楊易梅，周世萍*，李惠娟，李奇生，武自強，楊廣斌，朱鑫澤

1.西南林業(yè)大學，西南地區(qū)林業(yè)生物質(zhì)資源高效利用國家林業(yè)和草原局重點實驗室，云南 昆明 650224

2.西南林業(yè)大學，云南省森林災(zāi)害預警與控制重點實驗室，云南 昆明 650224

毒死蜱是有機磷類農(nóng)藥的重要品種，由于具有良好的廣譜性、無內(nèi)吸作用，在世界范圍內(nèi)得到了廣泛應(yīng)用.但隨著研究的深入，毒死蜱的潛在環(huán)境風險越來越被人們重視.近年來，一些國家已采取行動限用或禁用毒死蜱.我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部也頒布了2032號公告，宣布自2016年12月31日起，禁止毒死蜱在蔬菜上使用[1-2].

目前毒死蜱的使用主要集中在水稻、玉米、小麥以及棉花上，盡管在蔬菜上被禁用，但對其使用總量影響較小[2].研究[3-4]顯示，施用的毒死蜱只有不到1%能作用于靶標生物，大部分將進入大氣、土壤、水體環(huán)境.土壤是毒死蜱在環(huán)境中的主要歸宿，毒死蜱在土壤環(huán)境中的殘留必然對以蚯蚓為代表的土壤生物產(chǎn)生潛在威脅，也會對土壤生態(tài)系統(tǒng)造成一定的影響.

蚯蚓是土壤環(huán)境的重要指示動物，蚯蚓既能反映土壤的污染狀況，又能鑒定指示各種有害物質(zhì)的毒性.利用蚯蚓生物標志物評價污染物對土壤動物的危害，從而對土壤生態(tài)系統(tǒng)的風險進行評價，已成為環(huán)境研究領(lǐng)域較受關(guān)注的研究熱點之一[5-8].近年來，關(guān)于毒死蜱對蚯蚓毒性的研究已有許多報道.研究表明，毒死蜱為神經(jīng)毒性殺蟲劑，蚯蚓能夠吸收并蓄積土壤中的毒死蜱[9]，毒死蜱對蚯蚓的神經(jīng)毒性可以導致蚯蚓死亡，毒死蜱對蚯蚓的LC50值為118.5～148 mg/kg[10-11].Booth等[12]研究表明，按照樂斯本(40 EC，陶氏益農(nóng)公司)的田間單次推薦施用劑量施用時，土壤毒死蜱的最大濃度相當于4 mg/kg，遠低于毒死蜱對蚯蚓的LC50值.雖然毒死蜱對蚯蚓的神經(jīng)毒性會導致蚯蚓死亡，但由于實際土壤中毒死蜱的持留量一般達不到蚯蚓的致死劑量，因此土壤中持留的毒死蜱對蚯蚓主要表現(xiàn)為低劑量的慢性毒性威脅.目前，雖然毒死蜱對蚯蚓慢性毒性的相關(guān)研究較多，但主要針對蚯蚓的生長、生殖等不同功能層次的慢性毒性進行研究[6-7,9,11-13]，很少涉及蚯蚓的慢性神經(jīng)毒性研究，對毒死蜱慢性神經(jīng)毒性引發(fā)的蚯蚓神經(jīng)行為變化以及相關(guān)機制的研究較為鮮見.

研究[14]表明，長期暴露于低劑量的毒死蜱會影響哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能，引發(fā)動物的神經(jīng)行為障礙.動物的神經(jīng)行為受神經(jīng)系統(tǒng)支配，是一種綜合性的神經(jīng)高級活動，可以綜合反映動物的神經(jīng)損傷，是動物健康狀況評價的重要指標[15].暴露于低劑量的毒死蜱對蚯蚓的慢性神經(jīng)毒性是否會影響蚯蚓神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能，從而引發(fā)蚯蚓的運動、學習記憶等神經(jīng)行為障礙，以及由此帶來的生態(tài)影響是目前尚未明確的問題.

