高凱霞 吳福玲 石 濤 高 萌 張雪靜 秦英飛 鄺哲姝

濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒科(濱州 256600)

毛細(xì)支氣管炎多由呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)感染引起，常見于2～6月嬰幼兒，臨床特點(diǎn)主要表現(xiàn)為喘息、三凹征、氣促[1]。目前的治療方案以抗感染、控制喘息等對癥支持治療為主，尚無特異性治療方法。RSV毛細(xì)支氣管炎涉及到由多種細(xì)胞和細(xì)胞因子參與的固有免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答[2]。其中Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)，特別是TLR3、TLR4、TLR7等受體及其銜接蛋白與RSV感染關(guān)系密切[3]。而NF-κB是一種核轉(zhuǎn)錄因子，具有多種生物學(xué)活性，NF-κB途徑可調(diào)節(jié)與喘息相關(guān)的呼吸道炎癥基因，抑制NF-κB活性可減輕氣道炎癥反應(yīng)，從而改善氣道重塑[4]。已有相關(guān)研究表明，機(jī)體感染 RSV 后可激活TLR3通路，進(jìn)而激活NF-κB，通過信號傳導(dǎo)，引起下游炎性細(xì)胞因子的過度表達(dá)，加重氣道炎癥反應(yīng)[5]。白藜蘆醇(resveratrol，Res)是一種非黃酮類多酚有機(jī)化合物，廣泛存在于葡萄、虎杖等70多種植物中，口服容易吸收，可隨尿液、糞便代謝排出，其具有抗炎、抗過敏、抗氧化、抗腫瘤等多種生物學(xué)作用[6]。近年來，白藜蘆醇的有益作用已在哮喘、肺纖維化、肺動(dòng)脈高壓和其他肺部疾病中被證明[7-8]。而TLR4與毛細(xì)支氣管炎相關(guān)的具體機(jī)制仍不完全清楚。本文通過建立毛細(xì)支氣管炎小鼠模型并予白藜蘆醇干預(yù)，來探討白藜蘆醇對毛細(xì)支氣管炎小鼠肺組織TLR4/NF-κB通路的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 試劑 白藜蘆醇、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自Solarbio；兔抗鼠多克隆抗體GAPDH、TLR4及NF-κB購自武漢三鷹公司；胎牛血清購自四季青公司；小鼠白介素- 6(interleukin，IL- 6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)試劑盒為上海朗頓公司產(chǎn)品。

1.1.2 制備RSV病毒 RSV A2株由山東省病毒研究所饋，將液氮凍存人宮頸癌 (Hela) 細(xì)胞復(fù)蘇后，用含 10%培養(yǎng)液常規(guī)傳代培養(yǎng)。將病毒懸液接種于Hela細(xì)胞，在37 ℃、2%FBS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，至80%細(xì)胞發(fā)生病變時(shí)反復(fù)凍融，1 000 r、5 min 收集RSV病毒懸液，空斑實(shí)驗(yàn)檢測病毒滴度。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取30只6～8周齡18～22 g B/C雄性小鼠，購自朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，許可證號：SCXK(魯) 2019-0003，由濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院動(dòng)物房分籠飼養(yǎng)適應(yīng)1周。

1.2 方法

1.2.1 分組造模 將30只小鼠隨機(jī)分為對照組、RSV組及給藥組(白藜蘆醇25 mg/kg)[9]，每組小鼠10只。RSV組和給藥組均予RSV病毒懸液滴鼻100 μL/天，連續(xù)2天[10]，對照組予100 μL 磷酸鹽緩沖液(PBS)滴鼻2天對照；給藥組滴鼻2小時(shí)后予白藜蘆醇25 mg/kg、0.2 mL腹腔注射，連續(xù)3天。對照組和RSV組滴鼻2小時(shí)后予0.2 mL PBS腹腔注射，連續(xù)3天。造模過程中無小鼠死亡。

1.2.2 收集肺泡灌洗液 (bronchoalveolar lavage fluid，BALF) 造模結(jié)束后第2天進(jìn)行取材，5%水合氯醛(劑量0.1 mL/10 g)麻醉小鼠，充分暴露氣管，用1 mL 灌洗液灌洗氣管，重復(fù)抽吸3次，確?；厥樟看笥?.8 mL，低溫高速離心取上清液，-20 ℃ 冰箱保存。

