湯曉，馬明

（1.寧波職業(yè)技術(shù)學(xué)院化學(xué)工程學(xué)院，浙江 寧波 315800；2.寧波中盛產(chǎn)品檢測有限公司，浙江 寧波 315800）

我國是世界上最大的水產(chǎn)品生產(chǎn)國與出口國，魚類是水產(chǎn)品消費中的主要大類。魚肉因其營養(yǎng)物質(zhì)含量豐富，容易滋生微生物，促進(jìn)酶的生長，從而導(dǎo)致腐敗變質(zhì)。為延長魚類貨架期，常用的保鮮方法是低溫冷藏與化學(xué)保鮮技術(shù)。低溫冷藏技術(shù)往往貯藏期短、能耗大，且對魚肉品質(zhì)有一定影響[1]。化學(xué)保鮮劑使用過量或殘留，則會對人體健康以及環(huán)境安全產(chǎn)生負(fù)面影響[2]。相比之下，天然保鮮劑是目前國內(nèi)外食品保鮮領(lǐng)域的研究熱點之一，它們可通過抑制微生物的生長、降低水產(chǎn)品體內(nèi)的酶活性、延緩氧化速度、降低水分揮發(fā)等作用來延長魚類保存期，且成本較低、綠色環(huán)保[3-4]。

荷葉、箬葉、蘆葦葉、槲葉等植物是我國南北各地區(qū)常見的粽葉材料，這些植物不僅能賦予食物特殊的香味，也因為含有多酚類化合物、揮發(fā)油、萜類化合物等生物活性成分而能抑制食物中細(xì)菌、霉菌、真菌等微生物的生長[5-7]。這些活性成分還具有抑制脂質(zhì)過氧化物酶活性、清除各類自由基等抗氧化功能[8-11]。盡管荷葉、箬葉、蘆葦葉、槲葉具有抑菌、抗氧化的功效，但目前尚未有報道系統(tǒng)研究它們在魚肉保鮮中的應(yīng)用。本文在前期分析幾種粽葉多酚提取物成分[12]、抗氧化性能[12]與抑菌活性的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討它們對魚肉的保鮮效果，以期為我國傳統(tǒng)的粽葉材料在天然食品保鮮劑中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

槲葉：產(chǎn)自河南南陽；蘆葦葉：產(chǎn)自江蘇駱馬湖；箬葉：產(chǎn)自安徽黃山；荷葉：產(chǎn)自山東微山湖，室溫（30℃～36℃）自然干燥。活草魚：市售。

乙醇、氧化鎂、硼酸、鹽酸、甲基紅指示劑、溴甲酚綠指示劑（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；XAD-8大孔樹脂：北京寰宇科創(chuàng)生物科技發(fā)展有限公司；食品級溶菌酶（18 000 U/mg）：江西華豫源生物科技有限公司；殼聚糖：湖北如天生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LGJ-10C型冷凍干燥機(jī)：北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司；RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；KH30R-II臺式通用高速冷凍離心機(jī)：廣州越特科學(xué)儀器有限公司；SB-80超聲波清洗機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；60 mm布氏漏斗：江蘇順和教學(xué)儀器有限公司；80目標(biāo)準(zhǔn)篩：紹興市上虞紗篩廠；XL-60C中藥粉碎機(jī)：廣州市旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司；SW-CJ-2FD型潔凈工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；弗魯克FA25均質(zhì)機(jī)：上海右一儀器有限公司；K8400型全自動凱氏定氮儀：福斯分析儀器（蘇州）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 植物多酚提取物的制備

將干燥荷葉、箬葉、槲葉、蘆葦葉分別粉碎后，過80目篩。分別稱取10 g干燥荷葉、箬葉、槲葉、蘆葦葉粉末，按照料液比1∶20（g/mL）加入80%乙醇，在超聲功率80 W、溫度45℃下超聲輔助提取50 min，提取兩次，合并提取液。在4℃下10 000 r/min離心20 min，收集上清液。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮上清液，用0.45 μm微孔濾膜過濾。再用XAD-8大孔樹脂純化上清液，上樣流速1.0 mL/min，上樣濃度2.5 mg/mL，以60%乙醇溶液為洗脫液，以1.5 mL/min流速收集洗脫液，洗脫液體積180 mL。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮洗脫液，-60℃冷凍干燥48 h，粉末置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆肹13-14]。

1.3.2 抗菌液的制備

用去離子水溶解4種粽葉提取物粉末，制成抗菌液，使其濃度分別為30、60 mg/mL。以兩種天然抗菌劑（溶菌酶、殼聚糖）為陽性對照，用無菌水分別調(diào)節(jié)其濃度至0.05%、1%。

