薛云云 田躍霞 張 鑫 張蕙琪 李 娜 梁煜瑩 張加羽 白冬梅

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)經(jīng)濟(jì)作物研究所，山西 太原 030031）

花生（Arachis hypogaeaL.）是世界范圍內(nèi)重要的油料和經(jīng)濟(jì)作物之一。在國(guó)內(nèi)植物油供給嚴(yán)重緊缺的市場(chǎng)背景下，進(jìn)一步擴(kuò)大我國(guó)花生生產(chǎn)、拓寬種植區(qū)域，能夠增加油料供給、提高農(nóng)民收入、促進(jìn)鄉(xiāng)村振興［1］。花生是喜溫作物，從種子發(fā)芽到成熟的整個(gè)生育期都容易遭遇低溫寒害，其中以芽期危害最為普遍，容易造成種子活力下降、爛種、出苗率低，進(jìn)而影響花生的產(chǎn)量和品質(zhì)［2］。有研究學(xué)者認(rèn)為可以利用外源物質(zhì)來增強(qiáng)花生種子的耐低溫能力，如赤霉素［3］、過氧化氫（H2O2）［4］、磷酸二氫鉀［5］能夠顯著提高低溫環(huán)境下花生的發(fā)芽率，但是這種方法需要提前以適宜濃度的外源物質(zhì)進(jìn)行浸種，費(fèi)工費(fèi)時(shí)。因此，培育耐寒性強(qiáng)的花生品種是解決低溫寒害的理想途徑。

國(guó)內(nèi)外關(guān)于花生耐寒性的研究已經(jīng)取得了一些進(jìn)展，主要集中在低溫脅迫下芽期耐寒性鑒定及其評(píng)價(jià)體系構(gòu)建［6-8］、生理生化指標(biāo)的變化情況［9-11］、轉(zhuǎn)錄組及其差異基因表達(dá)分析［12-14］等，而利用主基因+多基因混合模型進(jìn)行遺傳分析主要集中在農(nóng)藝性狀［15-17］、品質(zhì)性狀［18-19］及其抗病性［20-21］等，對(duì)花生耐寒性遺傳特性尚缺乏系統(tǒng)性和突破性分析研究。因此，本研究利用耐寒性強(qiáng)的品種和耐寒性弱的品種雜交，構(gòu)建了2 個(gè)重組自交系（recombinant inbred line，RIL）群體，將這2個(gè)RIL 群體及其親本分別種植于4個(gè)環(huán)境中，收獲后的種子首先進(jìn)行芽期耐寒性表型鑒定，然后以相對(duì)發(fā)芽率作為花生芽期耐寒性評(píng)價(jià)指標(biāo)［5］，利用章元明團(tuán)隊(duì)開發(fā)的數(shù)量性狀主基因+多基因混合遺傳分析R軟件包SEA v2.0［22］對(duì)2 個(gè)RIL 群體芽期耐寒性進(jìn)行遺傳特性分析，探究該性狀的遺傳模型和主基因調(diào)控?cái)?shù)量，旨在為深入開展芽期耐寒性分子機(jī)制研究、提高耐寒性分子育種效率提供重要的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以耐寒性強(qiáng)的花生品種花育44（HY44）為母本，耐寒性弱的花生品種DF12為父本，雜交構(gòu)建包含有807個(gè)家系的F7：8代RIL群體，命名為HD-RIL；以耐寒性強(qiáng)的花生品種遠(yuǎn)雜9102（YZ9102）為母本，低溫敏感花生品系徐州68-4（XZ68-4）為父本雜交構(gòu)建含有195 個(gè)家系的F9：10代RIL 群體，命名為YX-RIL。從HD-RIL 群體中隨機(jī)篩選出200 個(gè)家系，并與雙親作為供試材料，分別于2020年種植于海南樂東（E1），2021年分別種植于山西汾陽(yáng)（E2）和海南南濱（E3）；將YX-RIL群體與雙親分別于2020年種植于山西汾陽(yáng)（E4）和海南樂東（E1），2021年種植于山西汾陽(yáng)（E2）。四個(gè)環(huán)境均設(shè)置3次重復(fù)，行距35 cm，田間管理措施與常規(guī)田一致。

