劉恒睿，于鈺潔，孟錦濤，劉春娥

中國農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺(tái)研究院（煙臺(tái) 264670）

大菱鲆（Scophthalmus maximus）是菱鲆屬魚類[1]，含有豐富的氨基酸、多不飽和脂肪酸及維生素[2]。水產(chǎn)品死后易腐敗，延長其貨架期一直是研究的熱點(diǎn)。可食膜保鮮具有操作簡單、效果好、無污染等特點(diǎn)，被逐步應(yīng)用于水產(chǎn)品的保鮮[3-4]。根據(jù)使用的基材不同，可食膜可分為多糖類、蛋白類、脂質(zhì)類及復(fù)合類[5]。復(fù)合膜中多糖、蛋白質(zhì)的種類、含量不同，膜的性質(zhì)也不同，可滿足不同食品的保鮮需要。

普魯蘭多糖具有耐酸堿性、吸附性、黏稠性、可降解性、成膜性和膜不透性[6-7]。Chen等[8]以2%～3%的普魯蘭多糖處理冷藏下的尼羅魚片，結(jié)果發(fā)現(xiàn)魚片的感官評價(jià)有所改善。明膠具有可降解性，可抑制褐變，防止吸潮，保持食品風(fēng)味。Antoniewski等[9]使用20%的明膠保鮮4 ℃下貯藏的鮭魚，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其汁液損失率顯著降低。明膠與多糖的相容性優(yōu)良，與二者的單膜相比，復(fù)合膜的抗氧化性、抑菌性和阻隔性能均得到了改善[10]。董汝月等[4]使用6%的明膠和2%殼聚糖溶液制作成膜液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其可延緩4 ℃下南美白對蝦的黑變。

此次試驗(yàn)研究了普魯蘭多糖-明膠復(fù)合膜對低溫下大菱鲆魚片的保鮮效果，通過測定魚片的感官評價(jià)、pH、持水力、TBA值、TVB-N含量、菌落總數(shù)和優(yōu)勢菌，分析保鮮劑在延緩冷藏下大菱鲆魚片腐敗的作用，為大菱鲆的保鮮提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮大菱鲆（煙臺(tái)市高新區(qū)漁窩窩海鮮超市），每條質(zhì)量1±0.2 kg，30 min內(nèi)帶水活運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。

食品級普魯蘭多糖、食用明膠（河南萬邦實(shí)業(yè)有限公司）；PCA瓊脂培養(yǎng)基（杭州微生物試劑有限公司）；硼酸（AR）、丙三醇（AR）、碳酸鉀（AR）、乙二酸四乙酸二鈉（AR）、無水乙醇（AR）、2-硫代巴比妥酸（AR）、三氯乙酸（AR）、1, 1, 3, 3-四乙氧基丙烷（AR）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；0.01 mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液、甲基紅-溴甲酚綠混合指示劑（廣州和為醫(yī)藥科技有限公司）；生理氯化鈉溶液（安徽豐原藥業(yè)股份有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C型pH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；TGL-16G型臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；UV754N型紫外可見分光光度計(jì)（上海佑科儀器儀表有限公司）；DH209D型電熱恒溫培養(yǎng)箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；BHS-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋（江陰市保利科研器械有限公司）；BL-388型冷藏展示柜（青島英迪菲電器有限公司）；MGC-100型光照培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 涂膜保鮮液的制備

配制3種保鮮液，分別為0.1%的普魯蘭多糖溶液，1.5%的明膠溶液和0.1%普魯蘭多糖+1.5%明膠混合溶液，各500 mL，置于4 ℃冰箱中備用。

1.3.2 大菱鲆魚片的制備

鮮活大菱鲆剖殺后去頭、尾及內(nèi)臟，將背部新鮮魚肉去皮后切成3 cm×3 cm×1 cm的魚片，用生理氯化鈉溶液沖洗干凈，瀝水。

1.3.3 涂膜處理

試驗(yàn)設(shè)四個(gè)組別，即空白組、多糖組、明膠組和復(fù)合組。將魚片隨機(jī)分組，浸泡于對應(yīng)涂膜液中，5 min后取出，置于潔凈干燥的封口袋中于4 ℃冰箱中保存。

1.3.4 指標(biāo)測定

以樣品處理當(dāng)天為第0天，分別于第0，第2，第4，第6，第8，第10，第12和第14天測定各組pH、TVB-N含量、TBA值并進(jìn)行感官評價(jià)，于第0，第2，第4，第6和第8天測定各組持水力及菌落總數(shù)。

1.3.4.1 感官評價(jià)

