李瑞麗，田 數(shù)，郭春生，李力群，陳 康，梁 淼，張峻松,*

（1.鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.內(nèi)蒙古昆明卷煙有限責(zé)任公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020）

香莢蘭（Vanilla planifoliaAndrews）屬蘭科，是典型的熱帶經(jīng)濟(jì)作物，作為重要的香原料，常以浸膏、酊劑、粉末等形式應(yīng)用于食品、化妝品等領(lǐng)域[1-3]，香蘭素被認(rèn)為是香莢蘭提取物最重要的香氣成分[4-5]。目前國(guó)內(nèi)外圍繞香莢蘭的研究主要集中于提取制備工藝[5-11]、提取物揮發(fā)性成分的分析方法[12-14]、產(chǎn)地及環(huán)境因素對(duì)香莢蘭成分及感官品質(zhì)的影響[15-20]等方面。與溶劑浸泡、超聲提取相比，微波提取法的香蘭素得率相對(duì)最高[5]。添加香草芽孢桿菌XY18和枯草芽孢桿菌XY20后香莢蘭豆的香蘭素含量（3.58%、3.48%）高于非微生物輔助腌制和常規(guī)腌制的香莢蘭豆（3.09%、3.21%）[8]。Sanchez等[11]采用高壓均質(zhì)法從香莢蘭提取物種制備無醇納米溶液，以提高溶解性和穩(wěn)定性。

香莢蘭提取物作為特色鮮明的天然香原料，已有以香莢蘭提取物中含量較高的成分或以不同香莢蘭提取物的共有成分作為其特征風(fēng)味物質(zhì)的研究報(bào)道[13-14]，鑒定出的特征風(fēng)味物質(zhì)主要有香蘭素、愈創(chuàng)木酚、香草酸、4-羥基苯甲醛、4-羥基苯甲酸等[13-14,21]，在研究體系中，含量較少的成分如果其閾值較低，也可能對(duì)特征風(fēng)味具有重要貢獻(xiàn)[22]，因此，僅以含量高低或是否為共有成分確定特征風(fēng)味物質(zhì)不夠嚴(yán)謹(jǐn)。

天然產(chǎn)物組成雖復(fù)雜，但對(duì)其風(fēng)格特征形成和彰顯具有決定作用的往往是關(guān)鍵內(nèi)在成分，感官導(dǎo)向結(jié)合組成成分定性定量分析是找出天然產(chǎn)物特征風(fēng)味物質(zhì)的重要方法[23-26]。操曉亮等[23]通過感官評(píng)價(jià)和成分分析鑒定了芳樟醇、橙花叔醇等22 種成分為鐵觀音茶葉的關(guān)鍵香氣物質(zhì)。閆新煥等[24]通過頂空固相微萃取氣相色譜嗅聞質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合感官分析和統(tǒng)計(jì)方法找出3-羥基-2-丁酮、2,5-二甲基-4-羥基-3(2H)-呋喃酮等18 種成分為熱風(fēng)干制紅棗的特征香氣物質(zhì)。目前鮮見以感官導(dǎo)向研究香莢蘭提取物特征風(fēng)味物質(zhì)的相關(guān)研究報(bào)道。香莢蘭特征風(fēng)味天然香原料在世界范圍內(nèi)早已供不應(yīng)求[27-28]，以感官導(dǎo)向結(jié)合組成成分分析研究香莢蘭提取物特征風(fēng)味物質(zhì)，旨在為香莢蘭特征風(fēng)味天然香原料的品質(zhì)穩(wěn)定性監(jiān)控提供物質(zhì)基礎(chǔ)，為香莢蘭特征風(fēng)味香原料的復(fù)配調(diào)制提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海南產(chǎn)香莢蘭豆莢 蒙昆香精香料公司；己酸乙酯、乳酸乙酯、糠醛、5-甲基糠醛、乙酰丙酸乙酯、糠醇、丁二酸二乙酯、愈創(chuàng)木酚、2-甲氧基-4-甲基苯酚、苯酚、二氫-3-羥基-4,4-二甲基-2(3H)-呋喃酮、肉桂酸甲酯、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、4-甲氧基苯甲醇、香草醇乙醚、5-羥甲基糠醛、4-(乙氧基甲基)苯酚、香蘭素、香草酸乙酯、香草乙酮、高香草酸乙酯、香草醇、丁香醛、4-羥基苯甲醇、4-羥基苯甲醛、異丁酸、異戊酸、丁二酸單乙酯、2-甲基丁酸、4-甲氧基苯甲酸、肉桂酸、香蘭酸、乙酸、乳酸、丙酸蘇合香酯（標(biāo)準(zhǔn)品） 美國(guó)Acros Organics公司；甲醇、乙醇（均為色譜純） 美國(guó)TCI公司；去離子水 中國(guó)屈臣氏公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A/5975C氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用儀 美國(guó)Agilent公司；固相微萃?。╯olid phase microextraction，SPME）手柄、SPME萃取纖維頭（50/30 μm DVB/CAR/PDMS） 美國(guó)Supelco 公司；20 mL 帶聚四氟乙烯墊螺紋頂空瓶 美國(guó)CNW公司；冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Christ公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士Büchi公司；8894型超聲儀 美國(guó)Cole Parmer公司；Lab Dancer S25渦旋儀 德國(guó)IKA公司；CP2245電子天平（感量0.0001 g） 德國(guó)Sartorius公司；HH-S1型恒溫水浴鍋 鞏義市予華儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 香莢蘭提取物的制備

