楊婷婷，羅國柳，覃小麗，劉雄，鐘金鋒

（西南大學食品科學學院，重慶 400715）

麥醇溶蛋白（gliadin，Gli）是一種疏水性植物蛋白，因其具有良好的生物相容性、兩親性和可降解性，常作為生物活性成分載體應用于食品領域[1]。然而，分子間相互作用影響了麥醇溶蛋白的結(jié)構(gòu)和性能，進而影響其在食品中的應用[2-4]。有研究發(fā)現(xiàn)超聲（ultrasonics，U）可誘導蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，促進蛋白質(zhì)與配體之間的相互作用，從而影響蛋白質(zhì)-配體復合物的構(gòu)象和界面性質(zhì)[5]?，F(xiàn)有研究表明蛋白質(zhì)和配體之間的相互作用受配體物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)種類的影響[4，6]。因此，闡明不同結(jié)構(gòu)配體物質(zhì)對麥醇溶蛋白結(jié)構(gòu)的影響及其相互作用機制對提升麥醇溶蛋白加工品質(zhì)具有重要意義。

低分子糖作為食品加工中廣泛使用的小分子物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)構(gòu)象穩(wěn)定性和功能性質(zhì)的作用[7-8]。Huo等[9]探究了6種低分子糖對藻藍蛋白熱穩(wěn)定性的影響，發(fā)現(xiàn)甘露糖對藻藍蛋白熱降解的抑制作用最強。阿拉伯糖（arabinose，Ara）、果糖（fructose，F(xiàn)ru）和海藻糖（trehalose，Tre）是具有多個游離羥基基團的低分子糖，可以作為配體與麥醇溶蛋白結(jié)合生成復合物，進而影響麥醇溶蛋白的結(jié)構(gòu)和功能特性。然而，目前與低分子糖-蛋白質(zhì)復合物相關(guān)的研究主要集中在功能特性等宏觀性質(zhì)方面，對于分子層面相互作用機制的研究較少，如何從微觀層面闡明二者之間的相互作用機制仍需進一步探討。分子動力學（molecular dynamics，MD）模擬可從微觀層面揭示兩原子或分子之間的相互作用，從分子水平闡明復合物的形成機理，為宏觀性能指標提供理論支撐[10]。Feng等[11]通過MD模擬發(fā)現(xiàn)酚酸與麥醇溶蛋白之間的氫鍵和疏水相互作用促進了二者的結(jié)合。因此，通過MD模擬有助于揭示麥醇溶蛋白與Ara、Fru和Tre之間的相互作用及其復合物性能的調(diào)控機制。

本文旨在通過紅外光譜、熒光光譜、掃描電鏡、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresi，SDS-PAGE）電泳分析和乳化性測定考察不同種類低分子糖（Ara、Fru和Tre）與麥醇溶蛋白形成的復合物的結(jié)構(gòu)和性能，并借助MD模擬進一步分析低分子糖與麥醇溶蛋白相互作用的機制，以期為擴大低分子糖與麥醇溶蛋白復合物的應用范圍提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

谷阮粉（蛋白質(zhì)含量為75.0%）：新鄉(xiāng)良潤全谷物食品有限公司；麥醇溶蛋白：西南大學食品科學學院實驗室自提；阿拉伯糖（純度≥99.0%）、果糖（純度≥98%）、海藻糖（純度≥98%）：合肥博美生物科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

JY98-IIIDN型超聲波細胞粉碎機（探頭直徑20 mm）：寧波新芝生物科技股份有限公司；FD-1A-50型冷凍干燥機：北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；Spectrum Two紅外光譜儀：美國Perkin-Elmer公司；F-2500型熒光分光光度計：日本日立公司；Phenom Pro10102型掃描電鏡：荷蘭Phenom World公司；T18 ULTRATURRAX型高速均質(zhì)機：德國IKA公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鞏義市予華儀器有限責任公司；MX-S可調(diào)式漩渦振蕩器：大龍興創(chuàng)實驗儀器（北京）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 復合物的制備

分別用純水配制0.1 mol/L阿拉伯糖、果糖和海藻糖溶液，用70%乙醇溶液配制10 mg/mL麥醇溶蛋白溶液，磁力攪拌使其完全混合。取一定量混合液，用純水定容至300 mL，在300 W下超聲處理15 min，超聲過程利用冰水浴控制溶液溫度在30℃以下，處理完畢后，樣品冷凍干燥備用，分別制得超聲阿拉伯糖-麥醇溶蛋白復合物（ultrasonics-gliadin-arabinose，U-Gli-Ara）、超聲果糖-麥醇溶蛋白復合物（ultrasonics-gliadin-fructose，U-Gli-Fru）和超聲海藻糖-麥醇溶蛋白復合物（ultrasonics-gliadin-trehalose，U-Gli-Tre）。

