expression levels of Sirt6， muscle atrophy markers and ferroptosis markers in C2C12 myoblasts or myotubes were determined by RT-qPCR and Western blot. Furthermore， acetylation levels of P53 protein， intracellular ferrous ion （Fe2+）， reactive oxygen species （ROS）， glutathione （GSH） and lipid peroxidation index Liperfluo were examined. Immunofluorescence revealed the intensity of myosin heavy chain （MHC； a biomarker of myotube differentiation） fluorescence signal.Treatment with Era reduced the viability of C2C12 cells and the quality of differentiated C2C12 myotube， accompanied by decreased Sirt6 mRNA and protein levels （<0.05）. The mRNA and protein levels of muscle atrophy F-box protein （MAFbx） and muscle ring-finger protein 1 （MuRF1）， markers of amyotrophy， were increased （<0.05）. Activation of Sirt6 inhibited acetylation of lysine 381 site in P53 protein， and decreased P53 expression. The Sirt6 agonist also increased solute carrier family 7 member 11 （SLC7A11） and glutathione peroxidase 4 （GPX4） expression levels， and altered ferroptosis specific indicators such as ROS， GSH， Fe2+and lipid peroxidation （<0.05）. Conversely， inhibition of Sirt6 promoted ferroptosis.Sirt6 inhibits the acetylation of P53 protein to reduce its activity， counteracts ferroptosis-associated cell death and improves muscle mass by regulating the P53/SLC7A11/GPX4 signaling pathway.

sarcopenia； sirtuin 6； ferroptosis； deacetylation

R322.7+4； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2023.02.016

1000-4718（2023）02-0335-10

2022-09-19

2022-11-28

［基金項(xiàng)目］重慶市出國(guó)留學(xué)人員創(chuàng)新自主項(xiàng)目（No. CX2021069）；重慶科衛(wèi)聯(lián)合項(xiàng)目（No. 2020MSXM008）

Tel： 13883643222； E-mail： duquan100@sina.com

（責(zé)任編輯：林白霜，羅森）