因此，該研究擬從毒死蜱暴露引發(fā)的蚯蚓腦部神經(jīng)遞質(zhì)(乙酰膽堿、多巴胺、5-羥色胺、谷氨酸)、離子通道特征酶(Ca2+-Mg2+-ATP酶、Ca2+-ATP酶)變化入手，研究毒死蜱對蚯蚓神經(jīng)損傷導致的運動、學習記憶等神經(jīng)行為變化，并運用綜合毒性指數(shù)(IBR)評價蚯蚓生物標志物變化，探究毒死蜱暴露對蚯蚓的亞慢性神經(jīng)毒性，以期為毒死蜱污染安全性評價及土壤環(huán)境質(zhì)量評價提供參考.

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試農(nóng)藥：毒死蜱標準品(純度＞98%)購自美國Sigma公司.

供試土壤：土壤采自云南紅河地區(qū)蚯蚓采集地2～15 cm耕作層.在采樣地設(shè)5個采樣點，取樣后充分混合，得到試驗用土樣.土壤類型為紅壤，土壤經(jīng)分析未檢出毒死蜱，土壤中有機質(zhì)含量為17.86 g/kg，陽離子交換量為10.1 cmol/kg，質(zhì)地為黏壤土，pH為6.55.

供試生物為云南紅河地區(qū)采集的皮質(zhì)遠盲蚓(Amynthas corticis)，試驗蚯蚓為體質(zhì)量為 0.4～0.5 g，具有成熟環(huán)帶的健康蚯蚓.培養(yǎng)條件：溫度控制20 ℃；土壤含水量為田間最大持水量60%.試驗前將蚯蚓在供試土壤中適應(yīng)1周后取出，用純水沖洗放入鋪有濕潤滅菌紗布的玻璃皿中，恒溫(24 ℃)暗室培養(yǎng)24 h備用.

1.2 毒死蜱亞慢性毒性試驗

毒死蜱對蚯蚓的亞慢性毒性試驗除了使用人工土壤代替天然土壤外，其余均參照世界經(jīng)濟合作與發(fā)展組織(OECD)蚯蚓亞慢性毒性試驗方法(OECD 207)進行.試驗中土壤毒死蜱暴露濃度根據(jù)毒死蜱的實際施用進行設(shè)置，按照毒死蜱的田間單次推薦施用劑量施用時，土壤毒死蜱的最大濃度相當于4 mg/kg[11]，由于毒死蜱施用次數(shù)一般為2～3次，因此將土壤毒死蜱暴露濃度設(shè)置為8、12 mg/kg.

根據(jù)土壤毒死蜱暴露濃度計算毒死蜱需要量，以丙酮溶解后攪拌混勻于50 g土壤中，待丙酮完全揮發(fā)后再與450 g土壤混勻，放入500 mL培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入蒸餾水將土壤含水量調(diào)節(jié)為土壤田間最大持水量的60%，將備用蚯蚓隨機放入對照組和處理組，每瓶放入10條蚯蚓，以預留換氣孔的保鮮膜封口.在相對濕度為60%，溫度為24 ℃的條件下培養(yǎng)，每隔7 d給予5 g磨碎的干牛糞作為餌料，以丙酮空白為對照組，每個濃度及對照設(shè)4個重復.

1.3 毒死蜱亞慢性神經(jīng)毒性蚯蚓標志物測定

1.3.1 神經(jīng)行為測試

于毒死蜱亞慢性毒性試驗的第28、56天，隨機從對照組和處理組中取出蚯蚓，進行蚯蚓記憶行為和運動行為測試.蚯蚓的記憶行為測試前先進行蚯蚓學習訓練.蚯蚓學習訓練是基于蚯蚓對振動刺激不敏感，厭惡白光刺激的特性，采用白光與振動刺激配對訓練，讓蚯蚓學習通過加速運動來阻止白光刺激出現(xiàn)的策略.如蚯蚓經(jīng)過學習訓練后到達指定閾值的時間小于訓練前到達指定閾值的時間，則表明蚯蚓已領(lǐng)會通過加速運動阻止白光刺激出現(xiàn)的策略.

蚯蚓的學習訓練方法參考文獻[15].蚯蚓學習訓練裝置如圖1所示.測試臺放置于測試盒底部，為模擬蚯蚓在土壤中的移動環(huán)境，測試臺上鋪有帶圓形凸起的40 cm×40 cm塑膠墊(圓形凸起高度為0.5 cm，相鄰凸起點的距離為3 cm)，底部設(shè)有振動頻率為180 Hz的振動馬達.測試臺上方安裝可以定時控制的噴霧裝置(噴霧量 20 mL/h)以及功率均為3 W的紅色燈和白熾燈各1個.