1.2.3 肺組織病理觀察 采取頸部脫臼法處死小鼠，剝離小鼠肺組織，取右肺中葉用10%多聚甲醛灌注固定48小時(shí)，用升序蔗糖脫水，包埋劑包埋，冰凍切片機(jī)切片，厚度約5 μm，切片后固定，固定時(shí)間為30 s～1 min，清水稍沖洗1～2 s。蘇木素染色，時(shí)間大概為3～5 min；然后清水洗去蘇木素，大概5～10 s。促藍(lán)液返藍(lán)5～10 s；清水稍沖洗1～2 s。伊紅染色10～20 s，然后脫水、透明、中性樹膠封固。400倍光鏡下觀察。

1.2.4 ELISA法測定 BALF中IL- 6、TNF-α的水平 按照試劑盒說明書步驟檢測BALF中IL- 6、TNF-α的含量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各組炎性因子水平變化。

1.2.5 Western blot 檢測各組小鼠肺組織中TLR4、NF-κB蛋白水平 用勻漿器提取肺組織蛋白，BCA法測蛋白濃度，根據(jù)蛋白分子量大小值配膠，上樣量為50 g進(jìn)行電泳，將蛋白轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂奶粉封閉2小時(shí)，一抗(兔抗鼠多克隆抗體TLR4 1:1 000、兔抗鼠多克隆抗體NF-κB 1:1 000、兔抗鼠多克隆抗體GAPDH 1:5 000) 4 ℃冰箱孵育過夜，TBST 洗膜3次，10分鐘/次，搖床孵育二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔 IgG 1:5 000)2小時(shí)，TBST 洗膜3次，10分鐘/次，于暗室曝光。分析軟件分析條帶吸光度值(A值) 。結(jié)果用A TLR4/A GAPDH、A NF-κB /A GAPDH表示。

1.2.6 逆轉(zhuǎn)錄-定量PCR(RT-qPCR)檢測TLR4 mRNA、NF-κB mRNA表達(dá) 將肺組織(100 mg)加入1mL Trizol研磨勻漿，提取總RNA?？俁NA根據(jù)PrimeScript RT試劑盒的說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。使用SYBR?-Green Master Mix(Takara Bio，Inc.)進(jìn)行qPCR。根據(jù)制造商的方案；在推薦的參數(shù)下進(jìn)行擴(kuò)增：在94 ℃的初始變性3 min，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，94 ℃ 20 s，55 ℃ 15 s和72 ℃ 25 s，最后在94 ℃延伸20 s。用2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因的表達(dá)水平。

基因名稱序列大小引物序列(5'→3')TLR4 310 F:GGTGAGAAATGAGCTGGTAR:TCTGCTAAGAAGGCGATANF-κB425F:GCGCATCCAGACCAACAATAACR:GCCGAAGCTGTGGACACTGAPDH526F:CCACTTGAAGGGTGGAGCR: TGAAGTCGCAGGAGACAA

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié) 果

2.1 小鼠BALF中IL- 6、TNF-α的水平

RSV組炎性因子水平升高，給藥組可降低毛細(xì)支氣管炎小鼠BALF中炎癥因子水平。ELISA結(jié)果顯示，對照組小鼠BALF中IL- 6的表達(dá)量為(12.26±6.25)pg/mL；RSV組小鼠BALF中IL- 6的表達(dá)量為(95.63±8.32)pg/mL，高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；給藥組小鼠BALF中IL- 6的表達(dá)量為(54.32±10.42)pg/mL，較RSV組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。對照組小鼠B中TNF-α的表達(dá)量為(27.58±6.37)pg/mL；RSV組小鼠BALF中TNF-α的表達(dá)量為(57.23±16.45)pg/mL，高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；給藥組小鼠BALF中TNF-α的表達(dá)量為(42.36±17.43)pg/mL，較RSV組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，如圖2。

