吳蕓 歐正淼 毆小嫚 陳粉粉 閆吉美 李盼盼

摘要：為研究赤水烏骨雞PTGDS基因的結(jié)構(gòu)和功能，檢測(cè)其在赤水烏骨雞不同組織、胸肌和腿肌中的表達(dá)情況，探究PTGDS基因?qū)Τ嗨疄豕请u肉質(zhì)性能的影響。運(yùn)用RT-PCR獲得PTGDS基因CDS序列，對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，揭示其結(jié)構(gòu)特征和親緣關(guān)系，同時(shí)通過(guò)qPCR檢測(cè)赤水烏骨雞PTGDS基因在同一時(shí)期不同組織中的表達(dá)特性。結(jié)果顯示，赤水烏骨雞PTGDS基因編碼區(qū)長(zhǎng)558 bp，編碼186個(gè)氨基酸，保守性分析發(fā)現(xiàn)赤水烏骨雞PTGDS基因與原雞的同源性最高，核酸和氨基酸序列比對(duì)同源性分別為100%；系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，赤水烏骨雞與原雞的親緣關(guān)系最近，與黑天鵝和鴻雁的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。PTGDS基因在各組織中均有表達(dá)，在腎中的表達(dá)量最高，顯著高于其他組織（P<0.05）；肌肉中腿肌的表達(dá)量高于胸肌，但差異不顯著（P>0.05）。研究結(jié)果可為進(jìn)一步揭示PTGDS基因的功能和調(diào)控機(jī)制提供參考。

關(guān)鍵詞：赤水烏骨雞；PTGDS基因；生物信息學(xué)分析；組織mRNA表達(dá)

中圖分類號(hào)：S831.2? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2023）23-0022-06

前列腺素D合成酶（prostaglandin D synthase，PTGDS）是一種最早發(fā)現(xiàn)在人的腦脊液中大量表達(dá)的低分子量糖蛋白［1］，后來(lái)又相繼在大腦、肝臟、心臟、骨骼肌、肺、胰腺和脂肪等多種組織中檢測(cè)到PTGDS的存在。PTGDS是脂質(zhì)運(yùn)載蛋白超家族成員之一，是該家族中唯一具有酶功能的成員，具有前列腺素代謝和脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)雙重功能，既可以合成前列腺素，又可以作為親脂性小分子的載體參與諸如視黃醇、視黃酸、膽紅素、膽綠素和類維生素A等一些小親脂性分子的運(yùn)輸，還可以作為一種高度糖基化的蛋白質(zhì)參與花生四稀酸的代謝，PTGDS在脂質(zhì)代謝中起調(diào)節(jié)作用［2-4］。

赤水烏骨雞是貴州優(yōu)良的地方雞品種，屬于肉蛋兼用型雞，羽毛、皮膚和肌肉均呈現(xiàn)黑色，具有耐粗飼、肉質(zhì)好、適應(yīng)性強(qiáng)等特性，是優(yōu)良的育種素材。目前，對(duì)赤水烏骨雞肉質(zhì)和風(fēng)味方面的研究較少。本試驗(yàn)以赤水烏骨雞為研究對(duì)象，通過(guò)RT-qPCR方法克隆得到PTGDS基因序列，進(jìn)行生物信息學(xué)分析，同時(shí)采用qPCR檢測(cè)了PTGDS基因在不同組織和肌肉中的表達(dá)差異，為進(jìn)一步探究PTGDS基因?qū)Τ嗨疄豕请u肉質(zhì)風(fēng)味相關(guān)的調(diào)控機(jī)制和雞機(jī)體上的生物學(xué)功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品采集及總RNA提取

試驗(yàn)選用的同批次孵化、體質(zhì)量相近的35日齡赤水烏骨雞，由貴州竹香雞養(yǎng)殖合作社提供。所有試驗(yàn)用雞均在相同飼養(yǎng)管理和營(yíng)養(yǎng)水平條件下飼養(yǎng)。隨機(jī)選取10羽公雞，屠宰后采集各羽公雞的心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、腿肌和胸肌7個(gè)組織樣品，將采集的組織樣品迅速置于組織RNA保存液中 4 ℃ 過(guò)夜，隨后置于-80 ℃超低溫冰箱中保存待用。采用TRIzol法提取各組織總RNA，超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定提取RNA的濃度和純度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。使用PrimeScriptTM RT試劑盒對(duì)檢測(cè)合格的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第1鏈。