1.2 試驗(yàn)方法與測(cè)定指標(biāo)

利用山西農(nóng)業(yè)大學(xué)經(jīng)濟(jì)作物研究所花生分子生物實(shí)驗(yàn)室建立的花生芽期耐寒性鑒定方法和標(biāo)準(zhǔn)［6］，即以相對(duì)發(fā)芽率作為芽期耐寒性鑒定評(píng)價(jià)指標(biāo)。對(duì)雙親遠(yuǎn)雜9102、徐州68-4 及其YX-RIL 群體和雙親花育44、DF12 及其HD-RIL 群體中隨機(jī)篩選出的200 個(gè)家系，在4個(gè)環(huán)境種植收獲的種子進(jìn)行芽期耐寒性鑒定。

根據(jù)公式計(jì)算相對(duì)發(fā)芽率（relative germination rate，RGR）：

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010 整理數(shù)據(jù)，并作出頻率直方圖。

采用SPSS18.0軟件對(duì)兩個(gè)RIL 群體4個(gè)環(huán)境下的相對(duì)發(fā)芽率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

采用王靖天等［22］提供的主基因+多基因遺傳分析R軟件包SEAv2.0中的SEA-G3DH群體，對(duì)2個(gè)RIL群體4 個(gè)環(huán)境下的芽期耐寒性（相對(duì)發(fā)芽率）進(jìn)行遺傳分析，根據(jù)赤池信息量準(zhǔn)則（Akaike’s information criterion，AIC）值［23］和適合性檢驗(yàn)結(jié)合的方法選擇最適模型，AIC 值遵循最小或者較小原則，適合性檢驗(yàn)選擇統(tǒng)計(jì)量達(dá)到顯著水平個(gè)數(shù)最少的模型。該程序需要在R環(huán)境（https：//www.r-project.org/）下運(yùn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩個(gè)群體在不同環(huán)境下的耐寒性表現(xiàn)

對(duì)兩個(gè)RIL 群體的4 個(gè)親本在4 個(gè)環(huán)境下的相對(duì)發(fā)芽率進(jìn)行T 檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)父本的相對(duì)發(fā)芽率分別極顯著低于其對(duì)應(yīng)的母本（表1），說明親本屬于極端材料，可以使用主基因+多基因混合模型進(jìn)行遺傳分析［24］。兩個(gè)RIL 群體相對(duì)發(fā)芽率的最小值均低于父本，說明后代群體出現(xiàn)超親現(xiàn)象。后代家系群體的遺傳變異非常豐富，且表現(xiàn)為連續(xù)變異，HD-RIL群體在3個(gè)環(huán)境下的變異系數(shù)分別為59.68%、33.44%、39.43%，YX-RIL群體在3個(gè)環(huán)境下的變異系數(shù)分別為63.12%、47.93%、43.94%。兩個(gè)RIL群體的偏度和峰度的絕對(duì)值均小于1，符合典型數(shù)量性狀分布的特征。圖1、2均直觀地顯示出兩個(gè)群體相對(duì)發(fā)芽率符合正態(tài)分布特性，可以進(jìn)行后續(xù)的遺傳分析。

圖1 HD-RIL群體相對(duì)發(fā)芽率在E1、E2、E3環(huán)境中的頻率分布Fig.1 Frequency distribution for relative germination rate in HD-RIL population at E1、E2、E3

表1 不同群體相對(duì)發(fā)芽率的統(tǒng)計(jì)分析Table 1 Statistical analysis of relative germination rate in different populations/%

