吳裕健，張棟，明雙喜，張紅霞，劉偉，楊穎

1. 山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院（濟(jì)南 250101）；

2. 山東省特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心（濟(jì)南 250101）

膳食纖維（Dietary Fiber，DF）是一種包含纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、果膠及可溶性多糖等多種成分的混合物，被稱為繼碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、礦物質(zhì)和水之后的“第七大營(yíng)養(yǎng)素”[1]，具有零能量、防治肥胖、延緩和阻礙葡萄糖在體內(nèi)的吸收、降低血清膽固醇、促進(jìn)腸道有益菌的生長(zhǎng)、抑制發(fā)酵有毒產(chǎn)物、通便潤(rùn)腸、防治腸癌等生理功能[2]。按溶解性，膳食纖維可分為水溶性（SDF）和水不溶性（IDF）兩種，SDF和IDF的生理功能不同，SDF的持水力高、發(fā)酵作用較好，具有降低血脂、促進(jìn)消化道的消化吸收等作用，而IDF可以增加糞便的含水量和體積，促進(jìn)排泄[3]。對(duì)嬰幼兒來(lái)說(shuō)，母乳中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)非常豐富，其中富含的母乳低聚糖（Human milk oligosaccharide，HMOs）起到了維持腸道菌群的平衡，防止便秘以及促進(jìn)腸道營(yíng)養(yǎng)素吸收的作用[4]。然而，受多種因素的影響，我國(guó)純母乳喂養(yǎng)的嬰兒只占總數(shù)的27%[5]，因此，嬰幼兒配方奶粉就成為必不可少的母乳替代品，為了模擬母乳中的各種營(yíng)養(yǎng)成分，促進(jìn)嬰幼兒健康成長(zhǎng)，嬰幼兒配方奶粉生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)添加一些營(yíng)養(yǎng)素，并且添加具有母乳低聚糖生物功能的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)已成為重點(diǎn)研究方向之一。目前國(guó)產(chǎn)嬰幼兒配方奶粉中通常添加低聚果糖（FOS）、低聚半乳糖（GOS）等膳食纖維來(lái)模擬母乳低聚糖的作用，基于此，文章對(duì)嬰幼兒配方奶粉中的膳食纖維在國(guó)內(nèi)的應(yīng)用及檢測(cè)方法進(jìn)行論述，以期為嬰幼兒配方奶粉中膳食纖維的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用與檢測(cè)提供參考。