感官評定由5名有感官評定經(jīng)驗(yàn)的人員進(jìn)行，分值由低到高為1～5分。從色澤、氣味、質(zhì)地和紋理等方面分別對各組魚片進(jìn)行評分，具體評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 大菱鲆魚片綜合感官評價(jià)表

1.3.4.2 pH測定

參照 GB/T 9695.5—2008《肉與肉制品pH測定》[11]對各組魚片的pH進(jìn)行測定。

1.3.4.3 持水力的測定

稱取1 g（精確到0.001 g）魚肉，用脫脂棉包好，放入5 mL離心管中，在9 000 r/min下離心10 min。取出樣品，除去脫脂棉，稱肉樣重。按式（1）計(jì)算持水力。式中：W1為離心前樣品的質(zhì)量，m；W2為離心后樣品的質(zhì)量，m。

1.3.4.4 TVB-N含量的測定

參照 GB 5009.228—2016《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》[12]測定各組TVB-N含量。

1.3.4.5 TBA值的測定

參照GB 5009.181—2016《食品中丙二醛的測定》[13]測定各組TBA值。

1.3.4.6 菌落總數(shù)的測定

參照 GB 4789.2—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)的測定》[14]測定各組菌落總數(shù)。

1.3.4.7 優(yōu)勢菌的測定

選取空白組第3天的樣品、多糖組和明膠組第4天的樣品、復(fù)合組第6天的樣品進(jìn)行優(yōu)勢菌的測定。

從1.3.4.6小節(jié)中選擇菌落數(shù)為30～300的平板，挑取優(yōu)勢菌落，采用2216E培養(yǎng)基分離純化，培養(yǎng)基配方見表2。

表2 2216E培養(yǎng)基的配方（1 L）

使用Tris飽和酚-氯仿法[15]提取純化后的細(xì)菌DNA并檢測濃度。PCR擴(kuò)增采用細(xì)菌通用引物27F、1492R（由生物公司合成）。PCR反應(yīng)體系見表3。

表3 50 μL的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)程序：94 ℃，預(yù)變性5 min；94 ℃，變性0.5 min；55 ℃，退火0.5 min；72 ℃，復(fù)性1.5 min；72 ℃延伸10 min；重復(fù)以上步驟35次。

進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳及成像分析。將擴(kuò)增后的DNA送往生物公司測序，將結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行對比，確定優(yōu)勢菌屬。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理與分析

每組設(shè)置3個(gè)平行，使用SPSS 23.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，使用Origin 9.8和Adobe Illustrator 2022軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 感官評價(jià)

圖1為各組在保鮮過程中的感官評分變化。隨保鮮時(shí)間延長，各組感官評分均降低（圖1）。具體表現(xiàn)為魚肉變黃，失去光澤，產(chǎn)生腥臭味，肌肉松散，肌纖維模糊，這是由于腐敗菌及酶分解了魚肉中的營養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致肌肉組織破壞。0～14 d期間，復(fù)合組的評分均優(yōu)于其他三組，這說明復(fù)合膜處理能更好地改善魚片的感官評價(jià)，這一結(jié)果與董汝月等[4]明膠-殼聚糖復(fù)合膜的結(jié)論相符。普魯蘭多糖和明膠間具有較強(qiáng)的分子作用力和優(yōu)良的相容性，使復(fù)合膜具有較高致密性和拉伸強(qiáng)度，從而使復(fù)合膜的氧氣透過率低于二者的單膜，且多糖可抑制活性氧自由基的生成，終止自由基鏈的發(fā)生[16]，從而抑制營養(yǎng)物質(zhì)的氧化，使魚片的感官評價(jià)維持在較高水平。

圖1 大菱鲆魚片保鮮過程中感官評分的變化

2.2 pH

魚片初始pH為7.1～7.3，隨時(shí)間的延長，各組均呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢（圖2）。0～4 d期間，處理組pH均低于空白組，這可能是由于涂膜液的包覆制造了無氧環(huán)境，促進(jìn)了厭氧菌的無氧呼吸，較空白組產(chǎn)生了更多的酸性物質(zhì)。6～14 d期間，多糖組、明膠組及復(fù)合組的pH變化均較空白組緩慢，這與Jiang[17]的研究結(jié)果一致，這表明涂膜處理可有效降低氧氣與魚肉的接觸，從而降低魚肉中的微生物數(shù)量，延緩蛋白質(zhì)的分解[18]，且多糖可與魚體內(nèi)某些酶的活性中心外的氨基酸殘基結(jié)合，從而抑制酶的活性[16]。