2.2 兩個(gè)RIL 群體不同環(huán)境下相對(duì)發(fā)芽率備選模型的選擇

將兩個(gè)組合的親本及RIL 群體4 個(gè)環(huán)境下的相對(duì)發(fā)芽率輸入csv 格式的文件中，該文件第一行顯示為群體類型（P1、P2、DH），從第二行起顯示為觀測(cè)值（相對(duì)發(fā)芽率）。將準(zhǔn)備好的csv 格式文件上傳到分析軟件中，運(yùn)行該程序，得到一份包含38 個(gè)模型的極大似然函數(shù)值、AIC 值、P1 和P2 的平均值、RIL 群體的各成分分布平均數(shù)及其分布比例、一階參數(shù)的估計(jì)值、二階參數(shù)的估計(jì)值、適合性檢驗(yàn)等數(shù)據(jù)的分析結(jié)果（表2）。

表2 不同群體相對(duì)發(fā)芽率備選模型的極大似然函數(shù)值和AIC值Table 2 MLV and AIC values of candidate models for relative germination rate in different populations

圖2 YX-RIL群體相對(duì)發(fā)芽率在E1、E2、E4環(huán)境中的頻率分布Fig.2 Frequency distribution for relative germination rate in YX-RIL population at E1、E2、E4

選取AIC 值最小及其接近最小AIC 值的模型作為備選模型。如HD-RIL 群體的相對(duì)發(fā)芽率在E1 環(huán)境中AIC 值最小為1 949.485，對(duì)應(yīng)模型為MX3-AI-A，3MG-AI、4MG-AI、MX2-IE-A、MX2-CE-A 四個(gè)模型的AIC 值分別為1 952.416、1 953.648、1 954.050、1 954.186，接近最小AIC值，這5個(gè)模型作為備選模型，其他組合的相對(duì)發(fā)芽率在不同環(huán)境中的備選模型選擇方法與上述相同。

2.3 適合性檢驗(yàn)及其最適模型選擇

選好5 個(gè)備選模型，對(duì)其進(jìn)行適合性檢驗(yàn)（均勻性檢驗(yàn)和K-S 檢驗(yàn)），結(jié)果見表3。HD-RIL 群體在E1 環(huán)境中5個(gè)備選模型MX3-AI-A、3MG-AI、4MG-AI、MX2-IE-A、MX2-CE-A 統(tǒng)計(jì)量達(dá)到顯著性水平的個(gè)數(shù)依次為2、5、2、2、2，根據(jù)AIC值最小且統(tǒng)計(jì)量達(dá)到顯著性水平個(gè)數(shù)最少的原則，最適模型為MX3-AI-A，即3 對(duì)加性上位性主基因+加性多基因控制；E2 環(huán)境中5 個(gè)備選模型MX2-ED-A、MX2-ER-A、4MG-EEEA、MX3-AI-A、MX1-A-AI 統(tǒng)計(jì)量達(dá)到顯著性水平的個(gè)數(shù)依次為0、0、0、0、0，最適模型為MX2-ED-A，即2 對(duì)顯性上位主基因+加性多基因控制；E3 環(huán)境中5 個(gè)備選模型MX2-ED-A、MX2-ER-A、MX2-AI-A、MX2-AI-AI、MX2-AE-A 統(tǒng)計(jì)量達(dá)到顯著性水平的個(gè)數(shù)依次分別為1、1、1、1、0，最適模型為MX2-AE-A，即2 對(duì)累加作用的主基因+加性多基因控制。

表3 不同群體相對(duì)發(fā)芽率備選模型的的適合性檢驗(yàn)Table 3 Adaptability test of candidate models for relative germination rate in different population

YX-RIL 群體在E4 環(huán)境中5 個(gè)備選模型MX2-AE-A、MX2-IE-A、MX2-CE-A、MX1-A-AI、MX2-AIA 統(tǒng)計(jì)量達(dá)到顯著性水平的個(gè)數(shù)依次為0、0、0、0、0，最適模型為MX2-AE-A，即2 對(duì)累加作用的主基因+加性多基因控制；E1 環(huán)境中5 個(gè)備選模型MX3-AI-A、4MG-AI、3MG-AI、MX1-A-AI、MX2-AI-AI 統(tǒng)計(jì)量達(dá)到顯著性水平的個(gè)數(shù)依次為0、3、5、0、0，最適模型為MX3-AI-A，即3 對(duì)加性上位性主基因+加性多基因控制；E2 環(huán)境中5 個(gè)備選模型MX2-AE-A、MX2-AI-A、MX2-ED-A、MX2-ER-A、4MG-AI 統(tǒng)計(jì)量達(dá)到顯著性水平的個(gè)數(shù)依次為1、1、0、0、2，最適模型為MX2-ED-A，即2 對(duì)顯性上位主基因+加性多基因控制。

