■蔣 慧 林 淼 胡光輝 宗玉潔 霍永久

（揚州大學動物科學與技術學院，江蘇揚州 225009）

為了達到奶牛高產(chǎn)奶量的生產(chǎn)目的，日糧多配合為精料比例高于60%的高淀粉低纖維日糧，這種模式帶來了瘤胃酸中毒（ruminal acidosis，RA）的風險[1]。瘤胃急性酸中毒（acute ruminal acidosis，ARA）是由于瘤胃中大量碳水化合物快速降解產(chǎn)生有機酸過高積累[2]，當瘤胃pH降到4.5以下時，大量瘤胃細菌死亡，而牛鏈球菌（Streptococcus bovis）耐受高酸度，繼續(xù)產(chǎn)生更多的乳酸，導致瘤胃急性酸中毒的發(fā)生[3]。相反，瘤胃pH 未降至5 以下，而是低于5.6，并持續(xù)超過3 h/d，就會發(fā)生瘤胃亞急性酸中毒（sub- acute ruminal acidosis，SARA）[4]。據(jù)報道，歐美國家奶牛SARA患病率為11%～26%，每年造成的直接經(jīng)濟損失高達上億美元。我國由于優(yōu)質(zhì)粗飼料資源匱乏，優(yōu)質(zhì)燕麥草需要大量進口，導致部分牧場飼喂劣質(zhì)粗飼料，而SARA 帶來了瘤胃內(nèi)環(huán)境失衡，采食量下降，飼料轉化率下降，并降低了乳品質(zhì)和繁殖性能，甚至繼發(fā)乳房炎、蹄葉炎、肝膿腫等疾病，給我國牛奶業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。解決瘤胃酸中毒問題對保障奶牛健康、保證我國畜牧產(chǎn)業(yè)健康高效發(fā)展至關重要。

乳酸積累導致瘤胃酸中毒在國際上被廣泛認可[5]。乳酸的產(chǎn)生會導致?lián)]發(fā)性脂肪酸（VFA）積累以及瘤胃壁病變的發(fā)生[6]。乳酸（CH3CHOHCOOH）有兩種旋光活性異構體，三種存在形式，即L-乳酸、D-乳酸和外消旋混合物（DL-乳酸）[7]。乳酸的電離常數(shù)（pKa）為3.9，低于VFA（4.8），因此乳酸對于降低瘤胃pH的貢獻高于VFA。除此之外瘤胃中的乳酸還能夠促進VFA的吸收[8]，因此當瘤胃發(fā)生酸中毒時，乳酸的積累為主要原因。在無氧呼吸鏈最后一步乳酸脫氫酶（LDH）可將丙酮酸轉化為乳酸。草氨酸鈉（Oxamate sodium,OS）分子式為C2H2NNaO3，相對分子質(zhì)量為111.03 u，溶解度為10 mg/mL，是LDH 抑制劑。草氨酸鈉多被用于治療癌癥，LDH 被認為是癌癥治療的最有希望的靶點，因為其抑制作用是幾乎可以完全阻斷糖酵解，提供強大的細胞抑制作用[9]。草氨酸鈉是否能抑制瘤胃乳酸產(chǎn)生菌的產(chǎn)乳酸過程，降低乳酸積累，目前尚未明確。因此，本試驗擬探討添加草氨酸鈉對乳酸產(chǎn)量的影響，并摸索不影響瘤胃發(fā)酵的適宜添加量，以期為減少瘤胃乳酸的產(chǎn)生、降低瘤胃酸中毒的發(fā)生風險提供參考。

1 材料及方法

1.1 試驗材料

液體培養(yǎng)基的配制：液體培養(yǎng)基選用在Menke人工唾液[10]中加乳酸菌培養(yǎng)基（MRS）固體粉末，比例為每升（L）人工唾液中加MRS（購自青島海博生物技術有限公司）60 g。將配制好的液體培養(yǎng)基按照每管8 mL 的體積添加入?yún)捬醢l(fā)酵管中，用1 mol/L 的HCl和NaOH 調(diào)培養(yǎng)液pH 至6.8，加塞壓蓋，抽氣2 min，通CO210 s，重復操作3個循環(huán)，121 ℃滅菌20 min后4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