圖2 大菱鲆魚片保鮮過程中pH值的變化

2.3 持水力變化

隨保鮮時(shí)間的延長，各組持水力均呈下降趨勢（圖3）。保鮮8 d后，空白組、多糖組、明膠組及復(fù)合組的持水力分別下降了11.30%，9.60%，6.97%和4.37%。8 d時(shí)，多糖組持水力顯著低于明膠組及復(fù)合組（P＜0.05），這可能是由于多糖內(nèi)部的分子作用力使多糖單膜具有一定的孔隙，隔絕氧氣和水的能力較差[16]，魚肉內(nèi)微生物活性較強(qiáng)，肌原纖維蛋白降解較快，產(chǎn)生大量堿性物質(zhì)，在使魚肉pH上升的同時(shí)降低了魚肉的持水力。8 d時(shí)，復(fù)合組持水力顯著高于其他組別（P＜0.05），說明復(fù)合膜在魚片表面形成了更為致密的保護(hù)層，延緩了魚片表面微生物對魚肉蛋白質(zhì)的降解[19]，且多糖能夠抑制蛋白酶的活性，從而保持肌球蛋白的結(jié)構(gòu)，使持水力維持在較高水平。

圖3 大菱鲆魚片保鮮過程中持水力的變化

2.4 TVB-N含量變化

圖4為貯藏期間各組TVB-N含量的變化，以30 mg/100 g作為限值。初始時(shí)各組TVB-N含量均為2 mg/100 g左右。0～4 d期間，各組TVB-N含量增長緩慢，4 d后空白組增長迅速，在第6天時(shí)達(dá)到28.2 mg/100 g，在第8天超過限值，且顯著高于其他三組（P＜0.05）。復(fù)合組在第12天超過限值，此時(shí)多糖組和明膠組TVB-N含量分別為29.4和28.0 mg/100 g，接近限值，與復(fù)合組差異不顯著（P＞0.05）。覆膜處理可抑制TVB-N的產(chǎn)生，延緩菌落總數(shù)的增加，這是由于兩種保鮮劑均具有較為優(yōu)良的阻氧性，可抑制酶和細(xì)菌的生物活性[20-21]，同時(shí)多糖具有一定的抑菌性[22]，能夠破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜并分解細(xì)菌成分，使菌落總數(shù)下降，減弱細(xì)菌分解魚體肌肉的能力[23]，延緩蛋白質(zhì)的降解，抑制TVB-N的增加。

圖4 大菱鲆保鮮過程中TVB-N含量的變化

2.5 TBA值變化

TBA值可以指示水產(chǎn)品的脂肪酸敗程度[24]。一般認(rèn)為TBA值達(dá)到2 mg/kg時(shí)，魚體脂肪氧化嚴(yán)重，已不適合食用[25]。圖5為貯藏期間各組TBA值的變化。各組初始值均在0.6～1.0 mg/kg，隨貯藏時(shí)間的延長，各組TBA值均上升。其中：空白組TBA值增加最快，于第2天超過2 mg/kg，顯著高于其他處理組（P＜0.05）；多糖組于第4天超過2 mg/kg，顯著高于復(fù)合組（P＜0.05）；明膠組和復(fù)合組于第6天接近2 mg/kg，于第7～第8天超標(biāo)。試驗(yàn)結(jié)果表明，涂膜處理可抑制TBA的增加，這是由于多糖和明膠均具有良好的成膜性[14-26]，可阻止氧氣與魚肉的接觸，減緩魚體的褐變，抑制TBA值增加，使魚肉保持較為良好的色澤。復(fù)合組TBA值低于其他三組，說明復(fù)合膜阻氧性更強(qiáng)[27-28]，且能夠延緩魚肉中活性氧自由基和丙二醛的產(chǎn)生，從而提高魚肉的抗氧化性[29]。試驗(yàn)中明膠組保鮮效果優(yōu)于多糖組，這與楚銀鳳等[30]的試驗(yàn)結(jié)果一致，這是由于明膠中脯氨酸的氨基和羥脯氨酸的羥基可與其他氨基酸及水分子形成氫鍵，利于維持其類三螺旋結(jié)構(gòu)，從而使明膠的阻氧性能優(yōu)于普魯蘭多糖。