圖1 ELISA法測小鼠BALF中IL- 6表達(dá)量

圖2 ELISA法測小鼠BALF中TNF-α表達(dá)量

2.2 小鼠肺組織病理學(xué)表現(xiàn)

白藜蘆醇治療可減輕毛細(xì)支氣管炎小鼠模型的病理損害。對照組肺組織肺泡結(jié)構(gòu)無明顯變化，支氣管周圍炎癥細(xì)胞浸潤不明顯，黏膜結(jié)構(gòu)、肺泡組織無明顯變化(圖3A)。與對照組相比，RSV組肺組織病理改變明顯，表現(xiàn)為支氣管黏膜增厚，氣道狹窄，多發(fā)炎性細(xì)胞浸潤，氣管平滑肌增厚，還觀察到明顯的毛細(xì)血管充血、肺泡融合擴(kuò)大和肺泡間隔增寬(圖3B)。與RSV組比較，給藥組肺組織病理改變較輕，支氣管黏膜增厚較輕，炎癥細(xì)胞浸潤較少(圖3C)。

圖3 小鼠肺組織病理改變(HE染色，×400)

2.3 肺組織中TLR4、NF-κB蛋白的表達(dá)水平

RSV組較對照組小鼠肺組織中TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，給藥組TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)較RSV組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4、圖5。

圖4 Western blot 檢測肺組織 TLR4蛋白變化

圖5 Western blot 檢測肺組織NF-κB蛋白變化

2.4 肺組織中TLR4 mRNA、NF-κB mRNA的表達(dá)水平

實(shí)驗(yàn)設(shè)定對照組TLR4 mRNA表達(dá)量為1.00；RSV組TLR4 mRNA相對表達(dá)量為(3.732±0.75)，較對照組小鼠表達(dá)升高(P<0.05)；白藜蘆醇給藥組TLR4 mRNA相對表達(dá)量為(1.494±0.34)，較RSV組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖6。

圖6 RT-PCR檢測各組小鼠肺組織中TLR4 mRNA的表達(dá)

實(shí)驗(yàn)設(shè)定對照組NF-κB mRNA表達(dá)量為1.00；RSV組NF-κB mRNA相對表達(dá)量為(6.634±0.97)，較對照組小鼠表達(dá)升高(P<0.05)；給藥組NF-κB mRNA相對表達(dá)量為(4.128±0.52)，較RSV組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖7。

圖7 RT-PCR檢測各組小鼠肺組織中NF-κB mRNA的表達(dá)

3 討 論

毛細(xì)支氣管炎多由RSV病毒感染引起[11]。它起病急、病情發(fā)展快，嚴(yán)重者可出現(xiàn)煩躁不安、紫紺甚至呼吸衰竭等表現(xiàn)，危害幼兒健康[12]。研究表明，炎癥反應(yīng)不僅促進(jìn)該病的發(fā)生發(fā)展，還能降低兒童免疫反應(yīng)，增加其他并發(fā)癥[13]。因此，毛細(xì)支氣管炎的治療不僅需要減輕炎癥反應(yīng)，還需減少氣道腺體分泌和增強(qiáng)機(jī)體免疫能力。

TLRs屬于進(jìn)化保守的模式識別蛋白，啟動(dòng)和調(diào)節(jié)先天免疫反應(yīng)，到目前為止已被證明具有功能的10個(gè)人類TLR中的每一個(gè)都能識別不同的分子模式[14]。TLRS在RSV感染過程中發(fā)揮著重要的作用，是研究RSV感染的新的方向。機(jī)體感染RSV后激活TLRs通路，進(jìn)而激活NF-κB，從而導(dǎo)致前炎性細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β、IL- 6、IL-8等)過度表達(dá)[15]，這些生物活性介質(zhì)，使氣道呈現(xiàn)高反應(yīng)，加重氣道局部炎癥，威脅患兒身體健康。實(shí)驗(yàn)證明，用脂多糖感染小鼠導(dǎo)致肺炎后，可激活TLR4信號，導(dǎo)致活化NF-κB表達(dá)和促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL- 6的產(chǎn)生[16]。實(shí)驗(yàn)研究表明，RSV感染機(jī)體后可促使肺泡巨噬細(xì)胞分泌大量TNF-α，且分泌量與感染嚴(yán)重程度有關(guān)[17]。本實(shí)驗(yàn)中檢測RSV毛細(xì)支氣管炎小鼠BALF中IL- 6、TNF-α水平高于空白對照組，肺組織中TLR4、NF-κB蛋白水平及mRNA水平高于空白組，提示RSV感染小鼠后可能是激活TLR4/NF-κB信號通路激發(fā)炎癥反應(yīng)，并與以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)相統(tǒng)一。