MRS主要成分是蛋白胨10.0 g/L、牛肉浸粉8.0 g/L、酵母浸粉4.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L、磷酸氫二鉀2.0 g/L、檸檬酸氫二銨2.0 g/L、乙酸鈉5.0 g/L、硫酸鎂0.2 g/L、硫酸錳0.04 g/L、吐溫-80 1.0 g/L。Menke人工唾液主要由蒸餾水、A液、B液、C液組成，比例為水∶B液∶C液=2∶1∶1，A液按0.1 mL/800 mL 添加。A液（L）：二水氯化鈣13.2 g、四水氯化錳10.0 g、六水氯化鈷1.0 g、六水三氯化鐵8.0 g；B液（L）：碳酸氫銨4.0 g、碳酸氫鈉35.0 g；C 液（L）：磷酸氫二鈉5.7 g、磷酸二氫鉀6.2 g、七水硫酸鎂0.6 g。

草氨酸鈉溶液的配制：草氨酸鈉購自北京索萊寶科技有限公司。分別取0、0.02、0.05、0.10 g 和0.15 g草氨酸鈉加入到10 mL 三蒸水中，渦旋混勻，制得不同濃度梯度的草氨酸鈉溶液，4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

氣體收集瓶的準備：準備54個西林瓶，真空泵抽氣2 min，向其中通N210 s，重復操作3 個循環(huán)，替換其中的空氣，最后抽真空，備用。

瘤胃液的采集：1.5 L保溫瓶中通CO22 min，迅速采集3 頭瘺管牛瘤胃液，經(jīng)4 層紗布過濾混合后加入保溫瓶中，立即帶回實驗室，置于39 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，備用。

1.2 體外培養(yǎng)方法

采用單因素試驗設計，設置5 組，每組3 個平行。將預先準備好的（以MRS和Menke人工唾液按比例混合的液體培養(yǎng)基為發(fā)酵底物）厭氧培養(yǎng)管15支從4 ℃冰箱中取出，分別加入不同濃度草氨酸鈉1 mL，最終濃度分別為0（對照組）、2、5、10 mmol/L和15 mmol/L。預熱至39 ℃后，迅速用1 mL注射器加入新鮮瘤胃液0.3 mL，置于39 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至72 h。

1.3 樣品采集與指標測定

1.3.1 常規(guī)發(fā)酵指標

分別發(fā)酵2、4、6、12、24、48 h和72 h，測量厭氧發(fā)酵管中氣體壓強（DPG1000B15PSIG-5, CeComp Electronics Inc.）。

產(chǎn)氣量測定：參考Osmond 等[11]的產(chǎn)氣量計算公式計算產(chǎn)氣量：

式中：Vχ——39 ℃時產(chǎn)氣量（mL）；

Vj——產(chǎn)氣瓶頂部空間體積（mL）；

Ppsi——氣體測量系統(tǒng)自動記錄的壓力（psi）。

氣體成分測定：分別在發(fā)酵24、48 h和72 h收集培養(yǎng)管氣體5 mL，加入到準備好的真空西林瓶中，利用氣相色譜儀測定CH4、H2、CO2的含量。氣相色譜儀型號為AgilentJ&WGCcolumns DB-FFAP[length（m）：30；Diam（mm）：0～320；Film（μm）：0～25]，柱溫80 ℃；TCD檢測器溫度110 ℃；橋流50 mA，載氣為氬氣。

VFA含量測定：培養(yǎng)72 h時，迅速取出培養(yǎng)管，置于冰水中終止發(fā)酵，打開厭氧發(fā)酵管，立即測量pH（雷磁PHS-25）。發(fā)酵液一部分用于化學指標測定，另一部分用于提取總菌DNA。取發(fā)酵液于50 mL離心管中，12 000 r/min離心10 min，取上清液，4 ℃冰箱保存，用來測VFA、氨態(tài)氮、乳酸。取上清液1 mL，加0.2 mL 20%含60 mmol/L巴豆酸的偏磷酸，混勻后在-20 ℃冰箱中過夜，解凍后12 000 r/min離心10 min（4 ℃），取上清液過0.22 μm 水相濾膜，取1 μL 用氣相色譜分析。VFA混標（含乙酸55.95 mmol/L、丙酸16.03 mmol/L、異丁酸4.31 mmol/L、丁酸8.72 mmol/L、異戊酸3.65 mmol/L、戊酸3.68 mmol/L）處理同樣品。