1 膳食纖維在國(guó)產(chǎn)嬰幼兒配方奶粉中的應(yīng)用

HMOs的最高濃度出現(xiàn)在初乳中，為20～23 g/L，然后下降到成熟奶至12～14 g/L[6]，HMOs組分極其復(fù)雜，迄今為止，已發(fā)現(xiàn)200種HMOs，分離和鑒定了至少157種不同的HMOs結(jié)構(gòu)[7]。動(dòng)物乳低聚糖不具有HMOs的多樣性，且多數(shù)哺乳動(dòng)物乳低聚糖屬于酸性低聚糖，中性低聚糖含量較少，與HMOs剛好相反，因此很難從動(dòng)物乳中大規(guī)模獲取與母乳成分類似的低聚糖[8]，尋找適合嬰兒生長(zhǎng)發(fā)育的非乳源低聚糖一直以來(lái)為人們所重視。國(guó)外嬰兒配方乳粉中通常會(huì)加入乳酮糖來(lái)模擬HMOs，用以促進(jìn)雙歧桿菌增殖。國(guó)內(nèi)關(guān)于乳酮糖在乳粉中的應(yīng)用還比較少，主要是在嬰幼兒配方乳粉中加入水溶性膳食纖維如低聚果糖、低聚半乳糖等，用以模擬HMOs分子大小分布[9]及調(diào)節(jié)腸道菌群、促進(jìn)排便、提高免疫、減少感染、緩解過(guò)敏及特應(yīng)性皮炎的作用[10]。GB 14880—2012《食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[11]（以下簡(jiǎn)稱GB 14880）表C.2中規(guī)定可在嬰幼兒配方奶粉中添加的膳食纖維共5種，包括低聚果糖（菊苣來(lái)源）（FOS）、低聚半乳糖（乳糖來(lái)源）（GOS）、多聚果糖（菊苣來(lái)源）、棉子糖（甜菜來(lái)源）和聚葡萄糖，前四種要求單獨(dú)或混合使用，該類物質(zhì)總量不超過(guò)64.5 g/kg，而聚葡萄糖要求15.6～31.25 g/kg。文章收集不同品牌不同配方的國(guó)產(chǎn)嬰幼兒配方奶粉198批次作為研究對(duì)象，共涵蓋66個(gè)品牌的嬰兒、較大嬰兒和幼兒配方奶粉，地區(qū)覆蓋我國(guó)山東、陜西、黑龍江等16個(gè)省，通過(guò)研究標(biāo)簽發(fā)現(xiàn)，198批次中共有159批次添加了膳食纖維，其中無(wú)添加的產(chǎn)品僅占19.5%，GOS和FOS的組合添加占比50%，位列第一，其次是單獨(dú)FOS添加，占比18%，單獨(dú)添加多聚果糖、聚葡萄糖都較少，占比1.5%，棉子糖在成品中均未添加（見(jiàn)表1）。從表1中可以看出，膳食纖維的總添加量低于GB 14880的要求或在GB 14880要求的下限，但接近于HMOs的含量，企業(yè)在生產(chǎn)中均最大限度模擬HMOs功能，但HMOs功能復(fù)雜，添加多少能真正起到模擬母乳低聚糖的作用尚值得探討。

表1 嬰幼兒配方奶粉膳食纖維的添加情況

2 我國(guó)嬰幼兒配方奶粉中膳食纖維的國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法

目前，我國(guó)檢測(cè)膳食纖維的標(biāo)準(zhǔn)主要有GB 5009.88—2014[12]和GB/T 22224—2008[13]，以上兩種方法均不能測(cè)定低聚糖的含量。若單一添加低聚果糖、多聚果糖，采用GB 5009.255—2016[14]。添加聚葡萄糖，采用GB 5009.245—2016[15]。添加低聚半乳糖目前沒(méi)有相應(yīng)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，每個(gè)檢測(cè)機(jī)構(gòu)采用各自內(nèi)部方法進(jìn)行檢驗(yàn)，因企業(yè)未添加棉子糖文章未討論。

2.1 國(guó)標(biāo)中總膳食纖維的測(cè)定

2.1.1 GB 5009.88—2014[12]

GB 5009.88—2014適用于所有植物性食品及其制品中總的（TDF）、可溶性（SDF）和不溶性（IDF）膳食纖維的測(cè)定，但不包括低聚果糖、低聚半乳糖、聚葡萄糖、抗性麥芽糊精、抗性淀粉等膳食纖維組分，原理是用酶解消化的方法去除蛋白質(zhì)和可消化的淀粉。TDF是先將樣品分別加入三種不同的酶進(jìn)行酶解，并加入乙醇沉淀1 h，再抽濾得到殘?jiān)?，分別用乙醇和丙酮洗滌殘?jiān)?，烘干稱重。IDF和SDF則是樣品酶解后抽濾得到濾液和殘?jiān)?，?jīng)熱水沖洗殘?jiān)?，干燥稱重得IDF，濾液用乙醇沉淀后抽濾洗滌干燥稱重校正得SDF，這三種含量的校正是通過(guò)蛋白質(zhì)質(zhì)量、灰分質(zhì)量和試劑空白來(lái)進(jìn)行的，該方法對(duì)添加了低聚糖的嬰幼兒配方奶粉不能進(jìn)行有效的全面檢測(cè)。2021年7月15日，國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)委托中國(guó)疾病預(yù)防控制中心營(yíng)養(yǎng)與健康所和北京市營(yíng)養(yǎng)源研究所對(duì)GB 5009.88—2014[12]的修訂通過(guò)了專家審查，此次修訂對(duì)現(xiàn)行方法中酶重量法的試樣前處理?xiàng)l件進(jìn)行了調(diào)整，調(diào)整了酶解體系，將標(biāo)準(zhǔn)適用范圍擴(kuò)大到植物性食品及其制品以及添加了膳食纖維組分的各類食品的測(cè)定，并增加了酶重量-液相色譜法，使方法盡可能覆蓋符合膳食纖維定義及允許添加的組分，彌補(bǔ)了現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法適用基質(zhì)范圍窄、檢測(cè)組分種類少的不足。