我們現(xiàn)在知道TLR4能夠感知各種微生物結(jié)構(gòu)，包括RSV的融合F蛋白[18]。TLRs家族中的TLR4可與抗原結(jié)合迅速，并通過激活相關(guān)激酶向下游傳遞信號發(fā)揮其功能，是激活炎癥通路和合成、分泌高水平炎癥介質(zhì)的啟動(dòng)因素[19]。何月賢等[20]通過收集121例毛細(xì)支氣管炎患兒，均由RSV感染導(dǎo)致，研究發(fā)現(xiàn)觀察組血清TLR4、TGF-β1水平高于對照組，且升高的程度影響病情的嚴(yán)重程度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示血清中TLR4、轉(zhuǎn)化生長因子-β1表達(dá)上調(diào)通過介導(dǎo)免疫應(yīng)答反應(yīng)和炎癥反應(yīng)而參與發(fā)病過程，并影響疾病嚴(yán)重程度。我們實(shí)驗(yàn)中通過構(gòu)建毛細(xì)支氣管炎小鼠模型，檢測小鼠肺組織中TLR4蛋白、TLR4 mRNA較空白對照組明顯升高，與上述何月賢檢測患兒血清研究結(jié)果一致，這表明了TLR4參與了毛細(xì)支氣管炎的發(fā)病和發(fā)展過程。

白藜蘆醇是一種多酚化合物，存在于多種藥用植物中。隨著研究進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇生物活性較多，尤其在免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗炎等方面作用顯著[21]。白藜蘆醇可以通過干擾免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)、促炎細(xì)胞因子的合成和基因表達(dá)來調(diào)節(jié)免疫[22]。白藜蘆醇最顯著的作用是減輕炎癥，主要是通過調(diào)節(jié)NF-κB途徑實(shí)現(xiàn)[23]。李明等[24]通過RSV滴鼻感染小鼠建立肺炎模型，研究低、中、高劑量白藜蘆醇給藥組肺組織炎癥因子水平，說明白藜蘆醇可以改善RSV引起的肺部炎癥反應(yīng)，并具有劑量依賴性。故本實(shí)驗(yàn)中給藥組選取最佳給藥劑量25 mg/kg給藥，檢測各組小鼠BALF中TNF-α、IL- 6因子的水平，得出白藜蘆醇可以減輕毛細(xì)支氣管炎小鼠肺內(nèi)炎癥，這與以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

本研究中，給藥組小鼠喘息癥狀及肺泡灌洗液中IL- 6 、TNF-α水平較RSV組明顯下降。說明白藜蘆醇可以抑制毛細(xì)支氣管炎小鼠肺內(nèi)的炎癥反應(yīng)，減少炎癥因子的釋放，進(jìn)而改善預(yù)后。同時(shí)實(shí)驗(yàn)得出，給藥組小鼠肺組織中TLR4、NF-κB 的蛋白表達(dá)水平及 TLR4 mRNA、NF-κB mRNA的表達(dá)水平均比RSV組低，進(jìn)一步明確了白藜蘆醇對毛細(xì)支氣管炎小鼠抑制的保護(hù)機(jī)制可能是通過抑制 TLR4介導(dǎo)的炎癥通路實(shí)現(xiàn)的。

綜上，白藜蘆醇能明顯改善毛細(xì)支氣管炎小鼠的癥狀，減輕肺內(nèi)炎癥反應(yīng)，降低炎癥因子含量和肺組織中TLR4、NF-κB的表達(dá)，從而發(fā)揮對毛細(xì)支氣管炎小鼠的保護(hù)作用，證實(shí)該保護(hù)作用可能是通過抑制TLR4/NF-κB通路介導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的。