唐 菀，張曉珣，柴 進

（陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院/西南醫(yī)院消化內(nèi)科，重慶 400038）

目前，肝細胞癌（hepatocellular carcinoma）已成為一種全球性常見的消化系統(tǒng)腫瘤之一，是我國第4位常見惡性腫瘤及第2 位腫瘤致死病因[1，2]。雖然手術(shù)治療可提高肝細胞癌患者的總體生存預(yù)后，但術(shù)后并發(fā)癥和復(fù)發(fā)率很高，治療效果欠佳。腫瘤微環(huán)境是腫瘤賴以存在的根本，它為腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。腫瘤發(fā)生、生長和轉(zhuǎn)移與其所處內(nèi)外環(huán)境密切相關(guān)，既包含腫瘤所在區(qū)域的組織結(jié)構(gòu)等，也包含腫瘤細胞本身所處的內(nèi)在環(huán)境[3]。腫瘤細胞可以通過自分泌、旁分泌等方式，改變并維持其生存與發(fā)展條件，從而促進腫瘤的生長。全身及局部組織也可通過改變代謝、分泌、免疫等，限制和影響腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[4]。術(shù)后轉(zhuǎn)移是肝癌高復(fù)發(fā)的重要原因。因此，探尋肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)相關(guān)的分子機制對于提高肝癌遠期療效具有重要意義。有機陰離子轉(zhuǎn)運體多肽（organic anion transporting polypeptides，OATPs）家族是溶質(zhì)載體的一個重要超家族，其由SLCO 基因家族編碼。OATPs 廣泛分布在全身各種器官與組織中，可以調(diào)節(jié)多種內(nèi)外源性化合物和常用處方藥物的轉(zhuǎn)運，包括他汀類藥物、甲氨蝶呤和抗高血壓藥物等[5]。OATPs 以鈉離子非依賴的方式進行底物轉(zhuǎn)運，所有OATPs 均包含12 個跨膜結(jié)構(gòu)域，在第9 和第10 跨膜區(qū)域之間存在著一個胞外環(huán)，它含有許多保守的半胱氨酸殘基，類似于DNA 結(jié)合蛋白的鋅指結(jié)構(gòu)域，這種結(jié)構(gòu)特征是OATPs 發(fā)揮各種功能的關(guān)鍵[6]。目前，已鑒別出的人源性O(shè)ATPs 有11 種，其中研究最多的為OATP1 亞家族。而在肝癌和癌旁肝組織中表達差異明顯的基因SLCO1B1 編碼有機陰離子轉(zhuǎn)運蛋白家族成員OATP1B1。OATP1B1 是一種跨膜受體，能特異性地表達于肝細胞基底膜上，主要參與腸肝循環(huán)和肝臟代謝清除等過程。研究顯示，OATP1B1 在HepG2 肝癌細胞中的表達較低[7]，且與正常組織相比，它在肝癌組織中的表達減少[8]。除在肝癌中有表達，OATP1B1 在多種腫瘤細胞與組織中有表達。研究表明[9]，通過誘導(dǎo)OATP1B1 在卵巢癌細胞中高表達，有利于增強抗腫瘤藥的治療效果；此外，OATP1B1 在結(jié)腸癌中的表達高低，與結(jié)腸癌的分化密切相關(guān)[10]?？梢钥闯?，OATP1B1 的表達水平對腫瘤的治療效果可產(chǎn)生較大的影響。目前，關(guān)于OATP1B1 在肝細胞癌組織中表達降低的機制尚不明確。因此，本研究利用生物信息學(xué)方法分析肝細胞癌患者中SLCO1B1 基因的表達，探討其與患者臨床預(yù)后以及免疫浸潤水平的相關(guān)性，為臨床的診療工作提供參考。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 利用TIMER、Kaplan-Meier plotter、TISIDB、GEPIA 等數(shù)據(jù)庫獲取關(guān)于肝細胞癌的數(shù)據(jù)，并分析相關(guān)基因變化。

1.2 TIMER 分析 在TIMER2.0 數(shù)據(jù)庫（http://timer.cistrome.org/），選中Exploration 的Gene_DE 模塊；在Gene expression 中鍵入SLCO1B1，提交即可得到SLCO1B1 在不同腫瘤中的表達情況。在TIMER 數(shù)據(jù)庫（https://cistrome.shinyapps.io/timer/），選中Gene模塊，進入Gene-免疫細胞浸潤相關(guān)性頁面；鍵入基因名稱SLCO1B1，選擇目的腫瘤LIHC，提交分析SLCO1B1 的表達水平與肝細胞癌組織內(nèi)免疫細胞浸潤的相關(guān)性。進入TIMER 數(shù)據(jù)庫，導(dǎo)航欄中選擇Survival，腫瘤類型中輸入LIHC，免疫細胞種類默認選 擇B cell、CD8+T cell、CD4+T cell、Macrophage、Neutrophil、Dendriticcell，GeneSymbols 輸入SLCO1B1，隨后右側(cè)即彈出Cox 風(fēng)險模型相關(guān)結(jié)果，提取結(jié)果進行整理。