1.2 主要儀器和試劑

全自動(dòng)快速研磨儀（JXFSTPRP-64，上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司），高速冷凍離心機(jī)（TGL-16G，上海安亭科學(xué)儀器廠），多功能成像系統(tǒng)［ChemiDOC MP，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司］，熒光定量PCR儀［CFXconnect，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司］，微量核酸蛋白檢測(cè)儀（UVS-99，艾文思生物技術(shù)公司）；RNAiso Plus、TB Green Premix Ex TaqTM Ⅱ和PrimeScriptTM RT試劑盒，均購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒、膠回收試劑盒，購(gòu)自O(shè)mega Bio-Tek公司；DH5α感受態(tài)細(xì)胞、T 載體 PCR 產(chǎn)物克隆試劑盒，購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；RNAwait購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 赤水烏骨雞PTGDS基因克隆

參照GenBank原雞PTGDS基因序列（NM_204259.2），采用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增赤水烏骨雞 PTGDS基因CDS序列的特異性引物（表1），引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。以赤水烏骨雞胸肌組織的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為：cDNA 3 μL，上、下游引物各2 μL，2×TransStar FastPfu PCR Super Mix 20 μL，ddH2O 13 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，10 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將檢測(cè)正確的條帶切膠回收產(chǎn)物連接到T載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，挑陽(yáng)性克隆提質(zhì)粒送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.4 生物信息學(xué)分析

通過(guò)使用DNAMAN 9.0軟件對(duì)測(cè)序得到的赤水烏骨雞PTGDS基因CDS區(qū)序列與原雞序列進(jìn)行序列比對(duì)，采用NCBI的 BLAST在線軟件對(duì)其進(jìn)行同源性搜索，將搜索得到的原雞、日本鵪鶉、雉雞、盔珠雞、艾草松雞等的PTGDS基因用MegAlign軟件進(jìn)行同源和變異分析。采用MEGA 11.0軟件構(gòu)建PTGDS基因的遺傳進(jìn)化樹。采用STRING在線軟件（https：//string-db.org/）預(yù)測(cè)可能與PTGDS蛋白發(fā)生相互作用的蛋白。采用ProtParam 在線軟件（http：//web. expasy. org/protparam/）分析PTGDS蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)。采用ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/）在線軟件計(jì)算PTGDS蛋白的疏水性。TMHMM在線軟件（http：//www. cbs. dtu. dk/services/TMHMM/）預(yù)測(cè)PTGDS蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域。采用Signal P 5.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP-5.0）預(yù)測(cè)PTGDS蛋白的信號(hào)肽。用Phyre2（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id=index）和SWISS-MODEL在線軟件（https：//www.expasy.org/resources/swiss-model）分別預(yù)測(cè)分析PTGDS蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。運(yùn)用Net-Phos 3.1（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php）預(yù)測(cè)PTGDS蛋白的磷酸化位點(diǎn)。用在線軟件PSORT（https：//www.genscript.com/tools/psort）進(jìn)行蛋白的亞細(xì)胞定位。

1.5 赤水烏骨雞PTGDS基因在不同組織的表達(dá)分析

以赤水烏骨雞的心臟、肝臟、脾臟、肺、腎、腿肌和胸肌7種組織的cDNA為模板，GAPDH為內(nèi)參，進(jìn)行RT qPCR檢測(cè)目的基因表達(dá)量，并分析 PTGDS基因在各組織的表達(dá)量。RT-qPCR反應(yīng)體系：TB Green Premix Ex TaqTM Ⅱ（2×）12.5 μL，模板 2.0 μL，上下游引物各1.0 μL，ddH2O 8.5 μL。RT-qPCR 的擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s并采集熒光信號(hào)，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品3次重復(fù)，擴(kuò)增反應(yīng)完成后分析熔解曲線。

1.6 生物統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用Excel對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，采用2-ΔΔCT 法計(jì)算 PTGDS基因相對(duì)內(nèi)參基因GAPDH的表達(dá)差異量，ΔCT=CT PTGDS-CtGAPDH，ΔΔCT=Δ組織-ΔCT心臟。采用SPSS 26.0軟件對(duì)計(jì)算數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析及顯著性檢驗(yàn)。用GraphPad Prism 6.0繪制圖表。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 PTGDS基因CDS特征及序列比對(duì)

以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增PTGDS基因，用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果見圖1。由圖1可知，擴(kuò)增產(chǎn)物條帶單一，與目的片段618 bp大小一致。膠回收產(chǎn)物克隆轉(zhuǎn)化，菌液PCR檢測(cè)得到的片段大小與預(yù)期相符，結(jié)果見圖2。