2.1.2 GB/T 22224—2008[13]

GB/T 22224—2008中第二法酶重量法-液相色譜法有效，第一法已被GB 5009.88替代，該方法僅適用于含有抗性麥芽糊精的食品中總膳食纖維的測(cè)定。原理是先采用酶重量法測(cè)定IDF和高分子質(zhì)量SDF的總含量，然后用高效液相色譜法測(cè)定試樣中的低分子質(zhì)量抗性麥芽糊精的含量，最后加和計(jì)算出總膳食纖維的含量，與其他方法相比，該方法需要更長(zhǎng)的時(shí)間，同時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)技能和設(shè)備的要求也更高，但酶重量法-液相色譜法較酶重量法具有較好的重現(xiàn)性。

2.2 國(guó)標(biāo)中單一添加低聚果糖、多聚果糖、聚葡萄糖的檢測(cè)方法

2.2.1 GB 5009.255—2016[14]

GB 5009.255—2016明確規(guī)定適用于單一添加低聚果糖、多聚果糖的產(chǎn)品的檢測(cè)。原理是試樣經(jīng)熱水浸提，樣液中的蔗糖經(jīng)蔗糖酶水解成葡萄糖和果糖，加入硼氫化鈉溶液，將相應(yīng)的糖醇還原，預(yù)估果聚糖含量后加入果聚糖酶使之水解成果糖和葡萄糖，用離子色譜-脈沖安培檢測(cè)器檢測(cè)果糖質(zhì)量濃度，通過(guò)校正系數(shù)折算得到果聚糖的含量。該方法能準(zhǔn)確測(cè)定配方乳粉中低聚果糖的含量，但也有前處理復(fù)雜、耗時(shí)較長(zhǎng)等缺點(diǎn)。另外，果聚糖水解產(chǎn)物都是果糖和葡萄糖，對(duì)于非單一添加的果聚糖，由于無(wú)法估量平均聚合度，因此該方法不適用。

2.2.2 GB 5009.245—2016[15]

GB 5009.245—2016適用于添加聚葡萄糖的產(chǎn)品的檢測(cè)。原理是食品中聚葡萄糖經(jīng)熱水浸提、超濾離心后，濾液經(jīng)酶解去除淀粉、果聚糖等干擾物后，再用離子色譜-脈沖安培檢測(cè)器定量測(cè)定聚葡萄糖含量。由于檢測(cè)方法使用的檢測(cè)條件和標(biāo)準(zhǔn)品單一，測(cè)定結(jié)果與實(shí)際添加量存在一定差異。

3 膳食纖維檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

目前對(duì)于嬰幼兒配方奶粉中允許添加的膳食纖維還缺乏部分檢驗(yàn)方法，為了保障嬰幼兒的健康，國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)制修訂并發(fā)布了3項(xiàng)嬰幼兒配方食品標(biāo)準(zhǔn)，包含GB 10765—2021[16]、GB 10766—2021[17]和GB 10767—2021[18]，其中明確規(guī)定膳食纖維的含量可按低聚糖和（或）多聚糖的添加量計(jì)算，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)于單一添加或組合添加低聚糖、多聚糖的檢測(cè)方法的研究也在不斷地深入，主要有分光光度法[19]、高效液相色譜法（HPLC法）[20,22-26]、離子色譜法（IC法）[27-30]和高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS法）[31-33]。文章結(jié)合近年研究動(dòng)態(tài)，比較膳食纖維測(cè)定各方法的特點(diǎn)，以期為開(kāi)發(fā)出適用性更強(qiáng)、效率及精準(zhǔn)度更高的膳食纖維檢測(cè)方法提供參考依據(jù)。