2.4 兩個(gè)群體相對(duì)發(fā)芽率最適模型的遺傳參數(shù)估計(jì)

由表4 可知，HD-RIL 群體在E1 環(huán)境中，控制相對(duì)發(fā)芽率的第1 對(duì)主基因的加性效應(yīng)值（da）為-9.26，第2 對(duì)主基因的加性效應(yīng)值（db）為-3.41，第3 對(duì)主基因的加性效應(yīng)值（dc）為-9.24，3 對(duì)主基因的加性效應(yīng)值均為負(fù)數(shù)，具有負(fù)向效應(yīng)，3 對(duì)主基因中兩兩主基因之間的加性效應(yīng)互作值［iab（i*）、iac、ibc］分別為7.51、13.33、7.53，3 對(duì)主基因之間的加性效應(yīng)互作值（iabc）為6.76，|da|+|db|+|dc|＜|iab|+|iac|+|ibc|+|iabc|，說明控制相對(duì)發(fā)芽率的3 對(duì)主基因的上位性效應(yīng)大于加性效應(yīng)，以上位性效應(yīng)為主，多基因加性效應(yīng)值（［d］）為-12.16，為負(fù)向效應(yīng)，主基因遺傳率（h2mg）為86.72%。E2 環(huán)境中，第1 對(duì)主基因的加性效應(yīng)值（da）為-0.15，第2 對(duì)主基因的加性效應(yīng)值（db）為-23.64，說明第2 對(duì)主基因的加性效應(yīng)占據(jù)主導(dǎo)地位，多基因加性效應(yīng)值（［d］）為-14.88，主基因遺傳率（h2mg）為74.35%，多基因遺傳率（h2pg）為14.16%。E3 環(huán)境中，第1 對(duì)主基因的加性效應(yīng)值（da）為-5.63，2 對(duì)主基因的加性互作效應(yīng)值［iab（i*）］為13.58，多基因加性效應(yīng)值（［d］）為-14.97，主基因遺傳率（h2mg）為64.20%。

表4 不同群體相對(duì)發(fā)芽率最適模型的遺傳參數(shù)Table 4 The estimates of genetic parameters of the optimal models for relative germination rate in different population

表3（續(xù)）

YX-RIL 群體在E4 環(huán)境中，控制相對(duì)發(fā)芽率的第1對(duì)主基因的加性效應(yīng)值（da）為-3.98，2對(duì)主基因的加性互作效應(yīng)值（iab）為14.11，多基因加性效應(yīng)值（［d］）為-23.18，主基因遺傳率（h2mg）為59.05%，多基因遺傳率（h2pg）為32.24%。E1 環(huán)境中，控制相對(duì)發(fā)芽率的第1 對(duì)主基因的加性效應(yīng)值（da）為-7.06，第2 對(duì)主基因的加性效應(yīng)值（db）為-3.37，第3 對(duì)主基因的加性效應(yīng)值（dc）為-6.30，3對(duì)主基因的加性效應(yīng)值均為負(fù)數(shù)，具有負(fù)向效應(yīng)，3 對(duì)主基因中兩兩主基因之間的加性效應(yīng)互作值［iab（i*）、iac、ibc］分別為9.56、12.46、8.87，3 對(duì)主基因之間的加性效應(yīng)互作值（iabc）為6.33，|da|+|db|+|dc|＜|iab|+|iac|+|ibc|+|iabc|，說明控制相對(duì)發(fā)芽率的3 對(duì)主基因的上位性效應(yīng)大于加性效應(yīng)，以上位性效應(yīng)為主，多基因加性效應(yīng)值（［d］）為-16.89，為負(fù)向效應(yīng)，主基因遺傳率（h2mg）為91.46%，多基因遺傳率（h2pg）為5.20%。E2 環(huán)境中，第1 對(duì)主基因的加性效應(yīng)值（da）為-2.39，第2 對(duì)主基因的加性效應(yīng)值（db）為-24.63，說明第2對(duì)主基因的加性效應(yīng)占據(jù)主導(dǎo)地位，多基因加性效應(yīng)值（［d］）為-19.02，主基因遺傳率（h2mg）為79.56%，多基因遺傳率（h2pg）為18.38%。