氨態(tài)氮含量測定：參考馮宗慈等[12]的方法。

乳酸含量測定：取發(fā)酵72 h后上清液1 mL，采用乳酸（LD）測試盒（南京建成生物工程研究所有限公司）測定上清液中乳酸濃度。

1.3.2 細菌熒光定量

培養(yǎng)液細菌DNA 的提取：取發(fā)酵液1 mL，12 000 r/min 離心10 min（4 ℃），吸盡上清液，保留沉淀，用天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)的糞便基因組DNA 提取試劑盒（DP328）提取沉淀中的細菌DNA，以獲得的DNA 為模板，與PCR 反應液[Super Real 彩色熒光定量預混試劑，天根生化科技（北京）有限公司]混合后使用羅氏lightcycler?96 和序列檢測軟件進行熒光定量PCR 分析，建立20 μL 反應體系，反應體系組成見表1，冰上配制反應體系。相對定量PCR 反應步驟為：95 ℃預變性900 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火/延伸20～32 s，72 ℃延伸10 s，并采集熒光信號，共40 個循環(huán)。以瘤胃液總菌（general bacteria）DNA 作為內(nèi)參基因，矯正試驗組基因，通過相對定量求得目標菌基因表達量是瘤胃液總菌基本表達量的倍數(shù)。

表1 相對定量PCR擴增體系

Primer 5.0設計埃氏巨型球菌、牛鏈球菌、反芻獸新月單胞菌16S rRNA 擴增引物（見表2）。引物由金唯智生物科技有限公司合成。

表2 RT-qPCR引物序列

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)用SPSS 21.0 進行單因素方差分析，用Duncan’s法進行多重比較，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 產(chǎn)氣量

產(chǎn)氣量變化情況見表3。由表3可知，各組產(chǎn)氣量隨時間增加逐漸上升。與對照組相比，添加2 mmol/L和5 mmol/L草氨酸鈉對產(chǎn)氣量無顯著影響（P＞0.05），但添加10 mmol/L 和15 mmol/L 草氨酸鈉顯著降低了48 h和72 h產(chǎn)氣量。

表3 不同草氨酸鈉添加量對產(chǎn)氣量的影響（mL）

2.2 氣體成分

發(fā)酵氣體成分以百分比表示，氣體成分含量見表4。添加不同濃度草氨酸鈉的24 h 氫氣、甲烷、二氧化碳比例無顯著差異（P＞0.05）；添加草氨酸鈉量為15 mmol/L 時的48 h 氫氣比例顯著降低（P＜0.05），甲烷和二氧化碳比例未發(fā)生顯著變化，且72 h時氫氣和二氧化碳比例顯著降低（P＜0.05），甲烷含量未發(fā)生顯著變化。

表4 不同草氨酸鈉添加量對氣體成分的影響（%）

2.3 不同濃度草氨酸鈉對pH、VFA、氨態(tài)氮、乳酸含量以及瘤胃細菌相對豐度的影響

不同濃度草氨酸鈉對體外發(fā)酵72 h 的發(fā)酵參數(shù)影響見表5。由表5可知，添加2、5、10 mmol/L草氨酸鈉，對pH、VFA、氨態(tài)氮含量無顯著影響。但當草氨酸鈉添加量為15 mmol/L時，培養(yǎng)液pH和氨態(tài)氮含量顯著降低（P＜0.05），乙酸含量顯著增加（P=0.02），丙酸、丁酸含量顯著降低（P＜0.05），異丁酸、異戊酸含量未發(fā)生顯著變化（P＞0.05）。在草氨酸鈉添加量為10 mmol/L和15 mmol/L 時，均顯著降低乳酸含量（P＜0.05）。添加草氨酸鈉對牛鏈球菌和反芻獸新月單胞菌的相對豐度沒有顯著影響，但當草氨酸鈉添加量≥10 mmol/L時，顯著降低了埃氏巨型球菌相對豐度（P＜0.05）。

表5 不同草氨酸鈉添加量對瘤胃發(fā)酵參數(shù)、乳酸含量及瘤胃細菌相對豐度的影響

3 討論

3.1 草氨酸鈉對瘤胃發(fā)酵產(chǎn)氣和VFA產(chǎn)量的影響

產(chǎn)氣量和氣體成分能夠反映瘤胃內(nèi)細菌的真實生長狀況，是評價瘤胃健康狀態(tài)的重要指標[13]，總產(chǎn)氣量越大說明飼料可發(fā)酵碳水化合物含量越高，微生物活性越強，反之，總產(chǎn)氣量越小說明飼料可發(fā)酵碳水化合物含量越低，微生物活性越弱。本試驗體外發(fā)酵48 h 及72 h，添加10 mmol/L、15 mmol/L 草氨酸鈉顯著減少了氣體的產(chǎn)生，說明高濃度草氨酸鈉抑制了瘤胃發(fā)酵，可能降低了瘤胃微生物活性。而本試驗24 h 產(chǎn)氣量未受到影響的原因可能是草氨酸鈉對乳酸脫氫酶的抑制作用可能存在時間依賴關系，需要進一步研究論證。何大偉等[14]研究認為草氨酸鈉對膽管癌細胞株Hucct-1 的半數(shù)抑制濃度為50 mmol/L，Cassim 等[15]添加100 mmol/L 草氨酸鈉后顯著抑制乳酸脫氫酶及糖酵解基因的表達。