3.1 分光光度法

3.1.1 酶-分光光度法

AOAC 999.03[19]分別采用蔗糖酶、果聚糖酶水解蔗糖和果聚糖，用分光光度法測(cè)得水解產(chǎn)物果糖含量，通過(guò)折算系數(shù)計(jì)算得到果聚糖的含量。由于計(jì)算過(guò)程中采用的折算系數(shù)，沒(méi)有考慮到果聚糖的不同化學(xué)結(jié)構(gòu)形式，檢測(cè)結(jié)果有時(shí)準(zhǔn)確有時(shí)偏低。

3.2 高效液相色譜法（HPLC法）

3.2.1 高效液相色譜-示差檢測(cè)法（HPLC-示差檢測(cè)法）

鄧偉恒等[20]以 GB/T 23528—2009《低聚果糖》[21]為基礎(chǔ)，通過(guò)前處理通過(guò)等量加入亞鐵氰化鉀溶液和乙酸鋅溶液除去樣品中的蛋白質(zhì)、脂肪等物質(zhì)，獲得澄清溶液，以乙腈/水（75∶25，V/V）為流動(dòng)相等度洗脫，利用氨基柱分離，示差檢測(cè)器檢測(cè)，測(cè)定低聚果糖的具體組分蔗果三糖（GF2）、蔗果四糖（GF3）和蔗果五糖（GF4）。該方法前處理簡(jiǎn)單快捷、定量準(zhǔn)確，但示差檢測(cè)器不能進(jìn)行梯度洗脫，靈敏度低，對(duì)于測(cè)定含量在1 g/100 g以下的樣品時(shí)，結(jié)果偏差較大。

3.2.2 高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法（HPLC-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法）

張書(shū)芬等[22]通過(guò)對(duì)樣品進(jìn)行酶解法前處理，采用ZORBAX Carbohydrate糖分析專用柱、乙腈-水（85∶15）為流動(dòng)相、霧化氣流量1.6 mL/min的優(yōu)化條件，建立了一種HPLC-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法測(cè)定低聚果糖的方法，該方法回收率為86.7%～105.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%，使用的儀器設(shè)備價(jià)格低廉、屬于實(shí)驗(yàn)室基本配置，因此有較大的實(shí)際應(yīng)用和推廣價(jià)值。

張麗等[23]建立了一種檢測(cè)乳粉中低聚果糖和低聚半乳糖的HPLC-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法，方法采用水和乙腈為流動(dòng)相梯度洗脫，糖柱分離后蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)，經(jīng)過(guò)優(yōu)化，確認(rèn)最佳試驗(yàn)條件：乙腈為沉淀劑，酶解pH 6.0，酶解溫度25 ℃，酶解時(shí)間 50 min。該方法回收率為92.52%～106.00%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5.12%。該方法前處理未對(duì)乳糖進(jìn)行預(yù)處理，當(dāng)樣品乳糖含量較高時(shí)，酶解產(chǎn)生的半乳糖也較高，對(duì)低聚半乳糖的結(jié)果會(huì)產(chǎn)生較大的影響，所以該檢測(cè)方法要求乳粉中的乳糖含量不能過(guò)高，適用于乳糖和低聚半乳糖的含量比值小于8的樣品中低聚果糖和低聚半乳糖的檢測(cè)。