1.3.2 紅外光譜的測定

將待測樣品與溴化鉀以質(zhì)量比1∶100混合研磨，壓制薄片，使用紅外光譜儀在波數(shù)4 000 cm-1～400 cm-1范圍內(nèi)采集圖譜，分辨率為4cm-1，總掃描次數(shù)為32次。

1.3.3 熒光光譜的測定

以天然麥醇溶蛋白為對照，使用熒光分光光度計測定超聲處理麥醇溶蛋白及其復合物的熒光光譜。固定激發(fā)波長為280 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均設置為5 nm，掃描范圍為300 nm～500 nm。

1.3.4 掃描電鏡觀察

將待測樣品涂于雙面導電膠上，在10mA電流下噴金處理后置于掃描電子顯微鏡樣品室，在15kV加速電壓掃描觀察樣品形貌，放大倍數(shù)為300倍和1 000倍。

1.3.5 SDS-PAGE分析

參考Cao等[12]的方法略作修改。將0.005 g樣品溶解在1 mL上樣緩沖液中，沸水浴10 min，冷卻至室溫（25℃）離心（10 000 r/min，5 min），取 10 μL 樣品和預染彩虹蛋白（Marker）分別注入到凝膠泳道中進行電泳。電泳條件：濃縮膠過程電壓為80 V，分離膠過程電壓為120 V。

1.3.6 乳化活性及乳化穩(wěn)定性的測定

參考Fan等[13]的方法，取30mL1mg/mL蛋白樣液與10 mL大豆油混合，利用均質(zhì)機進行均質(zhì)（18 000 r/min，2 min），使兩者充分混勻。從底部取出50 μL乳液加入到5 mL 1 mg/mL十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）溶液中，渦旋混勻，立即使用紫外可見分光光度計在500 nm處測量混合溶液的吸光度。根據(jù)以下公式計算麥醇溶蛋白及其復合物的乳化活性指數(shù)（emulsifying activity index，EAI） 和乳化穩(wěn)定性指數(shù)（emulsifying stability index，ESI）。

式中：2為常數(shù)，代表乳液的界面面積是其濁度的2倍；2.303為ln 10的值；DF為乳液樣品稀釋倍數(shù)，100；A0為均質(zhì)后0 min時的吸光度；c為乳化前蛋白質(zhì)樣品的濃度，g/mL；θ為油相的體積分數(shù)，0.25；A10為靜置10 min后測得的吸光度；t為時間，10 min。

1.4 MD模擬

1.4.1 模型的構(gòu)建

參考Stǎnciuc等[14]同源建模的方法獲取麥醇溶蛋白三維結(jié)構(gòu)模型。首先在UniProt數(shù)據(jù)庫中獲取麥醇溶蛋白的氨基酸序列（Q9M4L6），然后提交氨基酸序列至I-TASSER服務器[15-16]獲取麥醇溶蛋白結(jié)構(gòu)模型，最后采用GROMACS（版本：2019.06）軟件進一步退火平衡麥醇溶蛋白模型，選取平衡后的最優(yōu)構(gòu)象模型用于后續(xù)分子動力學模擬。

從Pubchem數(shù)據(jù)庫中獲得阿拉伯糖（ID：10323-20-3）、果糖（ID：136023275）和海藻糖（ID：7427）的初始分子結(jié)構(gòu)模型。

1.4.2 分子動力學模擬參數(shù)

