任立桐 姚志城 喻曉龍

[1.北京中醫(yī)藥大學(xué)深圳醫(yī)院（龍崗）急診科，廣東 深圳 518172；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)深圳醫(yī)院（龍崗）骨傷科，廣東 深圳 518172]

骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）是一種由許多因素造成的關(guān)節(jié)退行疾病[1]，常見于老年人。隨著老齡化的逐漸加深，以及肥胖人群的增加，患骨關(guān)節(jié)炎的患者有明顯上升趨勢。骨關(guān)節(jié)炎的主要特征表現(xiàn)在軟骨上[2]，關(guān)節(jié)炎讓軟骨退化，引起軟骨下骨的變化，以及造成骨贅形成、滑膜炎癥和骨關(guān)節(jié)炎，并逐步損壞關(guān)節(jié)軟骨，讓患者的關(guān)節(jié)功能受限，肌肉僵硬。雖然當前仍然沒有明確引發(fā)骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病因素，但是有報道顯示，骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病因素被年齡、性別、肥胖等影響。研究[3]顯示，目前已確認NF-κB 轉(zhuǎn)錄因子在骨關(guān)節(jié)炎中表達非常活躍，也是導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎的疾病因子。NF-κB 在骨關(guān)節(jié)炎的許多發(fā)病環(huán)節(jié)都有體現(xiàn)，比如軟骨細胞分解代謝、軟骨細胞存活和滑膜炎癥。另有研究[4，5]表明，在骨關(guān)節(jié)炎軟骨中SOX9 的基因表達水平降低[4]，并且SOX9 的蛋白表達水平也有降低，而miR-19a 作為一種新的生物標志物，具有非入侵、敏感以及可靠的特性，多用來診斷和評估多種惡性腫瘤以及其他炎癥性疾病。還有研究[6]發(fā)現(xiàn)，牛膝總皂苷對關(guān)節(jié)軟骨具有保護作用，同時能達到保護軟骨細胞的目的。因此，本研究旨在基于NF-κB 信號通路探討牛膝總皂苷治療膝骨性關(guān)節(jié)炎滑膜炎癥的效果機制，現(xiàn)作報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 動物選擇SPF 級SD 大鼠60 只，雌雄各半，10 周齡，體質(zhì)量（260±10）g，購自廈門大學(xué)實驗動物中心，動物合格證號：scxK（閩）2021—012。將大鼠分籠飼養(yǎng)，按照需求飲食，調(diào)節(jié)室內(nèi)溫度至適宜。本動物研究實驗已經(jīng)過批準。

1.1.2 藥物牛膝總皂苷（Total saponins of achyranthes，TSA，（陜西森弗生物技術(shù)有限公司），含量70.2%；TRIzol 試劑、PrimeScriptTMRT 試劑盒（美國Sigma 公司）；SYBR Premix Ex Taq 實時熒光定量試劑盒（日本Takara 公司）；SYBR Green PCR Master Mix 試劑盒（美國BD 公司）；蛋白酶抑制劑、BCA 蛋白質(zhì)試劑盒、蛋白酶抑制劑的放射免疫沉淀測定緩沖液（北京索萊寶科技有限公司）；PVDF 膜（美國PeproTech 公司）；SOX9、NF-κB 一抗、單克隆GAPDH 抗體、熒光染料標記的二抗（武漢博士德生物有限公司）；引物由上海羽朵生物科技有限公司合成。

1.2 方法大鼠隨機分成5 組：對比組、模型組、牛膝總皂苷低劑量組（15 mg·kg-1）、牛膝總皂苷中劑量組（30 mg·kg-1）、牛膝總皂苷高劑量組（50 mg·kg-1），每組12 只。除對比組外，其他各組大鼠在關(guān)節(jié)兩側(cè)進針，從第1 天開始每間隔2 d 分別注射0.3 mL l5%木瓜蛋白酶水溶液（美國Sigma 公司，批號：MFCD00131791）到大鼠膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)。隨后采用kquesne MG 評估方式，對大鼠膝關(guān)節(jié)進行評估，若評分＞4 分則表示模型建立成功；在建造好模型后第7 天，讓牛膝總皂苷低、中、高劑量組分別進行灌胃，計量分別為牛膝總皂苷60、120、240 μg/g，對比組和模型組用相等體積的水進行灌胃，每天1 次，連續(xù)1 個月。