Zhang等[24]建立了HPLC-蒸發(fā)光散射法測(cè)定嬰兒奶粉中的低聚半乳糖的方法，該方法采用酰胺柱，以乙腈與水（83∶17，V/V）為流動(dòng)相，通過(guò)減少進(jìn)樣量，差向異構(gòu)體峰分辨率優(yōu)化，將GOS的峰分辨率從4.0提高到8.0，GOS的線性關(guān)系幾乎不受葡萄糖含量高的影響。該方法具有良好的線性和穩(wěn)定性，回收率為90.5%～105.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.72%～5.81%，該方法靈敏度高、準(zhǔn)確度高、樣品制備方便，消除復(fù)雜基質(zhì)干擾，解決了樣品中高乳糖的干擾，符合嬰兒配方奶粉中高GOS含量定量分析的法定限值要求。

3.2.3 高效液相色譜熒光檢測(cè)法（HPLC-熒光檢測(cè)法）

林慧等[25]建立了一種柱前衍生HPLC-熒光檢測(cè)法測(cè)定低聚半乳糖含量的分析方法。樣品用2-氨基苯甲酰胺衍生后，經(jīng)色譜柱分離，用髙效液相色譜-熒光檢測(cè)器檢測(cè)，外標(biāo)峰加和分段法定量。方法回收率為85.9%～103.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%，解決了嬰幼兒配方乳粉中高含量乳糖對(duì)低聚半乳糖測(cè)定的干擾問(wèn)題。

Cuany等[26]建立了一種HPLC-熒光檢測(cè)法測(cè)定嬰配中GOS的方法，該方法取稀釋樣品的兩等分試樣，一份用淀粉葡萄糖苷酶處理，以水解試樣中所有的麥芽低聚糖，另一份用β-半乳糖苷酶處理，以水解試樣中所有的GOS，將內(nèi)標(biāo)物（昆布三糖）添加到兩份等分試樣中，并用2-氨基苯甲酰胺熒光標(biāo)記低聚糖，用乙腈中的甲酸銨水溶液梯度分離分析物，用高效液相色譜-熒光檢測(cè)器檢測(cè)，兩次測(cè)量之間測(cè)定的低聚糖的差值即是樣品的GOS含量。該方法回收率為91.5%～102%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.7%～5.99%，適用于高乳糖含量的嬰配產(chǎn)品。

3.3 離子色譜法（IC法）

白靖等[27]建立了果糖酶水解后采用IC法測(cè)定乳粉中多聚果糖的方法，緩沖鹽體系優(yōu)選醋酸緩沖液，加入果聚酶，酶解溫度選定60 ℃，酶解時(shí)間優(yōu)化至1 h，使多聚果糖全部酶解為果糖，然后用IC法分別測(cè)定樣品酶解前后果糖及蔗糖的含量，計(jì)算得到多聚果糖的含量，對(duì)含麥芽糊精的樣品需加入葡聚酶水解成葡萄糖，解決濾液渾濁和過(guò)濾不暢的問(wèn)題，方法平均回收率為97.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差3.56%。該方法樣品前處理簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、靈敏度高。

朱偉等[28]建立了一種同時(shí)測(cè)定嬰幼兒配方乳粉中低聚果糖、低聚半乳糖的IC法檢測(cè)技術(shù)，優(yōu)選CarboPac PA20色譜柱分離，采用氫氧化鈉和乙酸鈉溶液進(jìn)行梯度洗脫。該方法功能性低聚糖能得到很好分離，回收率為80.0%～103%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3%。

冉丹等[29]建立以電化學(xué)脈沖安培-IC法檢測(cè)嬰幼兒配方乳粉中低聚半乳糖含量的方法。采用離子色譜法檢測(cè)經(jīng)β-半乳糖苷酶酶解的原料糖漿試樣中低聚半乳糖含量，再以測(cè)得低聚半乳糖含量的同批次原料糖漿作為對(duì)照，檢測(cè)嬰幼兒配方乳粉中低聚半乳糖含量。該方法線性關(guān)系良好，準(zhǔn)確度較高，加標(biāo)回收率為87.7%～92.4%，SRSD為3.5%，為高乳糖含量產(chǎn)品中GOS檢測(cè)提供了新思路。