VFA是瘤胃降解碳水化合物的最終產(chǎn)物，包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、異丁酸、異戊酸，乙酸比例最高，其次為丙酸和丁酸[16]。VFA是反芻動物主要的能量來源，乙酸和丙酸分別是脂肪和葡萄糖的主要前體[17]。乙酸是合成乳脂的重要前體物質(zhì)[18]，乙酸被瘤胃壁吸收后，大部分被運送到外周組織用于三羧酸循環(huán)氧化供能或者用于脂肪酸合成；丙酸是反芻動物肝臟糖異生產(chǎn)生葡萄糖的主要物質(zhì)；丁酸在被瘤胃、網(wǎng)胃壁吸收后主要轉化為β-羥丁酸，為機體組織，尤其是肌肉組織提供能量[19]。在本試驗中添加草氨酸鈉濃度達到15 mmol/L 時，乙酸含量大約增加至其他各組的1.5 倍，而丙酸、丁酸和戊酸都有所下降。瘤胃中LDH受到抑制后，葡萄糖無氧分解第一階段產(chǎn)生的丙酮酸在丙酮酸脫氫酶的作用下生成乙酰輔酶A，乙酰輔酶A在磷酸轉乙?；傅淖饔孟罗D變?yōu)橐阴Ａ姿幔阴Ａ姿嵩谝音然傅淖饔孟罗D變?yōu)橐宜醄20]。丙酮酸也可通過延琥珀酸途徑最終生成丙酸，由此可見丙酮酸是重要的有機化學中間體[21]。在奶牛瘤胃中，氫氣和二氧化碳是甲烷產(chǎn)生的前體物質(zhì)[22-23]，當添加草氨酸鈉濃度為15 mmol/L，發(fā)酵72 h 時二氧化碳和氫氣含量顯著減少，但甲烷含量未發(fā)生顯著變化，可能原因是瘤胃產(chǎn)甲烷菌未受到草氨酸鈉的抑制，減少的二氧化碳和氫氣部分被用于產(chǎn)生甲烷[24]。當瘤胃產(chǎn)乳酸途徑被抑制時，丙酮酸主要用于合成乙酸。此外瘤胃中乙酸產(chǎn)生菌也常利用二氧化碳和氫氣合成乙酸[25]，這可能是瘤胃中氫氣和二氧化碳減少而乙酸含量增加的原因之一。

3.2 草氨酸鈉對氨態(tài)氮含量的影響

發(fā)酵底物被瘤胃微生物降解以后，一部分游離于細菌細胞外，一部分被細菌利用以合成微生物蛋白，瘤胃中的氨態(tài)氮含量反映著瘤胃內(nèi)含氮物的發(fā)酵情況[26]，除了主要的纖維素降解細菌之外，大部分瘤胃細菌都有部分蛋白降解功能[27]。當添加草氨酸鈉濃度在10 mmol/L以下時，對氨態(tài)氮含量沒有顯著影響，當草氨酸鈉添加達到15 mmol/L 時，氨態(tài)氮含量顯著下降，可能原因是添加高濃度的草氨酸鈉抑制了瘤胃菌對蛋白質(zhì)的降解能力，導致氨態(tài)氮的合成減少[28]。也有可能是瘤胃內(nèi)微生物利用氨態(tài)氮合成生物蛋白的能力增強，導致培養(yǎng)液中氨態(tài)氮含量減少[29]。

