于海洋，潘躍銀

（安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，安徽 合肥 230001）

肺癌（lung cancer）是我國最常見且致死率最高的惡性腫瘤，其中又以肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）所占比例最高，5 年生存率僅為4%～17%[1]。間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）是LUAD 的重要分子靶點，3%～5%的非小細(xì)胞肺癌患者存在ALK 基因重排[2]?？诉蛱婺崾且环N腺苷三磷酸競爭性酪氨酸激酶抑制劑，可以通過靶向抑制ALK，進(jìn)而發(fā)揮遏制腫瘤進(jìn)展的作用[3]。然而，服用克唑替尼治療的患者大多會在1 年內(nèi)產(chǎn)生耐藥性[4]，因此有必要尋找一個簡便的指標(biāo)預(yù)測患者的治療效果。D-二聚體（D-dimer，D-D）是由凝血系統(tǒng)激活形成的交聯(lián)纖維蛋白原（fibrinogen，F(xiàn)IB）的裂解產(chǎn)物，是凝血系統(tǒng)異?？哼M(jìn)的信號[5]。研究表明，血漿中D-D 的水平對結(jié)直腸癌[6]、卵巢癌[7]和非小細(xì)胞肺癌[8]患者的治療效果均具有一定預(yù)測價值。本研究通過Gene Expression Omnibus（GEO）數(shù)據(jù)庫中ALK 陽性肺癌患者克唑替尼耐藥前原發(fā)灶和耐藥后肝轉(zhuǎn)移灶之間的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行潛在機(jī)制的探索，隨后通過回顧性收集臨床數(shù)據(jù)來分析D-D 及FIB 水平對ALK 陽性并服用克唑替尼治療的肺癌患者的無進(jìn)展生存期（progression-free survival，PFS）預(yù)測作用，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 轉(zhuǎn)錄組資料 下載來自GEO 數(shù)據(jù)庫中編號為GSE125864 數(shù)據(jù)集的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和臨床信息，應(yīng)用R 語言對GEO 數(shù)據(jù)庫中ALK 陽性肺癌患者克唑替尼耐藥前原發(fā)灶和耐藥后肝轉(zhuǎn)移灶之間的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的基因探針、名稱、表達(dá)量進(jìn)行預(yù)處理，并同時下載基因表達(dá)譜原始數(shù)據(jù)及臨床數(shù)據(jù)以便進(jìn)行生存分析。

1.2 臨床資料 隨后收集安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院2014 年7 月-2020 年7 月122 例診斷為ALK 陽性并服用克唑替尼治療的肺癌患者的臨床資料，包括年齡、性別、吸煙史、臨床分期、轉(zhuǎn)移部位、治療線數(shù)、紅細(xì)胞（red blood cell，RBC）數(shù)值、白細(xì)胞（white blood cell，WBC）數(shù)值、血小板（platelet，PLT）、凝血酶原時間（prothrombin time，PT）、凝血酶時間（thrombin time，TT）、國際標(biāo)準(zhǔn)化比率（international normalized ratio，INR/PT-INR）、部分活化凝血酶原時間（active partial thromboplastin time，APTT）、FIB、D-D，并從患者首次服用克唑替尼的時間開始進(jìn)行隨訪，隨訪日期截止到2020 年12 月，PFS 定義為從患者開始服藥至發(fā)生疾病進(jìn)展或其他任何原因發(fā)生死亡的時間。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理學(xué)和或組織學(xué)診斷為ALK 陽性的肺癌患者；②服用克唑替尼時間不少于1 個月；③依據(jù)國際抗癌聯(lián)盟肺癌TNM 分期為Ⅲ或Ⅳ期；排除標(biāo)準(zhǔn)：治療前存在明顯肝、腎功能損害、凝血障礙和或其他嚴(yán)重身心疾病。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批通過，患者知情同意并簽署知情同意書。

1.3 方法

1.3.1 差異基因分析 通過R 語言（3.63 版）DEseq2軟件包進(jìn)行差異基因分析，設(shè)置原發(fā)組作為參考組，肝轉(zhuǎn)移灶組作為實驗組，參數(shù)設(shè)置log FoldChange=1，P＜0.05。

1.3.2 核心基因篩選 基于在線生物信息學(xué)在線數(shù)據(jù)庫DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）進(jìn)行通路富集分析；Cytoscape 軟件通過MNC、Degree、EPC、Eccentricity、Closeness 共5 種計算方式篩選關(guān)鍵樞紐（Hub）基因。