1.3 Kaplan-Meier 生存曲線分析 進入Kaplan-Meier plotter 數(shù)據(jù)庫（http://kmplot.com/analysis/），點擊Liver cancer 選項，鍵入基因名SLCO1B1，選擇中位值作為該基因表達高、低的切分點，依次選中OS、RFS、PFS 和DSS 點擊繪圖，即可獲得SLCO1B1 表達水平與肝癌患者預(yù)后情況的關(guān)系。在Kaplan-Meier plotter 數(shù)據(jù)庫，點擊Liver cancer 選項進入肝癌亞組的預(yù)后分析；在跳轉(zhuǎn)的頁面中，鍵入目的基因SLCO1B1，選擇以中位值作為區(qū)分基因表達高、低表達的分界線，在survival 中選中OS 或PFS，而在臨床指標(biāo)中則依次選中Stage、Grade、AJCC_T、Gender、Race、Alcohol consumption、Hepatitis virus，最后點擊繪圖，即可得到在不同的臨床病理條件下相應(yīng)的HR值和以及P值。

1.4 TISIDB 分析 進入TISIDB 數(shù)據(jù)庫（http://cis.hku.hk/TISIDB），在基因欄中輸入SLCO1B1，點擊提交后頁面跳轉(zhuǎn)，選擇Lymphocyte，右側(cè)選項欄中設(shè)置X軸癌種為LIHC，分別點擊調(diào)整Y 軸為28 種淋巴細胞，繪制散點圖，提取相關(guān)系數(shù)R和P值，匯總整理即為SLCO1B1 表達與人肝細胞癌淋巴細胞浸潤的關(guān)系。

1.5 GEPIA 分析 在GEPIA 數(shù)據(jù)庫（http://gepia.cancer-pku.cn/index.html），選擇Multiple Gene Analysis模塊下的Correlation analysis 選項；在相關(guān)性分析模塊中，在基因A 中鍵入SLCO1B1，而在Gene B 中依次鍵入免疫細胞標(biāo)記基因名，相關(guān)系數(shù)選擇為Spearman，而TCGA Tumor 和TCGA Normal 中則分別選中LIHC Tumor 和LIHC Normal 添加至右側(cè)的數(shù)據(jù)集中，提交即可得到每個基因與SLCO1B1 的相關(guān)性系數(shù)，提取結(jié)果進行整理。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 通過整合基因表達信息和臨床預(yù)后價值進行統(tǒng)計分析以及驗證生存相關(guān)分子標(biāo)志物SLCO1B1，經(jīng)Log-rank 檢驗分析患者生存狀況的差異。采用Cox 比例風(fēng)險模型檢驗SLCO1B1 水平和腫瘤浸潤性免疫細胞與LIHC 患者預(yù)后的關(guān)系。Spearman 相關(guān)分析表征相關(guān)性程度，相關(guān)系數(shù)越接近0，相關(guān)關(guān)系越弱；越接近-1 或+1，證明相關(guān)關(guān)系越強。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SLCO1B1 在肝細胞癌中的表達 通過檢索TIMER 數(shù)據(jù)庫中測定的mRNA 水平發(fā)現(xiàn)，與癌旁正常組織相比，SLCO1B1 在人肝細胞癌組織中的表達降低。并且在其他腫瘤如膽管癌（CHOL）中，SLCO1B1也呈低表達。此外，與癌旁正常組織相比，SLCO1B1在膀胱移行細胞癌（BLCA）、食管癌（ESCA）、肺鱗狀細胞癌（LUSC）等腫瘤中表達略高，見圖1。

圖1 SLCO1B1 在不同腫瘤中的表達情況

2.2 SLCO1B1 表達與肝細胞癌患者生存預(yù)后的關(guān)系與SLCO1B1 低表達組相比，SLCO1B1 高表達組的總生存期（OS）（n=364，P=0.0037）、無復(fù)發(fā)生存期（RFS）（n=313，P=0.011）、無進展生存期（PFS）（n=366，P=0.0017）、疾病特異性生存期（DSS）（n=357，P=0.024）均提高。SLCO1B1 是預(yù)測肝細胞癌預(yù)后的一個保護性因素，SLCO1B1 高表達的肝細胞癌患者預(yù)后較好，見圖2。

圖2 SLCO1B1 在肝細胞癌中的預(yù)后意義

2.3 SLCO1B1 表達與肝細胞癌患者臨床特征的相關(guān)性 在男性、亞洲人、飲酒、未感染肝炎病毒的肝細胞癌患者中，SLCO1B1 mRNA 低表達的總生存期和無進展生存期更差；在1 期、2 期、1 級、3 級、女性、不飲酒、感染肝炎病毒等肝細胞癌患者中，SLCO1B1的表達與總生存期和無進展生存期無關(guān)，見表1。