3.3 草氨酸鈉對pH、乳酸含量及相關乳酸菌的影響

正常情況下，瘤胃乳酸的代謝途徑主要有琥珀酸、丙烯酸、乙酸和丁酸途徑。在琥珀酸途徑中，乳酸在乳酸脫氫酶的作用下生成丙酮酸，丙酮酸沿蘋果酸、琥珀酸途徑，最終生成丙酸。在丙烯酸途徑中，L 型乳酸通過丙酰輔酶A 轉移酶轉化為乳酰輔酶A，隨后脫水生成丙烯酰輔酶A，最終丙烯酰輔酶A加氫還原成丙酸。在乙酸和丁酸途徑中，乳酸經(jīng)丙酮酸生成乙酰輔酶A，乙酰輔酶A分別在磷酸乙酰轉移酶、丁酰輔酶A脫氫酶作用下分別生成乙酸和丁酸[30]。本試驗中添加草氨酸鈉濃度在10 mmol/L時顯著降低乳酸含量，但不影響pH。但草氨酸鈉濃度達到15 mmol/L時，pH 顯著下降，雖然與VFA 相比乳酸pKa 較低，但乳酸含量減少導致的pH升高不足以抵消乙酸含量大量增加而導致的pH降低，從而使培養(yǎng)液pH降低。過去的數(shù)十年間，人們一直在腫瘤的能量代謝中尋找癌癥的“阿喀琉斯之踵”（Achilles’heel of caner）[31]，很多具有抑制腫瘤能量代謝關鍵酶的小分子藥物已被用于臨床研究[32]，其中草氨酸鈉是腫瘤細胞糖酵解過程的關鍵合成限速酶之一。在腫瘤細胞研究中，人們發(fā)現(xiàn)LDH-A表達與正常細胞相比是升高的[33]，Zhao等[34]發(fā)現(xiàn)LDH-A 的上調(diào)可以促進癌細胞的糖酵解過程。LDH 是由兩個亞基組成的四聚體，包括LDH-A 和LDH-B[35]，其催化丙酮酸轉化為乳酸，同時將煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH，還原性輔酶Ⅰ）轉化為NAD+，反應方向由LDH 中的LDH-A 和LDH-B 的比例調(diào)節(jié)，LDH-A 將丙酮酸還原為乳酸，同時將NADH被氧化為NAD+[36]。草氨酸鈉是丙酮酸的電子等排體，可以與丙酮酸競爭LDH，當草氨酸鈉與LDHNADH 復合物結合時，LDH 活性位點關閉，活性被抑制[37]，侯若冰等[38]研究認為，草氨酸鈉對LDH 的抑制機理為：①草氨酸鈉與丙酮酸的穩(wěn)定構象態(tài)在結構上極為相似，導致酶不能有效識別底物；②草氨酸鈉各原子所帶凈電荷的優(yōu)勢使其更易與酶活性中心結合；③草氨酸鈉通過對LDH的誘導契合作用使LDH活性中心的空間變小。

奶牛瘤胃中常見的產(chǎn)乳酸菌包括牛鏈球菌（Streptococcus bovis）、溶纖維丁酸弧菌（Butyrivibrio fibrisolvens）、乳酸桿菌（Lactic acid bacteria）；奶牛瘤胃中常見的乳酸利用菌包括埃氏巨型球菌（Megasphaera elsdenii）、反芻獸新月單胞菌（Selenomonus ruminantium）等[36]。牛鏈球菌是奶牛瘤胃中的主要乳酸產(chǎn)生菌，當瘤胃發(fā)酵速率較慢時，牛鏈球菌主要產(chǎn)生乙酸鹽、甲酸鹽和乙醇[39]，果糖1，6-二磷酸（FDP）作為LDH 的變構激活劑，依賴于發(fā)酵速率，當發(fā)酵速率較快時，F(xiàn)DP較多，導致LDH的激活，催化乳酸的產(chǎn)生[40]，因此添加草氨酸鈉抑制LDH 酶活性，即使在高精料條件下發(fā)酵速率較快，也可以抑制乳酸的產(chǎn)生。在本試驗中對埃氏巨型球菌、牛鏈球菌、反芻獸新月單胞菌qPCR 結果表明，添加草氨酸鈉濃度達到10 mmol/L 時顯著降低埃氏巨型球菌相對豐度，反芻獸新月單胞菌相對豐度也有所下降但差異不顯著，牛鏈球菌相對豐度未發(fā)生明顯變化。產(chǎn)生上述現(xiàn)象的原因可能是乳酸產(chǎn)量下降，導致乳酸利用菌底物減少，導致乳酸利用菌相對豐度下降。

4 結論

草氨酸鈉可以抑制瘤胃乳酸的積累，但15 mmol/L草氨酸鈉提高了乙酸產(chǎn)量，降低了pH。因此，在本試驗條件下草氨酸鈉抑制瘤胃乳酸積累的適宜添加量為10 mmol/L。