蚯蚓學習訓練時移動位移閾值設(shè)定為9 cm，每個訓練周期包括30 s振動、30 s白光、30 s振動、30 s白光、30 s振動、30 s白光.白光刺激訓練時，若蚯蚓在30 s內(nèi)能夠移動到指定閾值，則立即關(guān)閉白燈至30 s結(jié)束后進入振動刺激.每個學習周期結(jié)束后蚯蚓休息恢復時間為7 min.當蚯蚓到達指定閾值的時間小于訓練前到達時間的次數(shù)達3次時，表明蚯蚓已領(lǐng)會通過加速運動阻止白光刺激出現(xiàn)的策略，學習訓練結(jié)束.學習訓練結(jié)束24 h后進行蚯蚓的記憶行為測試，測定蚯蚓30 s振動、30 s白光、30 s振動、30 s白光、30 s振動、30 s白光刺激期間蚯蚓到達閾值的時間.蚯蚓的運動行為測試除不需要進行學習訓練外，其余條件與記憶行為測試條件一致.

1.3.2 神經(jīng)遞質(zhì)標志物測定

將完成記憶測試的蚯蚓沖洗后，置于70%乙醇中使其麻醉，在冰盤上解剖，取腦、稱量.按照質(zhì)量與體積比為1∶9的比例加入預冷的生理鹽水，勻漿，取勻漿液離心(12 000 r/min)10 min，取上清液，采用熒光分析法測定蚯蚓腦部多巴胺(DA)、5-羥色胺(5-HT)含量[16-17].采用分光光度法測量蚯蚓腦組織中乙酰膽堿(Ach)的含量變化[18]，蚯蚓腦組織中谷氨酸(Glu)的含量變化采用高效液相色譜法測定[19].

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)結(jié)果用平均值±標準偏差的方式表示.根據(jù)蚯蚓神經(jīng)毒性標志物測定數(shù)據(jù)計算毒死蜱的綜合毒性指數(shù)(IBR)[20]，采用SPSS 26.0軟件進行單因素方差分析和多因素比較分析，數(shù)據(jù)分析采用SPSS 26.0和OriginPro 8.0軟件進行.綜合毒性指數(shù)(IBR)的計算參考文獻[21].

2 結(jié)果與討論

2.1 毒死蜱對蚯蚓的學習記憶及運動損傷

移動位移閾值是蚯蚓應(yīng)激狀態(tài)下能夠達到的移動閾值[16]，本研究中該閾值設(shè)定為9 cm.毒死蜱暴露對蚯蚓到達移動位移閾值的時間影響如圖2所示.由圖2可見，暴露期內(nèi)對照組和毒死蜱處理組的蚯蚓經(jīng)過學習訓練后到達閾值的時間均顯著低于訓練前(P均小于0.05)，表明訓練后的蚯蚓已領(lǐng)會通過加速移動阻止白光刺激出現(xiàn)的策略.訓練結(jié)束24 h后，對照組中蚯蚓到達移動位移閾值的時間與訓練結(jié)束時并無顯著差異，表明對照組中蚯蚓仍存在加速運動可阻止白光刺激出現(xiàn)的記憶，測試時通過加速移動避免了白光刺激的出現(xiàn)，因此蚯蚓到達移動位移閾值的時間與學習訓練結(jié)束時蚯蚓到達移動位移閾值時間相似；而毒死蜱處理組中蚯蚓到達移動位移閾值的時間較訓練結(jié)束時顯著增加(P均小于0.05)，但與蚯蚓學習訓練前無顯著差異，表明毒死蜱暴露導致蚯蚓出現(xiàn)了記憶障礙，喪失了加速移動可阻止白光刺激出現(xiàn)的學習記憶，測試時不能通過加速移動來避免白光刺激出現(xiàn).