1.3.3 魚片處理

活草魚宰殺后去鱗、洗凈，取脊背肉切片，每片約20g，冰盒保存后立即送至實驗室。用無菌水沖洗后，在無菌鋼絲網(wǎng)上瀝干待用。依次放入制備好的荷葉、箬葉、槲葉、蘆葦葉、溶菌酶、殼聚糖抗菌液中，浸泡30 min。取出后在無菌鋼絲網(wǎng)上瀝干，放入無菌袋中，置于4℃冰箱貯藏。連續(xù)9 d取樣進(jìn)行各項指標(biāo)測定，感官評定每2 d進(jìn)行1次。以無菌水浸泡的魚片作空白對照。

1.3.4 保鮮效果的測定

1.3.4.1 菌落總數(shù)測定

參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定》進(jìn)行菌落總數(shù)測定[15]。

1.3.4.2 pH值的測定

稱取10 g絞碎的魚樣品，在100 mL去離子中均質(zhì)5 min，將混合物過濾，使用pH計測定濾液的pH值[16]。

1.3.4.3 揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）值的測定

參照GB 5009.228—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中揮發(fā)性鹽基總氮的測定》進(jìn)行揮發(fā)性鹽基氮（TVBN）值測定[17]。

1.3.4.4 硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）值的測定

稱取2.0 g絞碎的魚樣品放入試管中，加入硫代巴比妥酸溶液3 mL、三氯乙酸-鹽酸溶液17 mL混勻，沸水浴加熱30min，迅速冷卻至室溫25℃。吸取反應(yīng)后的樣品5 mL，加入等體積氯仿，3 000 r/min離心10 min，在532 nm處測定上清液的吸光度。硫代巴比妥酸值以每千克脂質(zhì)氧化樣品中丙二醛的質(zhì)量表示[18]，計算公式如下。

式中：A532為樣品的吸光度；M為樣品的質(zhì)量，g；9.48為從紅色TBA反應(yīng)產(chǎn)物的稀釋系數(shù)和摩爾消光系數(shù)152 000 L/（mol·cm）得出的常數(shù)。

1.3.4.5 感官評定

草魚魚片的感官評定由10名經(jīng)過感官評定培訓(xùn)的人員共同完成。評定標(biāo)準(zhǔn)如表1所示，每項指標(biāo)的滿分為10分。

表1 4℃貯藏條件下草魚魚片的感官評定指標(biāo)Table 1 Sensory evaluation indexes of grass carp fillets stored at 4℃

1.3.5 數(shù)據(jù)處理與分析

所有試驗均重復(fù)3次，采用單因素方差分析結(jié)果（ANOVA），使用IBM SPSS 21.0軟件進(jìn)行結(jié)果的差異顯著性分析，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種粽葉提取物對微生物的影響

草魚片在冷藏過程中的菌落總數(shù)變化如表2所示。

表2 魚片冷藏過程中的菌落總數(shù)變化Table 2 Changes of total viable bacterial counts in fish fillets during cold storage

由表2可知，隨著冷藏時間的延長，生魚片中的菌落總數(shù)逐漸上升。用無菌水浸泡的對照組菌落總數(shù)上升最快，冷藏第4天時，生魚片中的菌落總數(shù)已達(dá)6.51 lg（cfu/g），超過 GB 10136—2015《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)動物性水產(chǎn)制品》規(guī)定的不大于6 lg（cfu/g）的腐敗限值標(biāo)準(zhǔn)[19]。而荷葉、箬葉、槲葉、蘆葦葉提取液以及溶菌酶、殼聚糖溶液處理均能在不同程度上抑制魚片中的微生物生長。冷藏第4天時，各抗菌液中的菌落總數(shù)均未超過標(biāo)準(zhǔn)值，最大值為5.90 lg（cfu/g）。冷藏第5天時，除低濃度箬葉、槲葉外，其他抗菌液中的菌落總數(shù)仍在標(biāo)準(zhǔn)值以下。冷藏第6天時，高濃度荷葉、高濃度蘆葦葉、溶菌酶抗菌液中的菌落總數(shù)保持低于標(biāo)準(zhǔn)值。冷藏第7天時，溶菌酶抗菌液中的菌落總數(shù)仍在標(biāo)準(zhǔn)值以下。冷藏8 d時，所有組菌落總數(shù)均超過6 lg（cfu/g）的腐敗限值標(biāo)準(zhǔn)。

