■張宇雷 李 義 丁宏標(biāo)

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，北京 100081）

類胡蘿卜素是一種自然界存在的天然色素，也是蛋雞生產(chǎn)中重要的飼用添加劑。迄今為止，自然界中已經(jīng)鑒定出超過600種類胡蘿卜素，而通過攝食接觸的只有40種左右[1]。類胡蘿卜素是優(yōu)秀的抗氧化劑，具有多種生物學(xué)功能，是一種很有潛力的功能性飼用添加劑。本文介紹了類胡蘿卜素的分類、理化性質(zhì)以及生物學(xué)特性，以及生產(chǎn)上的制備工藝，并對類胡蘿卜素在蛋雞生產(chǎn)上的研究進(jìn)行了總結(jié)和展望，旨在為類胡蘿卜素在蛋雞生產(chǎn)中的新功能的進(jìn)一步研究和應(yīng)用提供參考和思路。

1 類胡蘿卜素的分類和理化性質(zhì)

1.1 類胡蘿卜素的分類

類胡蘿卜素是一種外觀呈黃色、橙紅色、紅色的天然色素，廣泛分布于自然界中。天然的類胡蘿卜素由植物和微生物合成，廣泛存在于植物和藻類等光合生物的葉綠體和染色質(zhì)中。動物沒有合成類胡蘿卜素的能力，但可以通過食物攝取獲得并在體內(nèi)存積[1]。類胡蘿卜素是一種親脂性四萜化合物。目前已知的類胡蘿卜素高達(dá)上百種，根據(jù)其化學(xué)構(gòu)成可分為兩個亞型：β-胡蘿卜素（C40H56）、番茄紅素（C40H56）等由純碳?xì)錁?gòu)成的化合物，被稱為胡蘿卜素；而葉黃素（C40H56O2）、玉米黃質(zhì)（C40H56O2）、角黃素（C40H52O2）等具有含氧官能團(tuán)的化合物，被稱為類胡蘿卜素含氧衍生物[2]。

1.2 類胡蘿卜素的理化性質(zhì)

類胡蘿卜素是親脂性的疏水分子，不溶于水但可溶于有機(jī)溶劑，溶解度受溫度影響，溫度越高溶解度越高。在非極性介質(zhì)中，類胡蘿卜素以單分子的形式存在，而在極性介質(zhì)中，類胡蘿卜分子在氫鍵范德華力的作用下易以聚集體的形式存在，使得類胡蘿卜素在不同類型的溶劑中顏色不同，這也是類胡蘿卜素在有機(jī)介質(zhì)中比在極性溶劑中吸收率高的原因[3]。類胡蘿卜素的親脂性受含氧官能團(tuán)數(shù)量影響，含氧官能團(tuán)數(shù)量越多親脂性越差[2]。大部分的類胡蘿卜素是由8 個異戊二烯單元聚合而來的四萜色素。由于碳碳單鍵（C-C bonds）周圍存在異構(gòu)，類胡蘿卜素可能出現(xiàn)順式異構(gòu)和反式異構(gòu)，順式結(jié)構(gòu)更容易溶解吸收和運輸，擁有不同的分子幾何形狀。反式異構(gòu)更耐熱，在自然界中更普遍，是線性和剛性分子[4]。類胡蘿卜素含有的共軛雙鍵的數(shù)量決定了類胡蘿卜素的顏色，隨著共軛雙鍵數(shù)量的增加顏色會更加趨近于紅色。共軛多烯生色團(tuán)則讓胡蘿卜素能擁有巨大摩爾吸光系數(shù)，而共軛多烯鏈中的雙鍵結(jié)構(gòu)讓其具備直接淬滅高活性單線態(tài)氧的能力[5]，這也造成類胡蘿卜素的化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，保存時應(yīng)注意光照、溫度、含氧等因素。