冷浸提取法：取剪碎至1 cm的香莢蘭豆莢原料，按照1∶5（g/mL）比例添加體積分?jǐn)?shù)65%的乙醇溶液，常溫冷浸3 個(gè)月后過濾，得到第1次冷浸濾液，然后分別按照1∶3和1∶2的比例，常溫各冷浸1 周后過濾，得到第2和第3次冷浸濾液，合并3 次濾液得到香莢蘭豆冷浸提取液，減壓蒸餾濃縮至干，即得香莢蘭提取物。

1.3.2 香莢蘭提取物組成成分分析

樣品前處理：1）直接進(jìn)樣法：稱取約0.1 g香莢蘭提取物樣品，加入10 mL甲醇，加塞密封渦旋振蕩5 min后，取上清液過0.45 μm有機(jī)膜，取1 μL進(jìn)行GC-MS分析；2）頂空-SPME-GC-MS（headspace-SPME-GC-MS，HS-SPME-GC-MS）前處理：稱取約0.5 g香莢蘭提取物置于20 mL頂空瓶中，加蓋密封，在室溫（25 ℃）下，將纖維頭預(yù)先老化的SPME針頭插入頂空瓶中，推出纖維頭，頂空吸附50 min后，立即取出SPME針頭并插入GC-MS進(jìn)樣口，于250 ℃下熱脫附4 min后抽回萃取纖維頭，同時(shí)GC-MS開始采集數(shù)據(jù)。

GC條件：DB-5MS色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣：He；恒流模式1.0 mL/min；升溫程序：50 ℃保持2 min，以8 ℃/min速率升至280 ℃，保持25 min；分流比15∶1；進(jìn)樣口溫度250 ℃；傳輸線溫度280 ℃。

MS條件：電子電離源；電離能量70 eV；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；質(zhì)量掃描范圍50～500 u；溶劑延遲4.8 min。

定性定量分析：根據(jù)Wiley12、NIST20質(zhì)譜庫檢索，結(jié)合保留指數(shù)比對(duì)，與質(zhì)譜庫中化合物的相似度不足80%的成分定性為未檢出。采用內(nèi)標(biāo)法建立各化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析。

1.3.3 香莢蘭提取物特征成分閾值及香氣活性值（odor activity value，OAV）分析

閾值測(cè)定：參照GB/T 22366—2008《感官分析 方法學(xué) 采用三點(diǎn)選配法（3-AFC）測(cè)定嗅覺、味覺和風(fēng)味覺察閾值的一般導(dǎo)則》中針對(duì)最優(yōu)估計(jì)閾值（best estimate threshold，BET）法[29]，組織10 位專業(yè)評(píng)委組成評(píng)價(jià)小組，通過3 點(diǎn)法對(duì)各成分的嗅覺閾值進(jìn)行評(píng)價(jià)，計(jì)算10 位評(píng)委評(píng)價(jià)BET值的幾何平均值記為該成分的嗅覺閾值。