在9 d冷藏期內(nèi)，槲葉、箬葉溶液之間，蘆葦葉、殼聚糖溶液之間的抑菌效果接近，而荷葉、溶菌酶溶液的抑菌效果則明顯高于其他抗菌液。由此可見，荷葉、蘆葦葉具有更強(qiáng)的抑菌作用，其抑菌效果與殼聚糖、溶菌酶這兩種天然抗菌劑相當(dāng)，且高濃度更有利于4種粽葉提取物發(fā)揮抑菌作用。童佩[20]利用最低抑菌濃度為10 mg/mL的五倍子提取液進(jìn)行草魚保鮮，其抑菌效果不及溶菌酶（P＜0.05），但與殼聚糖的抑菌效果接近（P＞0.05）。研究表明，五倍子中含有豐富的多酚類化合物，具有良好的抑菌效果，幾種粽葉中的多酚類物質(zhì)也較多[21]，由此推測，當(dāng)粽葉中的多酚類物質(zhì)達(dá)到一定濃度時，其抑菌作用可能更為有效。

2.2 4種粽葉提取物對pH值的影響

草魚片在冷藏過程中的pH值變化如表3所示。由表3可知，受魚肉體內(nèi)水解酶及微生物的影響，隨著冷藏時間的延長，生魚片中的pH值先下降后上升。用無菌水浸泡的對照組pH值變化最大，冷藏2 d后，pH值開始上升；冷藏4 d后，pH值上升較快，冷藏第9天的pH值與第4天相比，上升了7.94%。而荷葉、箬葉、槲葉、蘆葦葉提取液以及溶菌酶、殼聚糖溶液處理均能在不同程度上抑制魚片中的pH值變化。冷藏4 d后，pH值開始上升。其中，荷葉、溶菌酶、殼聚糖、高濃度蘆葦葉溶液對pH值升高的延緩效果明顯高于其他抗菌液。在冷藏后期，所有抑菌液組pH值上升的原因可能是生魚片中的組織蛋白酶被持續(xù)釋放，魚片中的微生物使抑菌液中的蛋白質(zhì)分解，產(chǎn)生氨、胺類等堿性物質(zhì)，從而引起pH值的升高[22]。

表3 魚片冷藏過程中的pH值變化Table 3 Changes of pH value in fish fillets during cold storage

低濃度槲葉與箬葉抗菌液延緩pH值升高的效果相當(dāng)，冷藏第4天的pH值均下降了3.28%，冷藏第9天的pH值與第4天相比，分別上升了5.48%、5.33%。高濃度槲葉與低濃度蘆葦葉抗菌液延緩pH值升高的效果相當(dāng)，冷藏第4天的pH值分別下降了2.99%、2.98%，冷藏第9天，pH值與第4天相比分別上升了5.03%、4.85%。高濃度箬葉延緩pH值升高的效果明顯高于高濃度槲葉，低濃度槲葉、箬葉與蘆葦葉抗菌液，冷藏第4天的pH值下降了2.99%，冷藏第9天的pH值與第4天相比，上升了4.21%。高濃度蘆葦葉與殼聚糖抗菌液延緩pH值升高的效果相當(dāng)，冷藏第4天的pH值分別下降了2.84%、2.83%，冷藏第9天，pH值與第4天相比分別上升了4.07%、3.89%。低濃度荷葉與溶菌酶抗菌液延緩pH值升高的效果相當(dāng)，冷藏第4天的pH值分別下降了2.86%、2.85%，冷藏第9天，pH值與第4天相比分別上升了4.08%、4.08%。高濃度荷葉抗菌液延緩pH值升高的效果最佳，冷藏第4天的pH值下降了2.38%，冷藏第9天的pH值與第4天相比，上升了4.07%。由此可見，4種粽葉提取物均能有效控制生魚片的pH值變化，可使pH值上升延緩2 d，且pH值升高緩慢。其中，高濃度蘆葦葉提取液、低濃度荷葉提取液對pH值升高的控制效果分別與殼聚糖、溶菌酶相當(dāng)，而低濃度荷葉提取液對pH值升高的控制效果則優(yōu)于溶菌酶。

Dai等[23]利用茶多酚浸泡魚片，可使魚片的pH值升高延遲1 d。邵東旭等[24]利用魚鱗膠原蛋白復(fù)合抗菌膜進(jìn)行魚肉保鮮，可使魚肉的pH值升高延遲2 d。曾維偉[25]利用乳酸菌細(xì)菌素進(jìn)行魚片保鮮，可使魚片的pH值升高延遲2 d～4 d。由此可見，與其他天然抑菌材料相比，4種粽葉提取物同樣可以有效控制生魚片中的pH值變化。