2 類胡蘿卜素的生物學(xué)功能

2.1 提高機(jī)體抗氧化能力

生物體內(nèi)的自由基存在動態(tài)平衡，但當(dāng)自由基積累過多平衡被打破時，自由基就會對細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)、糖類、DNA進(jìn)行攻擊，造成組織的氧化損傷[6]。類胡蘿卜素可以抑制或下調(diào)由活性氧自由基（ROS）引起的氧化應(yīng)激，以及機(jī)體在應(yīng)對環(huán)境應(yīng)激時產(chǎn)生的不穩(wěn)定化合物。研究表明，類胡蘿卜素中的蝦青素抗氧化能力是維生素E 的110 倍[7]。蝦青素可以保護(hù)人類淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞免受某些白細(xì)胞的氧化應(yīng)激，且不會降低白細(xì)胞的殺傷作用[8]。類胡蘿卜素通過三個步驟清除自由基：首先，通過氧化還原反應(yīng)對自由基進(jìn)行電子轉(zhuǎn)移；其次，抽氫反應(yīng)使自由基獲得氫；最后，通過加成反應(yīng)清除自由基[9]（見圖1）。

圖1 類胡蘿卜素清除自由基的流程

需要注意的是類胡蘿卜素可以形成中性自由基。例如，β-胡蘿卜素在較低濃度下起到抗氧化作用，但在較高濃度下顯示出促氧化特性[10]。類胡蘿卜素能防止脂質(zhì)過氧化，研究表明飼料中添加75 mg/kg蝦青素能夠提高鮭魚肝臟的抗氧化防御能力[11]，抗氧化功能保護(hù)細(xì)胞免受反應(yīng)性自由基的傷害。此外，類胡蘿卜素能夠改善細(xì)胞膜的流動性，對細(xì)胞膜的完整性起到促進(jìn)作用[8]。Shi等[12]研究發(fā)現(xiàn)，胡蘿卜素和番茄紅素單獨使用時，分別將過氧化水平降低至51%和25%。當(dāng)β-胡蘿卜素和番茄紅素形成混合物使用時，過氧化水平降低到21%。葉黃素和番茄紅素分別將過氧化水平降低到77%和25%，而混合物將過氧化水平降低到16%。表明當(dāng)類胡蘿卜素形成混合物時，其抗氧化能力優(yōu)于單一類胡蘿卜素，類胡蘿卜素在抗氧化功能上存在協(xié)同作用。

2.2 增強(qiáng)免疫功能

研究表明，類胡蘿卜素可以通過促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子釋放、增強(qiáng)免疫細(xì)胞吞噬和殺滅病原菌從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。蝦青素是一種具有含氧官能團(tuán)的類胡蘿卜素，可通過降低超氧陰離子、過氧化氫、白細(xì)胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等細(xì)胞因子水平，提高中性粒細(xì)胞的吞噬和殺滅微生物能力，并通過增強(qiáng)T細(xì)胞的增殖來調(diào)節(jié)機(jī)體適應(yīng)性免疫[10]。蝦青素增強(qiáng)了小鼠的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（Cytotoxic T lymphocyte）的活性，當(dāng)出現(xiàn)由應(yīng)激誘導(dǎo)的自然殺傷細(xì)胞活性抑制時，蝦青素可緩解這種抑制[13]。在體外試驗中，蝦青素刺激小鼠脾細(xì)胞和胸腺細(xì)胞的細(xì)胞增殖[14]。蝦青素處理的人類細(xì)胞在實驗室水平上呈現(xiàn)免疫蛋白生成增強(qiáng)。在臨床試驗中，8周的蝦青素攝入刺激了有絲分裂原誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖，增加自然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性，增加總T細(xì)胞和B細(xì)胞亞群，降低了急性蛋白并增強(qiáng)了機(jī)體免疫反應(yīng)[15]。葉黃素促進(jìn)核因子E2 相關(guān)因子2（Nrf2）活化和Nrf2 靶向的血紅素氧合酶1（HO-1）、醌氧化還原酶1（NQO1）、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（GST）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）抗氧化基因的表達(dá)，降低了活性氧水平，從而減少由ROS 所引發(fā)的炎癥反應(yīng)。在脂肪細(xì)胞分化的早期階段，葉黃素減少脂滴的形成并下調(diào)增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α（CEBP-α）和氧化物酶體活化增殖受體γ（PPAR-γ），從而抑制肥胖相關(guān)炎癥[16]。在小鼠上，葉黃素通過增加Nrf2信號相關(guān)的NQO1、HO-1 和GST 抗氧化酶的水平，減少ROS 和丙二醛（MDA）含量，從而減輕砷對肝臟的損傷[17]。