1.3 觀察指標（1）各組大鼠的炎癥程度比較。給藥完成后，對大鼠關(guān)節(jié)炎癥進行評分，按照腫脹嚴重程度分為5 級，0 分無腫脹、1 分為輕度、2 分為中度、3分為嚴重、4 分為變形。（2）各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細胞miR-19a、SOX9、NF-κB 表達水平比較。選用TRIzol試劑，提取膝關(guān)節(jié)軟骨細胞總DNA，檢測miR-19a、SOX9、NF-κB 基因水平。（3）各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細胞SOX9、NF-κB 蛋白表達水平比較。使用1%的蛋白酶抑制劑檢測緩沖液，得到膝關(guān)節(jié)軟骨細胞總蛋白質(zhì)，再使用BCA 蛋白試劑盒檢測其濃度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法研究數(shù)據(jù)運用SPSS 20.0 軟件進行處理，計數(shù)資料以率（%）表示，行χ2檢驗；計量資料以（）表示，行t 檢驗。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細胞miR-19a、SOX9、NF-κB 表達水平比較與對比組比較，模型組的miR-19a 表達水平較低，SOX9、NF-κB 表達水平較高（P ＜0.05）；使用了牛膝總皂苷的3 組，按照劑量的不同，miR-19a 表達水平從低劑量到高劑量依次增高（P ＜0.05），而SOX9、NF-κB 表達水平依次降低（P ＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細胞miR-19a、SOX9、NF-κB 表達水平比較 （）

表1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細胞miR-19a、SOX9、NF-κB 表達水平比較 （）

注：與對比組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05；與牛膝總皂苷低劑量組比較，3）P＜0.05；與牛膝總皂苷中劑量組比較，4）P＜0.05。

2.2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)腫脹度程度比較與對比組比較，模型組的腫脹程度相對嚴重（P ＜0.05），使用了牛膝總皂苷的3 組，按照劑量的不同，服用劑量從低到高關(guān)節(jié)腫脹程度依次減輕，牛膝總皂苷中劑量組腫脹程度評分低于牛膝總皂苷低劑量組，牛膝總皂苷高劑量組腫脹程度評分低于牛膝總皂苷低劑量組和中劑量組（P ＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)腫脹度程度評分比較 （，分）

表2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)腫脹度程度評分比較 （，分）

注：與對比組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05；與牛膝總皂苷低劑量組比較，3）P＜0.05；與牛膝總皂苷中劑量組比較，4）P＜0.05。

2.3 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細胞SOX9、NF-κB 蛋白表達水平比較與對比組比較，模型組SOX9、NF-κB 蛋白表達水平較高，使用了牛膝總皂苷的3 組，按照劑量的不同，SOX9、NF-κB 蛋白表達水平從低劑量到高劑量依次降低（P ＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細胞SOX9、NF-κB 蛋白表達水平比較（）

表3 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細胞SOX9、NF-κB 蛋白表達水平比較（）

注：與對比組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05；與牛膝總皂苷低劑量組比較，3）P＜0.05；與牛膝總皂苷中劑量組比較，4）P＜0.05。

3 討論

過往實驗[7]證明，SOX9 是NF-κB 的靶基因，而NF-κB 是影響骨關(guān)節(jié)炎的主要因子，NF-κB 會引起軟骨細胞凋亡，如果使用川芎嗪則可以通過調(diào)節(jié)SOX9 來保護軟骨細胞免受誘導(dǎo)引起損傷。近年有學(xué)者發(fā)現(xiàn)[8]，通過NF-κB 的過表達能夠模擬骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過程，而使用NF-κB 拮抗劑可抑制NF-κB 的表達水平。同樣，如果NF-κB 在軟骨以及滑膜組織中表達水平居高[9]，可以用NF-κB 拮抗劑降低NF-κB 的表達水平。由此可見，NF-κB 在降低軟骨基質(zhì)膠原蛋白和蛋白多糖合成分泌，修復(fù)軟骨損傷，加快骨關(guān)節(jié)炎的過程中有巨大作用。并且，有其他研究[10]表明，miR-19a 的過表達能夠促進軟骨細胞的活躍度和遷移，從而抑制細胞凋亡，這說明miR-19a 對控制軟骨細胞的生成有很大作用。

本研究顯示，與對比組比較，模型組的膝關(guān)節(jié)腫脹程度較嚴重，miR-19a 的基因表達水平較低，而SOX9、NF-κB 的基因水平表達較高，使用牛膝總皂苷的3 組，根據(jù)劑量的增加腫脹水平依次降低，miR-19a基因表達水平依次增加，而SOX9 以及NF-κB 的基因表達水平和蛋白表達水平依次降低。這說明牛膝總皂苷可上調(diào)miR-19 的表達[11]，從而激活SOX9mRNA 以及SOX9 蛋白表達，能在一定程度上抑制NF-κBmRNA 表達和蛋白表達。綜上所述，牛膝總皂苷能減輕骨關(guān)節(jié)炎的炎癥癥狀，并且能通過上調(diào)miR-19a 的表達，抑制SOX9、NF-κB 的表達水平，保護軟骨細胞的凋亡，采用牛膝總皂苷的治療方案可在臨床上大力推廣。