3 討論

前人研究表明，在花生耐寒性育種中僅利用栽培花生來培育品種會(huì)增加耐寒性育種的難度，如果利用野生花生來改良栽培花生的耐寒性［25］，育種成功率會(huì)大幅度提高。本研究采用的兩個(gè)RIL 群體的母本花育44和遠(yuǎn)雜9102均具有野生花生的基因［26-27］，可以在后代家系群體篩選出耐寒性強(qiáng)且綜合性狀優(yōu)良的花生品系，為拓寬耐寒性花生育種的遺傳背景提供材料基礎(chǔ)。

本研究利用主基因+多基因混合模型分析軟件中SEA-G3DH 群體對(duì)兩個(gè)RIL 群體的耐寒性性狀指標(biāo)相對(duì)發(fā)芽率進(jìn)行遺傳分析，發(fā)現(xiàn)4 個(gè)環(huán)境中的最適模型并不一致，兩個(gè)群體耐寒性性狀在E1環(huán)境中均表現(xiàn)為3 對(duì)加性上位性主基因+加性多基因控制，在E2 環(huán)境中均表現(xiàn)為2 對(duì)顯性上位主基因+加性多基因控制，HD-RIL 群體在E3 環(huán)境中與YX-RIL 群體在E4 環(huán)境中耐寒性性狀均表現(xiàn)為2 對(duì)累加作用的主基因+加性多基因控制，同一環(huán)境下不同群體表現(xiàn)一致，同一群體在不同環(huán)境下表現(xiàn)不同，更能說明花生芽期耐寒性易受到環(huán)境的影響。Wynne 等［28］認(rèn)為自花授粉的花生可以通過純合的基因來固定加性效應(yīng)，由此可知，在后續(xù)耐寒性花生育種中可以利用這種加性效應(yīng)。

決定作物遺傳性狀的基因是由遺傳效應(yīng)較大的主基因和遺傳效應(yīng)較小的多基因組成的［29-30］。利用主基因+多基因混合遺傳模型對(duì)表型性狀進(jìn)行遺傳分析不僅可以預(yù)估基因的整體效應(yīng)，還能估算出主基因和多基因各自的效應(yīng)值［31］。將遺傳分析結(jié)果與數(shù)量性狀基因座（quantitative trait locus，QTL）初定位結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，可以互相驗(yàn)證彼此的準(zhǔn)確性。劉海龍等［32］對(duì)花生RIL 群體的耐低溫性狀進(jìn)行QTL 初定位，發(fā)現(xiàn)4 個(gè)主效QTL。本研究發(fā)現(xiàn)耐寒性性狀由2 對(duì)或者3 對(duì)主基因+加性多基因控制，可能原因?yàn)檠芯坎牧系倪z傳背景不同，且試驗(yàn)環(huán)境不一致。下一步可利用HDRIL 群體和YX-RIL 群體對(duì)耐寒性性狀進(jìn)行QTL 初定位，為全面了解耐寒性性狀的遺傳規(guī)律提供理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

兩個(gè)群體耐寒性性狀在E1 環(huán)境中均表現(xiàn)為3 對(duì)加性上位性主基因+加性多基因控制，在E2 環(huán)境中均表現(xiàn)為2 對(duì)顯性上位主基因+加性多基因控制，HDRIL 群體在E3 環(huán)境中與YX-RIL 群體在E4 環(huán)境中耐寒性性狀均表現(xiàn)為2 對(duì)累加作用的主基因+加性多基因控制。說明耐寒性性狀由2 對(duì)或者3 對(duì)主基因+加性多基因控制，而且以主基因控制為主。