OAV的計(jì)算：OAV為各化合物在提取物中質(zhì)量濃度（C）與嗅覺閾值（T）的比值，即OAV=C/T。

1.3.4 香莢蘭提取物及香氣重組樣品的感官評(píng)價(jià)

參照GB/T 10220—2012《感官分析 方法學(xué) 總論》[30]，組織10 位專業(yè)評(píng)委組成感官評(píng)價(jià)小組，按照嗅香評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)（表1）對(duì)樣品進(jìn)行香氣評(píng)價(jià)，計(jì)算10 位評(píng)委對(duì)樣品某香韻賦分的幾何平均值記為該樣品該香韻指標(biāo)的得分值。參照文獻(xiàn)[31]計(jì)算重組樣品與香莢蘭提取物的感官相似度。

表1 嗅香評(píng)價(jià)賦分Table 1 Criteria for sensory aroma evaluation

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016以3 次重復(fù)的實(shí)驗(yàn)均值計(jì)算重要香氣成分的OAV；采用Origin 9.1繪制香莢蘭提取物及關(guān)鍵香氣成分重組樣品的香氣輪廓雷達(dá)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 香莢蘭提取物的組成成分

香莢蘭提取物樣品直接進(jìn)樣和HS-SPME進(jìn)樣的GC-MS定性分析結(jié)果分別見表2、3。直接進(jìn)樣法共檢出62 種香氣成分，HS-SPME-GC-MS法共檢出45 種香氣成分，與直接進(jìn)樣法相比，HS-SPME-GC-MS獲得的揮發(fā)性化合物種類相對(duì)較少。2 種方法檢出的共有成分有24 種，主要是香蘭素、愈創(chuàng)木酚、香草醇乙醚、4-甲氧基苯甲醇、4-羥基苯甲醛、糠醛、5-甲基糠醛、苯酚、2-甲氧基-4-甲基苯酚、4-(乙氧基甲基)苯酚等。HS-SPME對(duì)沸點(diǎn)較低、揮發(fā)性較強(qiáng)的成分更為敏感，與直接進(jìn)樣法形成互補(bǔ)，從香莢蘭提取物中共檢出83 種香氣成分。黎強(qiáng)等[14]利用HS-SPME-GC-MS分析海南、福建、印度尼西亞等產(chǎn)地的香莢蘭樣品，發(fā)現(xiàn)其香氣化合物為44～57 種不等，其中，香蘭素、愈創(chuàng)木酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚、糠醛等香氣化合物在不同產(chǎn)地樣品中均有檢出，這可能是對(duì)香莢蘭特征風(fēng)味有重要貢獻(xiàn)的香氣化合物。

表2 香莢蘭提取物樣品的GC-MS定性分析結(jié)果Table 2 Results of qualitative analysis of aroma components in vanilla extract by GC-MS

續(xù)表2

表3 香莢蘭提取物的HS-SPME-GC-MS定性分析結(jié)果Table 3 Results of qualitative analysis of vanilla extract by HS-SPME-GC-MS

續(xù)表3

2.2 香莢蘭提取物香韻特征及主要香氣成分分析

由圖1可知，香莢蘭提取物具有明顯的奶香、甜香、煙熏香和酸香，并帶膏香、焦香、豆香和辛香的香韻特征。香莢蘭提取物檢出的83 種香氣成分中，以香莢蘭提取物感官評(píng)價(jià)的香韻特征為導(dǎo)向，結(jié)合化合物的香氣特性，篩選與香莢蘭提取物特征風(fēng)味密切相關(guān)的34 種成分。