以麥醇溶蛋白和阿拉伯糖、果糖、海藻糖分別組成不同復合物結(jié)構(gòu)模型，使用GROMACS（版本：2019.06）軟件[17]進行分子動力學模擬，PyMOL（版本：2.4.0a0 open-source）軟件進行可視化分析。利用acpype.py[18]調(diào)用 Ambertools 18 軟件[19]，在 glycam06 力場下生成阿拉伯糖、果糖和海藻糖的拓撲文件和坐標文件，并在Amber99SB-ILDN力場下得到麥醇溶蛋白的拓撲和坐標文件。然后，將Gli-Ara、Gli-Fru和Gli-Tre分別封裝在立方體盒子中，分子與盒子邊緣的距離為1.2 nm，加入TIP3P模型水，通過Na+或Cl-中和體系電荷。在系統(tǒng)能量最小化后，設置pH值為7.0，模擬溫度為25℃，并分別運行20 ns，時間步長為2 fs。最后，使用GROMACS軟件自帶工具計算低分子糖-麥醇溶蛋白復合物的均方根偏差（root mean square deviation，RMSD）和氫鍵數(shù)量；提取15 ns～20 ns的軌跡，每隔40 ps取一幀，共125幀，采用gmx_mmpbsa工具（https：//jerkwin.github.io/gmxtools/）計算低分子糖-麥醇溶蛋白復合物的結(jié)合能，其計算公式[20]如下。

式中：ΔGbinding為結(jié)合能，kJ/mol；ΔEele為庫侖靜電相互作用能，kJ/mol；ΔEvdw為范德華相互作用能，kJ/mol；ΔGpolar為極性溶劑化自由能，kJ/mol；ΔGnonpolar為非極性溶劑化自由能，kJ/mol。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗均進行3次平行測定，結(jié)果以平均值±標準偏差表示。利用SPSS統(tǒng)計軟件進行單因素ANOVA分析（p＜0.05時為差異顯著）。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅外光譜分析

圖 1 為 Gli、U-Gli、U-Gli-Ara、U-Gli-Fru 和 UGli-Tre的紅外光譜。

圖1 Gli、U-Gli和超聲處理復合物的紅外光譜Fig.1 Fourier transform infrared spectroscopy of Gli，U-Gli，and ultrasonic treatment complexes

由圖1可知，Gli在3402cm-1和1450cm-1～1200cm-1處存在的特征峰分別與O-H伸縮振動和酰胺III帶中C-N拉伸和N-H彎曲振動有關(guān)[21]。Gli經(jīng)超聲處理后，其在3 402 cm-1處的特征吸收峰紅移至3 393 cm-1，表明超聲處理使蛋白質(zhì)分子內(nèi)氫鍵發(fā)生改變。與U-Gli相比，U-Gli-Ara、U-Gli-Fru和 U-Gli-Tre在 3 393 cm-1處的特征峰發(fā)生不同程度的藍移或者紅移（51 cm-1～8 cm-1），表明氫鍵誘導蛋白質(zhì)與低分子糖之間的相互作用[22]。同時，U-Gli-Ara復合物在1413cm-1和1241cm-1處的特征峰分別藍移至1 433 cm-1和1 248 cm-1；U-Gli-Fru復合物在1 313 cm-1處的特征峰藍移至1 317 cm-1；U-Gli-Tre復合物在1 206 cm-1處的特征峰紅移至1 200 cm-1，表明低分子糖分別與麥醇溶蛋白的C-N基團和N-H基團發(fā)生相互作用。

2.2 熒光光譜分析

熒光光譜可反映蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化，因此采用熒光光譜研究麥醇溶蛋白與低分子糖配體之間的相互作用及復合物結(jié)構(gòu)變化。圖2為Gli、U-Gli、U-Gli-Ara、U-Gli-Fru和U-Gli-Tre的內(nèi)源熒光光譜。

圖2 Gli、U-Gli和超聲處理復合物的熒光光譜Fig.2 Fluorescence spectra of Gli，U-Gli，and ultrasonic treatment complexes

由圖2可知，Gli在334 nm處具有最大熒光發(fā)射峰，經(jīng)超聲處理后，熒光強度增加，表明麥醇溶蛋白分子部分變性，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開[23]。同時，U-Gli-Ara、UGli-Fru和U-Gli-Tre的熒光強度高于U-Gli，這可能是由于Gli與低分子糖之間發(fā)生相互作用，導致Gli結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，還可能是低分子糖覆蓋在Gli表面，阻止了發(fā)色基團的暴露，這與Hu等[24]的研究結(jié)果一致。此外，U-Gli-Tre復合物的熒光強度明顯高于U-Gli-Ara和U-Gli-Fru，這可能是由于海藻糖羥基基團較多，與麥醇溶蛋白的親和力更強。

2.3 掃描電鏡分析

圖 3 為 Gli、U-Gli、U-Gli-Ara、U-Gli-Fru 和 UGli-Tre的掃描電鏡圖。

圖3 Gli、U-Gli和超聲處理復合物的掃描電鏡Fig.3 Scanning electron micrograph of Gli，U-Gli，and ultrasonic treatment complexes