張志國(guó)等[30]建立了指紋圖譜法測(cè)定嬰幼兒配方乳粉中低聚半乳糖含量的方法，利用離子色譜構(gòu)建低聚半乳糖指紋圖譜，分析得到特征組分，進(jìn)而測(cè)定嬰幼兒配方乳粉中低聚半乳糖含量，該方法回收率為94.0%～106.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差1.2%～2.8%。樣品前處理簡(jiǎn)便快速，定量準(zhǔn)確，重現(xiàn)性良好，不需購(gòu)買復(fù)雜的標(biāo)準(zhǔn)樣品，解決了不同企業(yè)生產(chǎn)的低聚半乳糖組分復(fù)雜不易檢測(cè)的技術(shù)難題。

3.4 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS法）

甄振鵬等[31]建立了乳粉中低聚果糖的LC-MS檢測(cè)方法，乙醇與水以7∶3的比例提取凈化樣品，離心移取上清液，采用XBridge Amide色譜柱，二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)器，負(fù)離子模式進(jìn)行檢測(cè)，該方法前處理簡(jiǎn)單、快速，靈敏度、準(zhǔn)確度高。

劉蕓等[32]建立了LC-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜法測(cè)定奶粉中低聚果糖的方法，乳粉樣品用水溶解后，加乙酸鋅沉淀蛋白，離心過(guò)濾后，采用Carbohyduate色譜柱進(jìn)行分離，以乙腈與0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，正離子掃描模式，該方法前處理過(guò)程簡(jiǎn)便，分析時(shí)間短，能很好排除樣品中的基質(zhì)干擾，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確。

甄振鵬等[33]還建立了LC-MS法測(cè)定乳粉中的低聚半乳糖，同樣采用XBridge Amide色譜柱，流動(dòng)相采用乙腈水溶液進(jìn)行洗脫，電噴霧質(zhì)譜負(fù)離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）檢測(cè)，該方法靈敏度高、定量準(zhǔn)確，可以實(shí)現(xiàn)批量化檢測(cè)，能有效提高工作效率、降低分析成本。

4 結(jié)語(yǔ)

膳食纖維在我國(guó)嬰幼兒配方奶粉的應(yīng)用尚在探索中，企業(yè)在生產(chǎn)中均最大限度模擬HMOs功能，但HMOs功能復(fù)雜，國(guó)內(nèi)外研究還不完善，HMOs結(jié)構(gòu)及組成、功能替代營(yíng)養(yǎng)源以及膳食纖維的添加種類、添加量、添加方式等都需進(jìn)行深入研究。隨著研究成果的不斷積累，建議在今后標(biāo)準(zhǔn)修訂中及時(shí)補(bǔ)充嬰幼兒配方奶粉中膳食纖維的添加種類、添加量等相關(guān)參數(shù)，方便指導(dǎo)和改進(jìn)嬰幼兒配方奶粉的生產(chǎn)。目前膳食纖維的國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法的修訂工作已審查通過(guò)，正處在向社會(huì)征求意見(jiàn)階段，修訂稿調(diào)整了酶解體系，并增加了酶重量-液相色譜法，彌補(bǔ)了現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法適用基質(zhì)范圍窄、檢測(cè)組分種類少的不足。相信隨著研究的深入發(fā)展和新國(guó)標(biāo)的發(fā)布實(shí)施，膳食纖維在嬰幼兒配方奶粉的生產(chǎn)中應(yīng)用和檢測(cè)技術(shù)能得到更高效、更完善的發(fā)展，從而進(jìn)一步促進(jìn)嬰幼兒配方奶粉產(chǎn)業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展。