圖1 香莢蘭提取物的感官評(píng)價(jià)Fig.1 Sensory evaluation results of vanilla extract

感官評(píng)價(jià)小組對(duì)34 種化合物標(biāo)準(zhǔn)品在乙醇介質(zhì)中的嗅香評(píng)價(jià)結(jié)果（表4）表明，香蘭素、乳酸乙酯、香草酸乙酯、香草醇乙醚、香草醇、香蘭酸、糠醇等11 種化合物具有奶香特征；己酸乙酯、肉桂酸甲酯、乙酰丙酸乙酯、糠醛、5-甲基糠醛、5-羥甲基糠醛、香蘭素等16 種化合物具有甜香特征；苯酚、愈創(chuàng)木酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、4-(乙氧基甲基)苯酚等5 種化合物具有煙薰香特征；乙酸、乳酸、異戊酸、異丁酸、丁二酸單乙酯5 種化合物具有酸香特征；肉桂酸、香草醇、4-羥基苯甲醇、4-甲氧基苯甲酸4 種化合物具有膏香特征；糠醛、糠醇、5-甲基糠醛、5-羥甲基糠醛、4-羥基苯甲醛、二氫-3-羥基-4,4-二甲基-2(3H)-呋喃酮、香草酸乙酯等8 種化合物具有焦香特征；香蘭素、香草乙酮等化合物具有豆香特征；2-甲氧基-4-甲基苯酚、丁香醛、4-甲氧基苯甲酸等化合物具有辛香特征。多個(gè)化合物對(duì)同一種香韻特征有貢獻(xiàn)，如有16 種化合物具有甜香香韻特征。同一種化合物對(duì)多個(gè)香韻特征有貢獻(xiàn)，如香蘭素涵蓋奶香、甜香及豆香；綜合來看，這些香氣成分基本能反映香莢蘭提取物的奶香、甜香、煙熏香、酸香、膏香、焦香、豆香及辛香等香韻特征，初判為對(duì)香莢蘭提取物特征風(fēng)味有重要貢獻(xiàn)的香氣成分。

表4 香莢蘭提取物中重要成分的香氣描述Table 4 Aroma description of important volatile components in vanilla extract

2.3 主要香氣成分對(duì)香莢蘭提取物特征風(fēng)味的貢獻(xiàn)度分析

對(duì)復(fù)雜天然香原料，檢出其成分組成后，需進(jìn)一步確定各成分對(duì)整體風(fēng)味特征的貢獻(xiàn)度大小。OAV是表征貢獻(xiàn)度的重要指標(biāo)，在體系中香氣成分的OAV越大，則說明其對(duì)風(fēng)味特征的貢獻(xiàn)越大，當(dāng)香氣成分的OAV小于1時(shí)，認(rèn)為其對(duì)體系風(fēng)味的貢獻(xiàn)度較小，可以忽略不計(jì)。通過比較各香氣成分的OAV，找出對(duì)香氣體系起重要作用的關(guān)鍵成分[14-16]。

由表5可知，香蘭素的含量高，閾值低，OAV遠(yuǎn)高于其他香氣成分，是香莢蘭特征風(fēng)味的關(guān)鍵香氣物質(zhì)。這與Pérez-Silva等[32]的研究結(jié)果較為一致，香莢蘭豆提取物中香草醛的含量遠(yuǎn)高于愈創(chuàng)木酚等化合物。4-(乙氧基甲基)苯酚、愈創(chuàng)木酚的含量較高，閾值較低，OAV均大于20，對(duì)香莢蘭特征風(fēng)味的貢獻(xiàn)較大。4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的含量較低，但閾值也較低，尤其是異戊酸，含量最低，但其閾值很低，OAV也較高，這些也是對(duì)香莢蘭特征風(fēng)味有較大貢獻(xiàn)的重要香氣成分。綜合來看，香蘭素、4-(乙氧基甲基)苯酚、愈創(chuàng)木酚、乙酸、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、香草醇乙醚、乳酸乙酯、乳酸、異戊酸、苯酚、4-羥基苯甲醛、2-甲氧基-4-甲基苯酚、4-羥基苯甲醇、香草醇等成分的OAV均大于1，判斷其為對(duì)香莢蘭提取物特征風(fēng)味有重要貢獻(xiàn)的特征香氣成分組群。