2.3 改善視覺功能

類胡蘿卜素中的胡蘿卜素是體內(nèi)維生素A 的來源之一，動物可以將攝食的胡蘿卜素轉(zhuǎn)化為維生素A，維生素A與視覺和生長密切相關(guān)[9]。人通過消耗維生素A 合成視紫紅質(zhì)來維持視覺。玉米黃質(zhì)和葉黃素被稱為黃斑色素，大量出現(xiàn)于人眼黃斑區(qū)中央凹處。這些黃斑色素能夠幫助吸收大量藍(lán)光以減少高能光對眼睛的損傷，并通過高抗氧化性減少黃斑區(qū)的氧化應(yīng)激[18]。

3 類胡蘿卜素的制備工藝

3.1 類胡蘿卜素獲取途徑

類胡蘿卜素廣泛存在于動植物體中，通過從富含類胡蘿卜素的天然物中人工提取是獲得類胡蘿卜素的有效途徑之一。萬壽菊是用于提取葉黃素的主流作物。葉黃素以酯的形式存在于萬壽菊的花瓣中，利用類胡蘿卜素易溶于有機(jī)溶劑的原理，使用正己烷、石油醚、乙醇等有機(jī)溶劑對葉黃素進(jìn)行直接提取。萃取后再經(jīng)過皂化和重結(jié)晶獲得葉黃素產(chǎn)品[19]。也有通過超臨界流體技術(shù)、超聲波和微波輔助、酶介質(zhì)處理，對花瓣中的葉黃素酯進(jìn)行萃取的方法，但生產(chǎn)上使用得不多。正己烷溶劑浸提技術(shù)是葉黃素天然物提取的常規(guī)生產(chǎn)方法，例如用萬壽菊油樹脂溶于乙酸乙酯后，用正己烷-乙酸乙酯進(jìn)行解析，并濃縮后得到葉黃素酯浸膏，再經(jīng)過醇堿液抗氧化劑在通入二氧化碳的反應(yīng)釜中皂化，將皂化產(chǎn)物稀釋靜置過濾得到粗品葉黃素晶體，再經(jīng)過重結(jié)晶獲得最終產(chǎn)物[20]。番茄及其附屬產(chǎn)物是番茄紅素的來源，提取方法與葉黃素的提取方法相近[21]，例如使用番茄打碎用乙酸乙酯混合并均質(zhì)過濾提?。▽＠朇N103160140A）[22]。目前國際上有利用食用油作為萃取劑的研究方向，使得類胡蘿卜素的提取變得更加綠色安全[23]。蝦青素的天然來源主要是微生物和甲殼動物加工下腳料，提取以傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑提取為主[7]。但目前有脈沖電場、液體加壓、超臨界流體、亞臨界流體、微波、超聲波和高壓均質(zhì)這幾個技術(shù)方向[24]，由于市場上9 成以上的蝦青素都來源于人工合成，所以蝦青素的天然提取新方法大多停留在實驗室階段。近幾年隨著合成蝦青素隨食物鏈對人類健康安全影響的擔(dān)憂的增加，對天然蝦青素的需求越來越大，天然蝦青素的提取擁有廣闊的前景。