圖5 大菱鲆保鮮過程中TBA含量的變化

2.6 菌落總數(shù)變化

菌落總數(shù)可反映肉制品受污染的程度，是評價(jià)保鮮效果的重要指標(biāo)。各組菌落總數(shù)變化如圖6所示，以6 lg CFU/g為限值。隨保鮮時(shí)間的延長，各組別菌落總數(shù)均呈增長趨勢。其中，空白組在第4天已明顯超過限值，且顯著高于其他三組（P＜0.05），明膠組與多糖組菌落總數(shù)在第4天已接近限值，復(fù)合組于第6天已接近限值。相比于單膜處理，復(fù)合膜處理可有效抑制菌落的生長，這可能歸因于多糖可破壞致病菌的分子結(jié)構(gòu)，阻礙細(xì)菌的能量代謝，從而起到殺菌的作用[31]，且明膠可抑制褐變，防止食品吸潮并阻止微生物的侵入[32]。

圖6 大菱鲆保鮮過程中菌落總數(shù)的變化

2.7 優(yōu)勢腐敗菌的鑒定

以純化后的優(yōu)勢菌DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增后的基因片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，所得圖譜如圖7所示。電泳獲得的四條條帶大小均在1 500～1 700 bp之間，說明優(yōu)勢菌基因組總DNA片段大小合適，DNA降解較少，完整性較好。

圖7 菌株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

表5 多糖組腐敗菌16S rDNA鑒定結(jié)果

表6 明膠組腐敗菌16S rDNA鑒定結(jié)果

各組腐敗菌16S rDNA鑒定結(jié)果如表4～表7所示?？瞻捉M優(yōu)勢菌屬為芽孢桿菌（Bacillus），多糖組及明膠組優(yōu)勢菌屬均為嗜冷桿菌（Psychrobacter），復(fù)合組優(yōu)勢菌屬為希瓦氏菌屬（Shewanella），以上結(jié)果置信度均達(dá)到98.80%以上。地衣芽孢桿菌為革蘭氏陽性菌，為一種普遍存在的兼性好氧菌，能以內(nèi)孢子的形式存在于水生動(dòng)物的腸道內(nèi)[33]；嗜冷桿菌屬于好氧菌，可在-10～42 ℃的范圍內(nèi)生長，在多種水產(chǎn)品中均有檢出[34]，程三紅等[35]發(fā)現(xiàn)鮐魚體表的特定腐敗菌是嗜冷桿菌屬；希瓦氏菌屬革蘭氏陰性菌，是水產(chǎn)品主要的優(yōu)勢腐敗菌，可在缺氧條件下快速繁殖，并將三甲胺-N-氧化物還原為三甲胺，水解蛋白質(zhì)和脂肪，產(chǎn)生魚腥味。

表4 空白組腐敗菌16S rDNA鑒定結(jié)果

表7 復(fù)合組腐敗菌16S rDNA鑒定結(jié)果

藍(lán)蔚青等[36]發(fā)現(xiàn)帶魚經(jīng)10 g/L殼聚糖保鮮液涂膜處理后在低溫下貯藏，菌相逐漸單一，嗜冷桿菌的生長受到抑制，這與試驗(yàn)結(jié)果不同，可能是由于試驗(yàn)中多糖組的濃度偏低導(dǎo)致的抑菌效果不明顯。預(yù)試驗(yàn)表明，普魯蘭多糖溶液濃度過高會(huì)影響魚片感官，且溶解速度較慢，因此選擇0.1%的多糖濃度。相比于單膜處理，混合后的多糖和明膠形成了均一的體系，明膠與多糖分子間的相互作用破壞了二者的自聚力，因而具有較好的相容性[37]，提高復(fù)合膜的機(jī)械性能。此外復(fù)合膜內(nèi)部分子間有較強(qiáng)的氫鍵和分子間作用力，使氧氣不易通過，可有效抑制芽孢桿菌及嗜冷桿菌等需氧菌的生長[38]。劉劍俠[39]發(fā)現(xiàn)在多糖中加入茶多酚可以有效抑制希瓦氏菌的腐敗，多糖和茶多酚的協(xié)同作用使復(fù)合膜的抑菌效果更加優(yōu)良，這也為我們今后的試驗(yàn)設(shè)計(jì)提供思路。

3 結(jié)論

研究以普魯蘭多糖和食用明膠為原料，在4 ℃下探究普魯蘭多糖-明膠復(fù)合膜對大菱鲆魚片品質(zhì)的影響。結(jié)果表明：復(fù)合膜具有良好的阻氧性，在維持魚肉的感官評價(jià)、保持魚體肌肉結(jié)構(gòu)、降低脂肪的氧化速率、抑制微生物生長等方面具有協(xié)同增效作用，能夠使大菱鲆魚片的冷藏貨架期由3～4 d延長至6～7 d，有著廣闊的應(yīng)用前景。