表5 香莢蘭提取物中各主要香氣成分的含量、閾值及OAVTable 5 Contents,thresholds and OAVs of major aroma components in vanilla extracts

2.4 基于特征香氣組群的香莢蘭特征風(fēng)味重構(gòu)

香莢蘭提取物中香蘭素、4-(乙氧基甲基)苯酚、愈創(chuàng)木酚、乙酸、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、香草醇乙醚、乳酸乙酯、乳酸、異戊酸、苯酚、4-羥基苯甲醛、2-甲氧基-4-甲基苯酚、4-羥基苯甲醇、香草醇14 種成分的OAV均大于1，構(gòu)成了香莢蘭提取物的特征香氣成分組群。以這些關(guān)鍵香氣成分在香莢蘭提取物中的自然含量，經(jīng)歸一化處理后進(jìn)行化學(xué)重組。由重組樣品及香莢蘭提取物樣品的感官評(píng)價(jià)結(jié)果（圖2）可知，關(guān)鍵香氣成分重組樣品具有與香莢蘭提取物相似的整體香氣特征，具有明顯的奶香、甜香、煙熏香和酸香等典型特征，香莢蘭特征香氣風(fēng)格的辨識(shí)度較高。重組樣品與香莢蘭提取物的感官相似度高達(dá)92.33%，說明基于特征香氣成分組群可模擬香莢蘭提取物的香氣特征，同時(shí)，也驗(yàn)證了基于OAV找出的香莢蘭提取物的特征香氣成分組群是香莢蘭天然香原料特征風(fēng)味的物質(zhì)基礎(chǔ)。

圖2 關(guān)鍵香氣成分重組樣品與香莢蘭提取物的香氣輪廓雷達(dá)圖Fig.2 Radar chart of aroma profiles of recombination sample of key aroma compounds and vanilla extract

3 結(jié)論

香莢蘭提取物具有明顯的奶香、甜香、煙熏香和酸香的特征香韻，且略帶膏香、焦香、豆香和辛香的香韻特征。HS-SPME-GC-MS與直接進(jìn)樣的GC-MS法從香莢蘭提取物中共檢出83 種香氣成分。根據(jù)香莢蘭提取物香韻特征和各化合物香氣特性初判有34 種成分與香莢蘭提取物特征風(fēng)味密切相關(guān)，其中，香蘭素、4-(乙氧基甲基)苯酚、愈創(chuàng)木酚、乙酸、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、香草醇乙醚等14 種成分的OAV均大于1，尤其是香蘭素，OAV遠(yuǎn)高于其他成分。經(jīng)香氣重組實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，14 種關(guān)鍵香氣成分的重組樣品與香莢蘭提取物的感官相似度高，香莢蘭特征香氣風(fēng)格辨識(shí)度明顯，具有香莢蘭樣的奶香、甜香、煙熏香和酸香等典型的風(fēng)格特征，且重組樣品的整體香勢(shì)比香莢蘭提取物略高。因此，判定香蘭素、4-(乙氧基甲基)苯酚、愈創(chuàng)木酚、乙酸、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、香草醇乙醚、乳酸乙酯、乳酸、異戊酸、苯酚、4-羥基苯甲醛、2-甲氧基-4-甲基苯酚、4-羥基苯甲醇、香草醇為香莢蘭提取物的特征風(fēng)味物質(zhì)。以感官導(dǎo)向結(jié)合成分分析明確香莢蘭提取物特征風(fēng)味物質(zhì)，可為香莢蘭特征風(fēng)味天然香原料的質(zhì)控提供基礎(chǔ)支撐，同時(shí)，可為香莢蘭特征風(fēng)味的復(fù)配重構(gòu)提供技術(shù)指導(dǎo)，為緩解香莢蘭特征風(fēng)味天然香原料的供需矛盾提供新的解決途徑。基于關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)復(fù)配調(diào)制的香莢蘭特征風(fēng)味香精在烘焙、飲品等不同類型食品中的應(yīng)用效果仍需進(jìn)一步實(shí)踐驗(yàn)證。