1.3.3 核心基因生存分析 GEPIA 在線生存分析工具（廣泛應(yīng)用的腫瘤TCGA 數(shù)據(jù)庫的挖掘網(wǎng)站http://gepia2.cancer-pku.cn/）用于繪制關(guān)鍵Hub 基因的表達(dá)量與患者預(yù)后總生存期（overall survival，OS）相關(guān)的生存曲線。生存分析設(shè)置：①癌癥類型：肺腺癌和肺鱗癌；②方法：OS；③分組依據(jù)：基因表達(dá)中位值。

1.3.4 京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集 R 軟件（3.63 版）中內(nèi)置的“clusterProfiler”用于對差異分析中滿足篩選條件的差異基因進(jìn)行KEGG 通路富集分析及可視化，并依據(jù)P值大小進(jìn)行排序展示，篩序標(biāo)準(zhǔn)：P＜0.05。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 23.0 及R 等統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行臨床數(shù)據(jù)分析與繪圖。采用Kaplan-Meier 法對不同分組間進(jìn)行生存分析并繪制PFS 曲線。根據(jù)治療前血液指標(biāo)構(gòu)建受試者工作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲線，用曲線下面積（area under curve，AUC）評價其診斷價值。計量資料以（）表示，采用t檢驗；計數(shù)資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗；相關(guān)分析采用Spearman 檢驗；單因素、多因素分析采用Cox 回歸分析。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 差異基因及通路富集分析 以原發(fā)病灶作為對照組，服用克唑替尼的配對肝轉(zhuǎn)移灶中180 個差異基因上調(diào)，170 個差異基因下調(diào)（圖1A）。對差異基因進(jìn)行KEGG 通路富集分析顯示，基因主要富集于補(bǔ)體及凝血級途徑（圖1B）；對上述差異表達(dá)基因進(jìn)行蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)網(wǎng)絡(luò)分析，并將得到的結(jié)果通過cytohubba 軟件進(jìn)行Hub 基因的篩選，為了排除單一算法產(chǎn)生的誤差，采用MNC、Degree、EPC、Eccentricity、Closeness 共5 種計算方式篩選Hub 基因，并對得到的結(jié)果取交集得到FGA、FGG、APOA1以及APOB 關(guān)鍵Hub 基因（圖2A）；通過對TCGA數(shù)據(jù)庫中的肺癌患者進(jìn)行生存分析顯示，F(xiàn)GA 和FGG 低表達(dá)組的中位總生存時間長于高表達(dá)組（圖2B、2C）。FGA 和FGG 分別編碼FIB 的α 和γ 鏈，F(xiàn)IB 的部分裂解產(chǎn)物為D-D。

圖1 克唑替尼耐藥轉(zhuǎn)移組織與原發(fā)組織中差異基因比較

圖2 核心基因及其生存分析

2.2 臨床數(shù)據(jù)分析

2.2.1 一般資料 共納入122 例ALK 陽性并服用克唑替尼治療的肺癌患者，具體臨床特征見表1。

表1 患者臨床特征（n，%）

2.2.2 預(yù)測價值分析 根據(jù)平均PFS 值評估基線血液參數(shù)值的ROC 曲線（狀態(tài)變量：PFS=17 個月）。以RBC、WBC、PLT、PT、PT-INR、APTT、TT、FIB、D-D為基線數(shù)據(jù)，ROC 曲線分析顯示，F(xiàn)IB、D-D 對PFS有良好的預(yù)測作用（AUC=0.798、0.906），F(xiàn)IB 的Cutoff 值為3.165（敏感度為88.20%，特異度為63.00%），D-D 的Cut-off 值為0.655（敏感度為81.60%，特異度為84.80%），見圖3。

圖3 治療前血液參數(shù)的ROC 曲線

2.2.3 Kaplan-Meier 生存分析 Kaplan-Meier 分析顯示顯示，122 例患者中低WBC 組的PFS 長于高WBC 組；低PT 組的PFS 長于高PT 組；低PT-INR組的PFS 長于高PT-INR 組；高TT 組的PFS 長于低PT-INR 組；低FIB、D-D 組的PFS 長于高FIB、D-D 組（P＜0.05），而其他血液參數(shù)組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖4。