表1 SLCO1B1 表達與肝細胞癌患者臨床預(yù)后的相關(guān)性

2.4 肝細胞癌中SLCO1B1 表達水平與免疫細胞浸潤水平的相關(guān)性 SLCO1B1 在肝細胞癌中的低表達與大多數(shù)免疫細胞的高浸潤水平相關(guān)，其中SLCO1B1的表達水平與肝癌組織中B 細胞（r=-0.176，P=1.06e-03）、CD8+T 細胞（r=-0.159，P=3.11e-03）、CD4+T 細胞（r=-0.139，P=9.99e-03）、巨噬細胞（r=-0.15，P=5.60e-03）、中性粒細胞（r=-0.069，P=1.98e-01）、樹突狀細胞（r=-0.164，P=2.43e-03）的浸潤水平呈負相關(guān)，而與腫瘤純度（r=0.009，P=8.7e-01）呈正相關(guān)，見圖3。SLCO1B1 與28 種腫瘤浸潤性免疫細胞亞型的關(guān)系：SLCO1B1 與活化CD8+T 細胞、活化CD4+T 細胞、中樞記憶CD4+T 細胞、濾泡輔助性T 細胞、γδT 細胞、CD56+自然殺傷細胞、髓源性抑制細胞、活化樹突細胞呈負相關(guān)，而與記憶B 細胞、嗜酸性粒細胞呈正相關(guān)，見表2。此外，Cox 比例風(fēng)險模型顯示，B 細胞、CD8+T 細胞、樹突狀細胞、SLCO1B1 表達水平與肝細胞癌患者臨床預(yù)后相關(guān)，見表3。

表2 SLCO1B1 表達與人肝細胞癌淋巴細胞浸潤的關(guān)系

表3 SLCO1B1 和腫瘤浸潤性免疫細胞在肝細胞癌中的Cox 比例風(fēng)險模型

圖3 SLCO1B1 表達水平與肝細胞癌組織內(nèi)免疫細胞浸潤的相關(guān)性

2.5 肝細胞癌中SLCO1B1 表達水平與免疫細胞標(biāo)志物的相關(guān)性 SLCO1B1 在肝癌組織中的表達與輔助性T 細胞2（Th2）、調(diào)節(jié)性T 細胞（Treg）、T 細胞耗竭（T cell exhaustion）、濾泡輔助性T 細胞（Tfh）、輔助性T 細胞17（Th17）、CD8+T 細胞（CD8+T）、T 淋巴細胞（T cell）、B 淋巴細胞（B cell）、腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TAM）、M1 型巨噬細胞（M1 Macrophage）和樹突狀細胞（DC）標(biāo)記基因的表達相關(guān)。其中，輔助性T 細胞2 標(biāo)志物STAT6，調(diào)節(jié)性T 細胞標(biāo)志物TGF-β，T 細胞耗竭標(biāo)志物CTLA4、PD-1、LAG3、GZMB，濾泡輔助性T 細胞標(biāo)志物BCL6，輔助性T 細胞17 標(biāo)志物STAT3，CD8+T細胞標(biāo)志物CD8B，T 淋巴細胞標(biāo)志物CD3D，M1 型巨噬細胞標(biāo)志物NOS2，樹突狀細胞標(biāo)志物HLA-DQB1均與SLCO1B1 的表達有關(guān)，見表4。

表4 SLCO1B1 表達與免疫細胞標(biāo)記基因的相關(guān)性

表4（續(xù)）

3 討論

肝細胞癌是一種高死亡率的原發(fā)性肝癌。它是一種全球范圍最常見的惡性腫瘤，尤其是在亞洲、非洲和南部歐洲[11，12]。肝癌的癌變過程中可能伴隨著一種或多種血清腫瘤標(biāo)志物的升高，單項檢測或多項聯(lián)合檢測可顯著提高肝癌診斷的陽性率。

OATPs 家族成員對藥物的運輸作用是人體內(nèi)最重要的細胞藥物攝取機制之一。有研究表明[13]，攝取轉(zhuǎn)運體可以增加對抗癌藥物如甲氨蝶呤等的敏感性。OATPs 家族與腫瘤之間關(guān)系密切，如有研究表明抑制OATP1A2 會抑制人食管鱗狀細胞癌的進展和預(yù)后[14]。Nakanishi T 等[15]指出OATP2A1 可能通過將PGE2 攝取到內(nèi)皮細胞中來促進小鼠結(jié)腸癌的發(fā)生。Ueno A 等[16]證實OATP1B3 上調(diào)的肝細胞癌可能代表Wnt/β-catenin 激活的肝細胞癌的特定亞類。特別的是，有研究表明[17，18]，OATP1B1 對索拉非尼在肝細胞癌中的轉(zhuǎn)運和治療效果有重要作用，這提示OATP1B1（SLCO1B1）在肝癌組織中的表達水平可能對于肝癌患者的預(yù)后有重要影響。