3.2 化學(xué)合成

化學(xué)合成的類胡蘿卜素一般集中于著色功能的類胡蘿卜素，β-阿樸-8’-胡蘿卜酸乙酯、角黃素、蝦青素等，所有全化學(xué)合成方法均需要使用Wittig 反應(yīng)。β-阿樸-8’-胡蘿卜酸乙酯有三條合成途徑，利用C20+C10、C25+C2+C3、C25+C5合成C30產(chǎn)物，其中以C25+C5 合成C30 途徑最具有工業(yè)化意義[25-27]。蝦青素的合成分為利用不同原料先合成關(guān)鍵的中間體C15進(jìn)而合成蝦青素的全化學(xué)合成法和利用葉黃素、玉米黃質(zhì)、角黃素等其他類胡蘿卜素作為原料合成蝦青素的半化學(xué)法[28]。角黃素也可通過全化學(xué)法C9+C22+C9、C15+C10+C15 途徑和半化學(xué)法使用β-胡蘿卜素氧化合成兩種途徑合成[29]。

3.3 微生物合成

用微生物合成類胡蘿卜素有著成本低、擴(kuò)大生產(chǎn)簡單、生產(chǎn)時間短等優(yōu)點，具有不錯的商業(yè)前景。微生物合成中關(guān)鍵步驟是合成類胡蘿卜素的前體物質(zhì)牻牛兒基焦磷酸（geranylgeranyl pyrophosphat，GGPP），GGPP 由異戊二烯焦磷酸（isopentenyl pyrophosphate，IPP）和二甲基丙烯焦磷酸（dimethylallylpyrophosphate，DMAPP）合成，但酵母和藻類以及部分細(xì)菌合成IPP 和DMAPP 的途徑不同，酵母利用乙酰輔酶A（CoA）經(jīng)由甲羥戊酸（MVA）途徑合成IPP和DMAPP，而藻類和部分細(xì)菌則利用3-磷酸甘油醛和丙酮酸經(jīng)由甲基赤蘚糖醇（MEP）途徑合成IPP和DMAPP，再由IPP 和DMAPP 合成GGPP，兩分子的GGPP 經(jīng)過縮聚得到C40 的四萜骨架[30-32]。之后根據(jù)微生物的不同，經(jīng)過連續(xù)多步脫氫、環(huán)化、羥基化、酮基化、氧化裂解等修飾反應(yīng)加工成不同的類胡蘿卜素。微生物合成類胡蘿卜素很多已有工業(yè)化的生產(chǎn)，例如使用鹽生杜氏藻可以生產(chǎn)β-胡蘿卜素，雨生紅球藻可以生產(chǎn)蝦青素，帶狀小球藻可以生產(chǎn)角黃素等[33]。除了使用天然微生物外，還有一種利用合成生物學(xué)技術(shù)使用工程菌生產(chǎn)類胡蘿卜素的方法備受關(guān)注，常使用大腸桿菌、啤酒酵母、耶氏解脂酵母（Yarrowia lipolytica）作為底盤物種，其中耶氏解脂酵母作為含油酵母被認(rèn)為極具商業(yè)潛力，耶氏解脂酵母可以在甘油糖蜜等廉價基質(zhì)中生產(chǎn)且其脂質(zhì)代謝與類胡蘿卜素合成共用CoA作為前體，可以用來生產(chǎn)番茄紅素、β-胡蘿卜素、角黃素和蝦青素，并擁有不錯的產(chǎn)量和效率[34]。最近的一項研究更是通過使用結(jié)構(gòu)導(dǎo)向蛋白設(shè)計變體Y27R和建立香葉基香葉焦磷酸合酶介導(dǎo)的流量限制器的方式消除底物抑制將耶氏解脂酵母生產(chǎn)β-胡蘿卜素的效率較之初始菌株提高1 441倍[35]。