圖4 患者PFS 的Kaplan-Meier 分析

圖4 患者PFS 的Kaplan-Meier 分析（續(xù)）

2.2.4 單因素及多因素分析 單因素Cox 回歸分析顯示，PT、PT-INR、FIB、D-D 與PFS 相關(guān)，見表2。多因素Cox 回歸分析顯示，D-D 和FIB 水平可作為評估ALK 陽性并服用克唑替尼治療的肺癌患者PFS 獨立預(yù)測因子，見表3。

表2 單因素Cox 回歸分析

表2（續(xù)）

表3 多因素Cox 回歸分析

3 討論

D-D 廣泛應(yīng)用于血液系統(tǒng)疾病的診治中，包括血栓性疾病[9]、心血管疾病[10，11]治療結(jié)局的預(yù)測。既往關(guān)于癌癥與凝血因素的相關(guān)性研究表明，血漿中D-D 及FIB 的水平對結(jié)直腸癌[6]、卵巢癌[7]、肺癌[12，13]、尿路上皮癌[14]以及乳腺癌[15]等多種癌癥患者的治療效果及預(yù)后具有一定預(yù)測價值。然而大多數(shù)研究多集中在整個癌癥種類上，而忽略了不同癌種的分子分型及單獨的靶向藥物治療。

惡性腫瘤細(xì)胞中纖維蛋白溶解活性較高，且伴有大量FIB 激活物分泌，致使局部纖維蛋白溶解，從而引起血漿中D-D 與FIB 含量水平升高。研究顯示[16]，肺癌患者常伴隨凝血-纖溶功能異常，凝血纖溶系統(tǒng)的激活直接參與腫瘤的發(fā)展進(jìn)程。Gieseler F 等[17]研究表明，肺癌細(xì)胞不僅能激活內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)凝血因子，也能被其它細(xì)胞因子活化釋放組織因子，從而活化外源性的凝血纖維蛋白溶解通路，而凝血纖維蛋白溶解系統(tǒng)異常又可進(jìn)一步導(dǎo)致腫瘤基質(zhì)形成和血管生成。一項有關(guān)于腫瘤與高凝狀態(tài)作用的研究報道[18]，腫瘤患者預(yù)防用抗凝劑可取得一定的生存獲益。Klerk CPW 等[19]研究表明，皮下注射低分子肝素的短期療程有利于晚期惡性腫瘤患者的生存獲益。在小細(xì)胞肺癌患者的治療中，聯(lián)合使用低分子量的肝素可使患者獲得更佳的抗腫瘤效果[20]。這些關(guān)于凝血狀態(tài)異常與腫瘤治療的研究表明，凝血機(jī)制的異常激活或可導(dǎo)致腫瘤患者的進(jìn)展和較差的預(yù)后，通過聯(lián)用抗凝藥物或可在一定程度上改善患者的治療效果，延長患者生存時間。

Wang X 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，編碼FIB α 鏈的FGA與編碼FIB γ 鏈的FGB 過表達(dá)或可導(dǎo)致機(jī)體高凝狀態(tài)的產(chǎn)生。本研究中Hub 基因的篩選和基因預(yù)后分析表明，核心基因FGA 與FGG 的高表達(dá)與肺癌的不良預(yù)后相關(guān)。此外，通過收集并分析接受克唑替尼治療ALK 陽性患者的治療前血液參數(shù)和臨床信息，結(jié)果發(fā)現(xiàn)122 例患者中低WBC 組的PFS 長于高WBC 組；低PT 組的PFS 長于高PT 組；低PTINR 組的PFS 長于高PT-INR 組；高TT 組的PFS 長于低PT-INR 組；低FIB、D-D 組的PFS 長于高FIB、D-D 組（P＜0.05），而其他血液參數(shù)組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；且單因素Cox 回歸分析顯示，PT、PT-INR、FIB、D-D 與PFS 相關(guān)；多因素Cox 回歸分析顯示，D-D 和FIB 水平可作為評估ALK 陽性并服用克唑替尼治療的肺癌患者PFS 獨立預(yù)測因子。以上研究結(jié)果提示，F(xiàn)IB 及D-D 水平對于ALK陽性并服用克唑替尼治療的肺癌患者治療效果及預(yù)后具有一定的預(yù)測價值。

綜上所述，治療前FIB 和D-D 高水平提示ALK 陽性并服用克唑替尼治療的肺癌患者治療效果及預(yù)后較差，且FGA、FGG 高表達(dá)可能是導(dǎo)致患者快速進(jìn)展的潛在機(jī)制之一，有待進(jìn)一步的功能學(xué)實驗驗證。