2.3 4種粽葉提取物對揮發(fā)性鹽基氮的影響

草魚片在冷藏過程中揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）值變化如表4所示。

表4 魚片貯藏過程中的TVB-N值變化Table 4 Changes of TVB-N value in fish fillets during cold storage

TVB-N值是動物性食品在貯藏過程中，由于肌肉中細(xì)菌和內(nèi)源性酶的相互作用，分解蛋白質(zhì)而產(chǎn)生的氨、胺類等堿性含氮物質(zhì)，可用于檢測水產(chǎn)品的腐敗變質(zhì)程度[26]。根據(jù)GB2733—2015《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)鮮、凍動物性水產(chǎn)品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定，淡水魚類TVB-N值可食用限量為≤20mg/100g[27]，而TVB-N值≤12mg/100 g的魚體可標(biāo)示為一級鮮度[28]。如表4所示，隨著冷藏時間的延長，各組生魚片中的TVB-N值均逐漸增大，抗菌液中的TVB-N值上升速度明顯低于對照組。對照組生魚片冷藏第6天時的TVB-N值已接近20 mg/100 g，第7天的TVB-N值則達(dá)到21.30 mg/100 g，超過了國家食用標(biāo)準(zhǔn)。所有抗菌液組生魚片冷藏第6天的TVBN值均小于11.5 mg/100 g，仍在一級鮮度范圍內(nèi)；冷藏第7天，高濃度蘆葦葉、荷葉、溶菌酶抗菌液中的TVB-N值仍小于12 mg/100 g；冷藏9 d內(nèi)，除低濃度槲葉組外，其他抗菌液組生魚片的TVB-N值均未超過20 mg/100 g。由此可見，4種粽葉提取物可有效抑制魚片中揮發(fā)性鹽基氮的產(chǎn)生，可使TVB-N值的限量值延遲2d以上出現(xiàn)。其中，高濃度荷葉提取液對揮發(fā)性鹽基氮的抑制效果明顯高于其他粽葉，且與溶菌酶的效果相當(dāng)，而高濃度蘆葦葉、低濃度荷葉提取液對揮發(fā)性鹽基氮的抑制效果則與殼聚糖相當(dāng)。

童佩[20]利用10 mg/mL五倍子提取物浸泡草魚，可使TVB-N值的限量值延遲2d出現(xiàn)。Dai等[23]利用2 g/L茶多酚浸泡魚片，可使TVB-N值的限量值延遲2 d以上出現(xiàn)。李應(yīng)洪等[29]利用50、100 mg/mL樟樹葉多酚涂抹草魚，可使TVB-N值的限量值延遲3 d～5 d出現(xiàn)。由此可見，不同植物提取物抑制草魚TVB-N值的濃度有所差異，這可能是與植物中的抑菌活性成分組成與含量有關(guān)。

2.4 4種粽葉提取物對硫代巴比妥酸值的影響

草魚片在冷藏過程中的硫代巴比妥酸（TBA）值變化如表5所示。

表5 魚片貯藏過程中的TBA值變化Table 5 Changes of TBA value in fish fillets during cold storage

TBA值是測定肉類及水產(chǎn)品脂肪氧化酸敗水平的指標(biāo)，用于評判肉類和水產(chǎn)品脂肪的氧化酸敗程度[30]。如表5所示，隨著冷藏時間的延長，各組生魚片中的TBA值均逐漸增大，抗菌液中的TBA值上升速度明顯低于對照組。對照組的TBA值在冷藏第2天后快速上升，冷藏第9天的TBA值達(dá)1.11 mg/kg，抗菌液中的每日TBA值增幅量幾乎均小于對照組。冷藏9 d內(nèi)，低濃度槲葉、箬葉、蘆葦葉抗菌液組生魚片的TBA值接近，高濃度槲葉、箬葉抗菌液中的TBA值與殼聚糖組接近，高濃度蘆葦葉抗菌液中的TBA值與溶菌酶組接近，兩種濃度荷葉抗菌液對生魚片的TBA值抑制效果最為明顯。由此可見，4種粽葉提取物均能有效延緩草魚片的TBA值上升，其中，荷葉、蘆葦葉提取物的延緩效果較佳，而荷葉提取物對脂肪氧化的抑制作用超過了殼聚糖及溶菌酶，推測原因，可能是由于這幾種粽葉中含有多種抗氧化活性成分，可以有效延緩魚肉中的脂肪氧化[8-11]。