由圖3A可知，Gli呈現(xiàn)出許多不規(guī)則的片段、小間隙和大的球形聚集體，經(jīng)超聲處理后，U-Gli表現(xiàn)為孔洞狀結(jié)構(gòu)半球形結(jié)構(gòu)（圖3B），這可能是由于超聲處理削弱了蛋白質(zhì)分子內(nèi)氫鍵和范德華力，導致麥醇溶蛋白形態(tài)變得松散多孔，其構(gòu)象和二級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[25]；與U-Gli相比，U-Gli-Ara表面孔徑變得細小，樣品紋理松散，呈現(xiàn)出蜂窩狀（圖3C）；U-Gli-Fru表面球形聚集體形狀變小，且呈現(xiàn)出大量小的聚集體（圖3D）；UGli-Tre出現(xiàn)連續(xù)的蜂窩狀網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)（圖3E），表明低分子糖的引入可以抑制麥醇溶蛋白分子的聚集[26]。

2.4 SDS-PAGE分析

通過分析SDS-PAGE探究低分子糖-麥醇溶蛋白復合物的分子量及蛋白質(zhì)亞基組成變化。圖4為聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。

圖4 Gli、U-Gli和超聲處理復合物的SDS-PAGE圖譜Fig.4 SDS-PAGE of Gli，U-Gli，and ultrasonic treatment complexes

由圖4可知，α/β-麥醇溶蛋白分子量分布在30 kDa～35 kDa[27]，Gli在35 kDa左右呈現(xiàn)出相應的特征帶（泳道2）。同樣，U-Gli（泳道3）與Gli（泳道2）在約34 kDa處出現(xiàn)類似條帶，表明超聲處理對蛋白質(zhì)分子量無明顯影響。此外，U-Gli-Ara（泳道 4）、U-Gli-Fru（泳道 5）和U-Gli-Tre（泳道6）的條帶與U-Gli（泳道3）相比無明顯變化，即沒有觀察到蛋白質(zhì)亞基的降解，分子量均在34 kDa左右，說明低分子糖不是通過降解麥醇溶蛋白分子來影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)[28]。

2.5 乳化性能分析

乳化性作為重要的功能性質(zhì)之一，與蛋白質(zhì)的兩親性和分子結(jié)構(gòu)特征有關(guān)[23]。EAI和ESI是反映蛋白質(zhì)形成油水界面乳狀液層能力和乳狀液穩(wěn)定性的重要指標。圖 5 為 Gli、U-Gli、U-Gli-Ara、U-Gli-Fru 和U-Gli-Tre的EAI和ESI結(jié)果。

圖 5 Gli、U-Gli、U-Gli-Ara、U-Gli-Fru 和 U-Gli-Tre 乳化性Fig.5 Emulsifying properties of Gli，U-Gli，U-Gli-Ara，UGli-Fru，and U-Gli-Tre

由圖5可知，U-Gli的EAI和ESI分別為37.3 m2/g和14.2 min，較Gli分別提高了15.4%和7.6%，表明超聲處理可以改善麥醇溶蛋白的乳化性能。這可能是因為超聲處理后，蛋白質(zhì)聚集體尺寸減小，使其在油水界面的吸附能力增強[29]。此外，U-Gli-Ara、U-Gli-Fru和U-Gli-Tre的EAI較U-Gli分別增加了約4.8%、5.0%和22.9%，ESI分別增加了約17.0%、31.1%和34.8%。表明低分子糖的引入可以進一步提高麥醇溶蛋白的乳化性。這可能是由于復合物的結(jié)構(gòu)展開，有利于快速吸附到油水界面，并且羥基基團的增加提高了蛋白質(zhì)的親水性[30]。

2.6 MD模擬

2.6.1 RMSD分析

RMSD能夠反映復合物在模擬過程中的構(gòu)象偏離其初始構(gòu)象的程度[31]。通過分析低分子糖-麥醇溶蛋白復合物中蛋白質(zhì)骨架原子的RMSD隨時間的變化趨勢，以考察模擬過程中復合物體系的穩(wěn)定程度。圖6為Gli-Ara、Gli-Fru和 Gli-Tre在 MD模擬過程中的RMSD變化。

圖6 Gli-Ara、Gli-Fru和Gli-Tre在MD模擬過程中的RMSD變化Fig.6 RMSD changes of Gli-Ara，Gli-Fru，and Gli-Tre during MD simulation