2.2 PTGDS基因的生物信息學(xué)分析

測(cè)序獲得的赤水烏骨雞的PTGDS基因的編碼區(qū)長(zhǎng)558 bp，編碼185個(gè)氨基酸。測(cè)序序列與原雞序列比對(duì)顯示，CDS的第105位發(fā)生A>G突變，不過(guò)編碼的氨基酸未發(fā)生改變。測(cè)序結(jié)果與NCBI發(fā)表的基因序列的氨基酸同源性比對(duì)分析結(jié)果見圖3。由圖3可知，赤水烏骨雞的PTGDS基因與原雞氨基酸序列同源性是100%，與火的同源性為973%，與雞日本鵪鶉的同源性為96.8%，雉雞、艾草松雞和盔珠雞同源性均為96.2%，與巖雷鳥、白尾雷鳥和穴小鸮的同源性分別為95.7%、95.1%和876%，與黑天鵝和鴻雁的同源性為86.5%。用鄰接（neighbor joining，NJ）法構(gòu)建PTGDS蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹，由圖4可知，赤水烏骨雞與原雞聚為一類，與雉雞、火雞、艾草松雞、雷鳥同在一個(gè)分支。赤水烏骨雞與原雞的親緣關(guān)系最近，與黑天鵝和鴻雁的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

采用Protparam在線軟件對(duì)赤水烏骨雞PTGDS基因編碼區(qū)的氨基酸序列進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)蛋白分子式是C914H1 448N254O285S9，分子量為20 843.62 u，理論等電點(diǎn)為6.3，脂溶性指數(shù)為79.68，不穩(wěn)定指數(shù)為35.86，提示此蛋白為穩(wěn)定蛋白。用ExPASy的ProtScale在線軟件計(jì)算PTGDS的編碼氨基酸序列的疏水性，結(jié)果見圖5。由圖5可知，其計(jì)算結(jié)果推測(cè)該蛋白是親水性蛋白。運(yùn)用TMHMM-2.0對(duì)PTGDS蛋白的跨膜區(qū)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)果見圖6。結(jié)果（圖6）顯示，該蛋白不屬于跨膜蛋白，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)。使用在線軟件SignalP 5.0預(yù)測(cè)，結(jié)果見圖7，PTGDS蛋白潛在信號(hào)肽及切割位點(diǎn)，經(jīng)分析，其存在Sec/SPI類型信號(hào)肽的概率為99.738%，說(shuō)明PTGDS蛋白存在Sec信號(hào)肽，切割位點(diǎn)為19～20之間的LHA-QN，切割概率為 75.400%，其信號(hào)肽序列為MQATLLSILGLALLGALHA。

Phyre2在線軟件對(duì)赤水烏骨雞PTGDS蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，PTGDS蛋白中無(wú)規(guī)則卷曲、α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)分別占20%、12%和49%。采用在線軟件SWISS-MODEL的自動(dòng)建模功能預(yù)測(cè)赤水烏骨雞PTGDS蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，由圖8可知，用于建立三維模型的氨基酸殘基范圍為 24～181位，模型以4orw.1.A蛋白為模板，序列同源性為43.17%。

經(jīng)NetPhos 3.1 在線軟件預(yù)測(cè)PTGDS蛋白可能的磷酸化位點(diǎn)，結(jié)果見圖9。由圖9可知，PTGDS蛋白含有絲氨酸（ser）磷酸化位點(diǎn)16個(gè)，蘇氨酸（thr）磷酸化位點(diǎn)8個(gè)，酪氨酸（tyr）磷酸化位點(diǎn)7個(gè)，無(wú)N-糖基化位點(diǎn)。在線軟件PSORT亞細(xì)胞定位分析顯示，PTGDS蛋白主要定位于包括細(xì)胞壁的細(xì)胞外（77.8%），其他定位于細(xì)胞核（11.1%）和線粒體（11.1%）上。由圖10可知，根據(jù)STING在線軟件預(yù)測(cè)到PTGDS蛋白與APOD、PNAT3、TBXAS1、PTGES、AMH及HPGDS等共10個(gè)蛋白質(zhì)之間可能存在相互作用，推測(cè)這些蛋白可能會(huì)影響PTGDS的表達(dá)水平。

2.3 赤水烏骨雞PTGDS基因在不同組織中的表達(dá)

PTGDS基因在赤水烏骨雞不同組織中的表達(dá)情況，由圖11可知，PTGDS基因在各赤水烏骨雞的心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、腿肌及胸肌中均有表達(dá)。PTGDS在腎臟中的相對(duì)表達(dá)量最高，顯著高于其他各組織中的表達(dá)量（P<0.05），其次是肺，接下來(lái)分別是肝臟、心臟、脾臟和腿肌，胸肌中PTGDS的表達(dá)量最低。PTGDS在各組織中的表達(dá)量均達(dá)顯著差異（P<0.05），但在肝臟和肺中這2個(gè)組織中的表達(dá)量無(wú)顯著差異（P>0.05），胸肌和腿肌中兩者間PTGDS的表達(dá)量也無(wú)顯著差異（P>0.05）。