本研究顯示，SLCO1B1 基因在肝細胞癌及癌旁組織中表達水平存在差異，與正常組織相比，SLCO1B1 在肝細胞癌組織中的表達降低。Kaplan-Meier 分析結(jié)果表明，SLCO1B1 高表達的肝細胞癌患者預(yù)后較好，提示SLCO1B1 是預(yù)測肝細胞癌預(yù)后的一個保護性因素。另外，SLCO1B1 的表達在肝細胞癌患者的某些臨床特征，如男性、亞洲人、飲酒、未感染肝炎病毒等中具有預(yù)后意義。在這些患者中，SLCO1B1 的低表達表現(xiàn)為相對更差的總生存期和無進展生存期。推測在肝細胞癌中SLCO1B1 可能通過影響細胞周期進程，如抑制細胞增殖、促進細胞凋亡等，影響肝細胞的發(fā)生發(fā)展，其在肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展中表現(xiàn)出一定的生物學(xué)作用。

有研究指出[19]，腫瘤微環(huán)境中免疫細胞浸潤與肝癌預(yù)后具有明顯相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示，SLCO1B1 在肝細胞癌中的低表達與B 細胞、CD8+T細胞、CD4+T 細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞等免疫細胞在腫瘤中的高浸潤水平相關(guān)。B 細胞能夠產(chǎn)生抗體，是體液適應(yīng)性免疫的關(guān)鍵細胞，也是腫瘤微環(huán)境重要的免疫細胞[20]。巨噬細胞是組織駐留的分化單核細胞，其吞噬活性根據(jù)其分化狀態(tài)和功能作用通常分為M1 和M2 亞型，M1 和M2 型巨噬細胞在腫瘤預(yù)后中均具有一定的預(yù)測價值[21,22]。而中性粒細胞是最豐富的循環(huán)白細胞，具有吞噬和抗菌能力。在癌癥中，中性粒細胞計數(shù)的增加與不良總生存期相關(guān)[23]。樹突狀細胞則是形成T 細胞活化和分化的關(guān)鍵專業(yè)抗原提呈細胞，其由不同功能、形態(tài)、表型和分布的特定樹突狀細胞亞群組成，不同的亞群與不同的預(yù)后相關(guān)[24]。其作為細胞免疫的主體類群，T 細胞在腫瘤免疫細胞殺傷中具有重要作用。在腫瘤微環(huán)境中，CD8+T 細胞可以對腫瘤細胞造成殺傷作用，而CD8+T 細胞主要通過CD4+T 細胞中Treg 細胞進行調(diào)節(jié)[25]。本研究進一步分析結(jié)果顯示，SLCO1B1 與肝細胞癌的16 種免疫細胞亞型相關(guān)。表明SLCO1B1 可能是肝細胞癌中一種主要的腫瘤免疫浸潤調(diào)節(jié)因子。為了充分證明SLCO1B1 的表達與肝細胞癌中免疫細胞的浸潤有關(guān)，本研究利用GEPIA 數(shù)據(jù)庫研究了肝細胞癌中SLCO1B1 表達水平與免疫細胞標(biāo)志物的相關(guān)性。根據(jù)背景和腫瘤類型，免疫細胞可以是促腫瘤發(fā)生的，也可以是抗腫瘤發(fā)生的。肝細胞癌中大量免疫細胞如腫瘤相關(guān)巨噬細胞的浸潤可以對肝癌的發(fā)生發(fā)展起到正向作用[26]，且由于腫瘤微環(huán)境的免疫抑制造成CD8+T 細胞（腫瘤殺傷性T 細胞）處于免疫疲憊（抑制）狀態(tài)[27]，這樣的雙重作用導(dǎo)致了肝癌的不良預(yù)后。盡管如此，免疫細胞的浸潤水平對肝癌的預(yù)后評判并不全面，對于腫瘤需要考量更多的變量，如腫瘤進展分期等。

綜上所述，SLCO 基因家族成員SLCO1B1 是一種與免疫浸潤相關(guān)的肝細胞癌預(yù)后生物標(biāo)志物，可以用來評估腫瘤組織中免疫細胞浸潤的水平。其中低表達SLCO1B1 的肝細胞癌患者預(yù)后較差，這可能與腫瘤免疫微環(huán)境被重塑有關(guān)，提示SLCO1B1 可以作為一種新的肝細胞癌治療靶點，然而其具體的分子機制仍有待生物學(xué)實驗進一步驗證。