4 類胡蘿卜素在蛋雞上的研究進(jìn)展

4.1 抗炎、提高免疫作用

研究表明，雞卵中葉黃素含量豐富，對孵化后的雛雞的肝臟和脾臟炎癥反應(yīng)有緩解作用。含125 nmol葉黃素的雞卵在孵化后，雛雞在脂多糖（LPS）處理后相較于對照組其脾臟IL-6的mRNA豐度降低，肝臟因炎癥而增重的現(xiàn)象減輕[36]。Koutsos 等[37]在飲食中添加40 mg/kg 的葉黃素降低了生長緩慢的蛋型雛雞脾臟和肝臟的炎癥參數(shù)，并發(fā)現(xiàn)缺乏類胡蘿卜素會加重雛雞的全身炎癥反應(yīng)并且導(dǎo)致體重減輕。Gao等[38]研究發(fā)現(xiàn)，在飼糧中添加20、40 mg/kg的葉黃素可顯著降低母雞和雛雞肝臟、十二指腸、空腸、回腸中促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、IL-6 和干擾素-γ（IFNγ）和抗炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-10（IL-10）的表達(dá)。

對所有鳥類而言，添加類胡蘿卜素可增強(qiáng)對寄生蟲感染的抵抗力并刺激抗體產(chǎn)生、T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)和全身一氧化氮水平，保障一氧化氮作為細(xì)胞內(nèi)信號器和促氧化劑對抗感染的功能[39]。免疫激活可以降低鳥類循環(huán)中的類胡蘿卜素水平，在LPS誘導(dǎo)的急性期反應(yīng)中雞體內(nèi)法氏囊和胸腺細(xì)胞中的類胡蘿卜素會增加，而肝臟和血漿以及皮膚中的類胡蘿卜素則會減少，體現(xiàn)了類胡蘿卜素在免疫調(diào)節(jié)中的作用[40-42]。Gong 等[43]研究發(fā)現(xiàn)，飼料添加60 mg/kg 的β-胡蘿卜素對母雞免疫有積極影響，還可提高雞卵中免疫球蛋白的含量，有益于雛雞腸道健康。并對胚胎死亡率、免疫系統(tǒng)發(fā)育和后代生長都有積極的作用，且效果優(yōu)于傳統(tǒng)抗生素。

4.2 抗熱應(yīng)激作用

蛋雞沒有汗腺且全身布滿羽毛，體溫調(diào)節(jié)能力差，在高密度養(yǎng)殖條件下，蛋雞極易受到高溫應(yīng)激的影響，雖然在熱中性條件下轉(zhuǎn)錄因子Nrf2會被激活額外生成一組抗氧化分子，用于處理細(xì)胞內(nèi)增加的ROS，然而高溫會導(dǎo)致活性氧的產(chǎn)生增加和抗氧化防御系統(tǒng)的有效性降低，細(xì)胞會暴露在熱應(yīng)激引起的氧化應(yīng)激下。熱應(yīng)激會導(dǎo)致蛋雞生長發(fā)育遲緩、繁殖減少、產(chǎn)蛋量和肉質(zhì)降低，死亡率增加[44]。長期暴露在熱應(yīng)激下會導(dǎo)致生產(chǎn)損失，在極端情況下還會導(dǎo)致死亡。對于蛋雞生產(chǎn)，熱應(yīng)激會造成組織活性氧增加，損傷組織和細(xì)胞。也會使蛋雞血液中鈣水平降低，從而影響蛋殼的生成，降低蛋殼質(zhì)量。并通過對下丘腦和垂體激素分泌的影響直接降低卵巢功能[45]，熱應(yīng)激期間產(chǎn)生的過量ROS對胸腺、脾臟和法氏囊等免疫器官造成損傷，降低雞的免疫力[46]。通常情況下，不健康或患病的蛋雞會因為全身吸收和沉積類胡蘿卜素的效率較低而導(dǎo)致皮膚蒼白。此外，不健康的蛋雞會代謝已經(jīng)積累的類胡蘿卜素，以激活它們的免疫防御功能[1]。