2.5 4種粽葉提取物對感官品質(zhì)的影響

草魚片在冷藏過程中的氣味、顏色與質(zhì)地變化如表6所示。

表6 魚片貯藏過程中的感官指標(biāo)的變化Table 6 Changes of sensory index in fish fillets during cold storage

續(xù)表6 魚片貯藏過程中的感官指標(biāo)的變化Continue table 6 Changes of sensory index in fish fillets during cold storage

由表6可知，隨著冷藏時間的延長，各組生魚片的感官品質(zhì)逐漸下降，而對照組生魚片的感官品質(zhì)下降較快，與抗菌液組相比差異顯著（P＜0.05），尤其是氣味與質(zhì)地。冷藏第1天時，所有組的生魚片均有明顯的新鮮魚肉氣味，無異味，有紅色與白色肌肉色澤，肌肉致密，彈性恢復(fù)良好。冷藏第3天，除荷葉、殼聚糖、溶菌酶組外，其他組生魚片開始失去鮮味；對照組和箬葉組的質(zhì)地指標(biāo)也開始下降。冷藏第7天，對照組、低濃度槲葉組生魚片開始有腐敗氣味。除高濃度荷葉、溶菌酶組外，其他組生魚片的肌肉開始松軟，手指按壓后無法恢復(fù)原形。由此可見，4種粽葉提取物可在不同程度上保持生魚片的氣味與質(zhì)地，且高濃度時冷藏更有利。高濃度荷葉提取液對生魚片氣味、質(zhì)地的改善效果最佳，其對質(zhì)地的改善效果明顯優(yōu)于殼聚糖，對氣味的改善則明顯優(yōu)于殼聚糖、溶菌酶（P＜0.05）。高濃度蘆葦葉提取液對生魚片氣味、質(zhì)地的改善與殼聚糖接近（P＞0.05）。

與氣味、質(zhì)地不同，4種粽葉提取物對生魚片顏色的改善作用不及殼聚糖、溶菌酶，而且濃度提高時并未起到更好的效果，這可能是由于粽葉提取物溶液呈棕褐色，濃度越高顏色越深，因此在冷藏期內(nèi)對生魚片的顏色有一定影響。楊玲玲等[31]利用茶多酚延長魚肉腸的貨架期時，同樣發(fā)現(xiàn)呈現(xiàn)黃褐色的茶多酚會造成魚肉腸色澤的改變。

3 結(jié)論

利用荷葉、箬葉、蘆葦葉、槲葉4種常見粽葉材料的多酚提取物溶液進(jìn)行草魚片保鮮，可有效抑制魚肉中的微生物生長，控制魚肉pH值的變化，延緩魚肉中揮發(fā)性鹽基氮的釋放、硫代巴比妥酸值的變化，并保持生魚片的感官品質(zhì)，從而延長魚肉的保質(zhì)期。

荷葉提取物的抑菌效果明顯優(yōu)于其他粽葉，且荷葉、蘆葦葉提取物的抑菌效果與殼聚糖、溶菌酶這兩種天然抗菌劑相近，提高濃度可進(jìn)一步增強(qiáng)4種粽葉提取物的抑菌作用。與不經(jīng)處理的魚肉相比，4種粽葉提取物可使生魚片的pH值升高延緩2 d，蘆葦葉提取物對pH值升高的控制效果與殼聚糖相近，荷葉提取物對pH值升高的控制效果則好于溶菌酶。4種粽葉提取物可使生魚片的TVB-N限量值延遲2 d以上出現(xiàn)，荷葉提取物抑制揮發(fā)性鹽基氮的效果明顯高于其他粽葉，且高濃度荷葉提取液抑制揮發(fā)性鹽基氮的效果與溶菌酶相當(dāng)，而高濃度蘆葦葉提取液的效果則與殼聚糖相當(dāng)。荷葉、蘆葦葉提取物延緩生魚片TBA值上升的效果較佳，而荷葉提取物對脂肪氧化的抑制作用超過了殼聚糖、溶菌酶。荷葉提取物對生魚片氣味、質(zhì)地的改善效果最佳，對質(zhì)地的改善明顯優(yōu)于殼聚糖，對氣味的改善明顯優(yōu)于殼聚糖、溶菌酶（P＜0.05），蘆葦葉對生魚片氣味、質(zhì)地的改善與殼聚糖接近（P＞0.05），但4種粽葉提取物對生魚片顏色的改善作用不及殼聚糖、溶菌酶。由此可見，荷葉、箬葉、蘆葦葉、槲葉的多酚提取物可有效延長草魚片的保質(zhì)期，它們是潛在的天然食品保鮮劑。