由圖6可知，在0～15 ns范圍內(nèi)，3種低分子糖與麥醇溶蛋白復合物的RMSD波動較大，且隨著低分子糖鏈長的增加，RMSD逐漸升高；在15 ns以后，三者逐漸趨于平穩(wěn)，此時Gli-Ara、Gli-Fru和Gli-Tre的RMSD分別維持在0.36、0.45 nm和0.56 nm左右，RMSD曲線波動幅度變小，表明所有復合物體系穩(wěn)定，可用于進一步分析氫鍵和結(jié)合能變化。

2.6.2 氫鍵分析

分子間氫鍵對蛋白質(zhì)-配體之間的相互作用有重要貢獻，且對維持復合物的穩(wěn)定性有重要意義[32-33]。圖7為不同復合物（Gli-Ara、Gli-Fru和Gli-Tre）在MD模擬過程中形成的氫鍵數(shù)量隨時間的變化。

圖7 Gli-Ara、Gli-Fru和Gli-Tre在MD模擬過程中氫鍵數(shù)目的變化Fig.7 Changes in the number of hydrogen bonds in Gli-Ara，Gli-Fru，and Gli-Tre during MD simulations

由圖7可知，在MD模擬達到平衡后（15ns～20ns），Gli-Ara、Gli-Fru和Gli-Tre復合物的平均氫鍵壽命分別為 6.94、7.16 ps和 11.07 ps，且 Gli-Ara、Gli-Fru 和Gli-Tre在大多數(shù)時間內(nèi)分別出現(xiàn)4、4個和6個氫鍵，這可能是由于海藻糖分子羥基基團與麥醇溶蛋白形成了更多的分子間氫鍵，有利于維持復合物體系的穩(wěn)定性，這與紅外光譜的結(jié)果一致（圖1）。

2.6.3 結(jié)合能分析

分子間結(jié)合能可用于衡量蛋白質(zhì)和配體分子間結(jié)合親和力，結(jié)合能越低，復合物構(gòu)象相對越穩(wěn)定[32，34]。圖8為在MD模擬平衡時間段內(nèi)，Gli-Ara、Gli-Fru和Gli-Tre復合體系中各項能量的貢獻情況。

圖8 Gli-Ara、Gli-Fru和Gli-Tre在MD模擬過程中能量的變化Fig.8 Energy changes of Gli-Ara，Gli-Fru，and Gli-Tre during MD simulation

由圖8可知，Gli-Tre復合物的結(jié)合能（-40.6kJ/mol）低于Gli-Fru復合物（-15.2 kJ/mol）和Gli-Ara復合物（-9.9 kJ/mol），表明Gli-Tre復合物比Gli-Fru復合物及Gli-Ara復合物更穩(wěn)定，這與超聲處理后的Gli-Tre復合物的ESI高于Gli-Fru復合物與Gli-Ara復合物的結(jié)果一致（圖5）。此外，庫侖靜電相互作用能的變化趨勢與范德華相互作用能相似，且后者表現(xiàn)為更低的負值，這與Katouzian等[35]研究發(fā)現(xiàn)氫鍵和范德華相互作用是驅(qū)動α-乳清蛋白與橄欖苦苷結(jié)合的主要作用力的結(jié)果一致，表明范德華力對維持麥醇溶蛋白與低分子糖形成的復合物的穩(wěn)定性起主要作用，而3種復合物的極性溶劑化自由能均為正值，表明極性溶劑化自由能是阻礙低分子糖與麥醇溶蛋白結(jié)合的主要因素。

3 結(jié)論

本文研究了不同種類低分子糖對其與麥醇溶蛋白形成的復合物結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性及相互作用機制的影響。結(jié)果表明，海藻糖-麥醇溶蛋白復合物的EAI和ESI較麥醇溶蛋白分別增加了約22.9%和34.8%，表現(xiàn)出最佳的乳化性；紅外光譜表明阿拉伯糖、果糖和海藻糖與麥醇溶蛋白之間存在氫鍵相互作用。此外，分子動力學模擬表明氫鍵與范德華力是驅(qū)動低分子糖和麥醇溶蛋白形成復合物的主要作用力，且海藻糖-麥醇溶蛋白復合物形成了更多的分子間氫鍵（6個）和更低的結(jié)合能（-40.6 kJ/mol），有利于維持體系穩(wěn)定性。綜上，本文為提升麥醇溶蛋白加工品質(zhì)以及進一步研究低分子糖-麥醇溶蛋白復合性能提供理論參考。