3 討論與結(jié)論

克隆得到的赤水烏骨雞PTGDS基因的CDS區(qū)序列經(jīng)生物信息學(xué)分析，得到PTGDS基因CDS區(qū)片段長(zhǎng)度為558 bp，編碼186個(gè)氨基酸，結(jié)果與Fujimori等從雞腦組織中提取的總RNA反轉(zhuǎn)后克隆得到的PTGDS基因部分序列［5］高度相似。與火雞的同源性為97.3%，與日本鵪鶉的同源性為968%，說(shuō)明該基因在鳥類中應(yīng)該是高度保守的，可能具有相似的生物學(xué)功能。穆松銀等對(duì)PTGDS基因在犏牛各組織和睪丸不同發(fā)育階段的表達(dá)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PTGDS基因在犏牛睪丸、胃、肝和肺中均有表達(dá)［6］，而PTGDS基因在鼠的胰腺、心臟、骨骼、肌肉、腎臟和肺中均有檢測(cè)到［7-12］，本試驗(yàn)在赤水烏骨雞的心臟、肝、脾、肺、腎和肌肉中PTGDS基因mRNA均有表達(dá)。推測(cè)可能是由于物種不同導(dǎo)致PTGDS基因在不同組織中的表達(dá)情況存在差異。李欣對(duì)肉雞脛骨軟骨發(fā)育不良模型中前列腺素合成相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行研究，提出前列腺素E2和或其他類型的前列腺素可能參與了生長(zhǎng)板細(xì)胞增殖、分化過(guò)程［13］。肌肉收縮是一個(gè)能量的消耗過(guò)程，骨骼肌中的代謝無(wú)疑需要大量的能量，除了由提供能量速度較慢的長(zhǎng)鏈脂肪酸的β氧化外，還有速度快速的葡萄糖氧化來(lái)供能［14］。有研究表明，采用L-PGDS處理對(duì)胰島素敏感的大鼠大腿骨骼肌細(xì)胞，可使葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)增加約2倍［15］。L-PGDS在機(jī)體內(nèi)調(diào)節(jié)葡萄糖利用中起重要作用［15］。本試驗(yàn)腿肌中的PTGDS基因表達(dá)量比胸肌中的高，可能在雞運(yùn)動(dòng)中腿肌需要大量的能量，PTGDS的多表達(dá)可能會(huì)增加葡萄糖的利用，為肌肉收縮提供更多的能量。Virtue等對(duì)PTGDS在棕色脂肪組織中的研究顯示，L-PGDS可以調(diào)控脂質(zhì)和碳水化合物利用之間的平衡［2］。

脂肪形成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，已經(jīng)證實(shí) C/EBPs、PPARγ、SREBP-1c等許多的轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)調(diào)節(jié)多種脂肪形成蛋白基因的表達(dá)參與調(diào)控［16-17］。前列腺素作為脂質(zhì)介質(zhì)參與脂肪生成的一些調(diào)節(jié)［18］。PGD2促進(jìn)脂肪及其代謝產(chǎn)物的生成，PGD2是由L-PGDS催化PGH2轉(zhuǎn)化的，PGD2再進(jìn)一步代謝得到Δ12-PGJ2，而Δ12-PGJ2是PPARγ的激動(dòng)劑［19-21］。脂肪細(xì)胞的基本功能之一是以甘油三酯形式合成和儲(chǔ)存游離脂肪酸，脂肪細(xì)胞中PPARγ可誘導(dǎo)分泌脂聯(lián)素，脂聯(lián)素通過(guò)增加胰島素敏感性和脂肪酸氧化來(lái)影響脂質(zhì)的攝取、脂肪組織的分化［21］。敲除L-PGDS導(dǎo)致脂聯(lián)素表達(dá)降低，AMPK磷酸化降低，導(dǎo)致脂肪生成增加，L-PGDS可能是脂肪細(xì)胞中脂聯(lián)素分泌的上游調(diào)節(jié)因子［8］。同時(shí)，將PPARγ2和L-PGDS等2個(gè)基因都敲除小鼠（DKO小鼠）皮下及腹腔內(nèi)白色脂肪組織產(chǎn)熱基因、脂酶和蛋白標(biāo)記物等的研究發(fā)現(xiàn)，皮下白色脂肪功能的維持需要L-PGDS，DKO小鼠可能更加依賴腹腔內(nèi)白色脂肪組織供應(yīng)脂肪進(jìn)行氧化［2］，提示L-PGDS和PPARγ2可能協(xié)同調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝。因此，結(jié)合PTGDS基因在赤水烏骨雞腿肌、胸肌上的表達(dá)，推測(cè)PTGDS基因可能參與雞肌肉和脂肪的發(fā)育及能量代謝。

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