類胡蘿卜素具有清除ROS 的能力，在蛋雞飼料中添加番茄紅素可以促進(jìn)Nrf2 表達(dá)，起到抗熱應(yīng)激的功能，日糧中添加5%的干番茄渣可降低高溫下雞的高密度脂蛋白膽固醇和三酰甘油水平，提高抗氧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）的活性[47]。在高溫環(huán)境下，蛋雞飼料中添加蝦青素會調(diào)節(jié)影響氧化還原、熱應(yīng)激以及脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá)，通過上調(diào)高密度脂蛋白和高密度脂蛋白受體的表達(dá)，提高血漿和肝臟中的SOD和GPx 的水平，使MDA 含量線性降低，增強(qiáng)蛋雞抗氧化能力和調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[48-49]。高密度脂蛋白與卵黃的形成密切相關(guān)，而蛋雞的脂質(zhì)代謝又主要集中于肝臟，肝臟健康對于蛋雞生產(chǎn)至關(guān)重要。類胡蘿卜素也有緩解熱應(yīng)激造成蛋雞免疫力下降的作用。5%水平的干番茄渣增加了熱應(yīng)激肉雞對綿羊紅細(xì)胞的總抗體效價和對新城疫的效價，并降低了異嗜性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞比率，緩解了由熱應(yīng)激引起的免疫力降低[50]，作為維生素A 的前體物質(zhì)，補(bǔ)充類胡蘿卜素可以使機(jī)體產(chǎn)生更多的維生素A，維生素A與抗體產(chǎn)生和T 細(xì)胞增殖有關(guān)，在熱應(yīng)激條件下母雞需要更多的維生素A 才能產(chǎn)生足夠的應(yīng)對新城疫疫苗的抗體[42]。

4.3 提高產(chǎn)品質(zhì)量

母雞蛋黃中的色素必須通過攝食獲得，類胡蘿卜素是天然的著色劑，類胡蘿卜素對雞的腳脛、胴體和腹部脂肪以及雞蛋有良好的著色功能。人們普遍更喜歡顏色更深更黃的雞蛋，類胡蘿卜的著色使得蛋雞產(chǎn)品擁有更好的品相，從而更受消費者青睞[51]，雞蛋也是人類重要的類胡蘿卜素來源[52]。而蛋雞可以通過膳食有效積累，如葉黃素、玉米黃質(zhì)、β-胡蘿卜素和角黃素、蝦青素等類胡蘿卜素，并儲存在蛋黃中[1]，蛋黃中積累的類胡蘿卜素可以提高雞蛋的營養(yǎng)價值。類胡蘿卜素的添加可以提高雞蛋的耐儲存性，在雞膳食中添加低劑量番茄紅素可以降低雞蛋中的MDA 含量，角黃素則可以降低雞蛋中的硫代巴比妥反應(yīng)物質(zhì)[53]，有效提高雞蛋的抗氧化能力和穩(wěn)定性。

5 結(jié)語

類胡蘿卜素具有增強(qiáng)免疫功能、抗氧化、抗炎、維持視覺功能等多種生物學(xué)功能，在蛋雞飼料中添加一定量的類胡蘿卜素能夠有效提高抗炎能力，增強(qiáng)免疫力，具有抗氧化、抗熱應(yīng)激、提高蛋品品質(zhì)等功能。但類胡蘿卜素作為飼料添加劑的應(yīng)用還主要集中于對蛋黃的著色功能上。類胡蘿卜素在蛋雞上作為著色功能外的配方尚不成熟，市場上缺少蛋黃著色劑功能以外的類胡蘿卜素飼料添加劑產(chǎn)品，未來需要進(jìn)一步研究合理的計量和配方，開發(fā)類胡蘿卜素抗炎抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等多種功能，充分發(fā)揮其作為蛋雞飼用添加劑更大的潛力。