圖2 毒死蜱暴露對蚯蚓到達移動位移閾值時間的影響Fig.2 Effect of chlorpyrifos exposure on the threshold time of earthworm reaching displacement

雖然蚯蚓的腦容量較小，但試驗發(fā)現(xiàn)蚯蚓通過訓練可以獲得學習記憶，這與以往蚯蚓的學習記憶研究結(jié)果[22-24]一致.Yerkes[23]首次通過試驗證實了蚯蚓(Allolobophora foetida)的學習記憶能力，隨后的研究也表明陸正蚓(Lumbricus terrestris)和赤子愛勝蚯蚓(Eisenia foetida)等不同種屬的蚯蚓均具備一定的學習記憶能力[22,24].筆者研究對照組中蚯蚓通過訓練獲得了加速移動可以阻止白光刺激出現(xiàn)的學習記憶，測試時可以借助記憶產(chǎn)生適應(yīng)性變化，通過加速移動避免白光刺激出現(xiàn)；而毒死蜱處理組中的蚯蚓由于記憶喪失，測試時難以通過加速移動來避免白光刺激出現(xiàn)，導致蚯蚓到達閾值時間較訓練結(jié)束時到達閾值的時間顯著增加(P＜0.05).

暴露于毒死蜱不僅影響了蚯蚓的學習記憶，還對蚯蚓的運動造成了不利影響.由圖2可見，毒死蜱處理組中無論是學習訓練前、訓練結(jié)束時或訓練結(jié)束24 h，蚯蚓到達移動位移閾值的時間均顯著高于對照組(P均小于0.05)，表明毒死蜱處理組中蚯蚓移動速率較對照組下降，移動緩慢，毒死蜱暴露損傷了蚯蚓的運動能力.

記憶行為與運動行為均受神經(jīng)系統(tǒng)支配，其行為變化可以綜合反映動物的神經(jīng)損傷[25].毒死蜱暴露條件下，蚯蚓能夠吸收并蓄積土壤中的毒死蜱，在毒死蜱濃度為12 mg/kg的土壤暴露56 d時，蚯蚓體內(nèi)毒死蜱濃度為3.73 mg/kg[9]，蓄積在蚯蚓體內(nèi)的毒死蜱會誘發(fā)蚯蚓的神經(jīng)損傷.筆者研究中毒死蜱暴露引發(fā)的蚯蚓記憶喪失和運動遲緩均表明蚯蚓的神經(jīng)受到了損傷，這種損傷導致了蚯蚓的記憶障礙和運動損傷.蚯蚓因記憶障礙不能對獲取信息進行提取，難以借助生活經(jīng)驗發(fā)生適應(yīng)性變化.此外，毒死蜱暴露引發(fā)的蚯蚓運動損傷會導致蚯蚓運動遲緩，難以快速找到食物、躲避天敵，活動范圍變小，不利于蚯蚓占據(jù)更豐富的資源和更適合的生存空間.以上行為變化將嚴重影響蚯蚓的生存質(zhì)量，由于蚯蚓在土壤生態(tài)系統(tǒng)中的重要作用，蚯蚓種群質(zhì)量的下降將加劇土壤生態(tài)系統(tǒng)風險[6].

2.2 毒死蜱對蚯蚓神經(jīng)遞質(zhì)變化影響

毒死蜱暴露對蚯蚓神經(jīng)遞質(zhì)變化的影響如圖3所示.由圖3可見，暴露期內(nèi)所有處理組中蚯蚓腦部谷氨酸(Glu)含量均顯著低于對照組(P均小于0.05)，且12 mg/kg毒死蜱處理組中蚯蚓腦部Glu含量均顯著低于8 mg/kg處理組(P均小于0.05).相同暴露濃度處理組中暴露56 d的蚯蚓腦部Glu含量均顯著低于暴露28 d的Glu含量(P均小于0.05)，表明毒死蜱暴露引發(fā)了蚯蚓腦部Glu含量的下降，毒死蜱暴露濃度越大，對蚯蚓腦部Glu含量的抑制越顯著，隨著暴露時間的增加，毒死蜱對蚯蚓腦部Glu含量的抑制加重.

Glu是一種具有神經(jīng)遞質(zhì)功能的氨基酸，長期研究[25]表明，Glu是生物神經(jīng)系統(tǒng)中內(nèi)源性氨基酸含量最豐富的一種，其可作為興奮性神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)揮作用，在生物的學習和記憶功能中起著重要的作用.Fisher等[26]在研究神經(jīng)發(fā)育障礙時發(fā)現(xiàn)，學習記憶功能的衰退與谷氨酸的變化有密切關(guān)聯(lián).Crupi等[27]研究表明，學習記憶功能的衰退和大腦皮層興奮性的降低均與Glu含量失調(diào)有關(guān)，Glu含量的降低會導致生物學習記憶能力下降與視覺障礙.筆者研究中毒死蜱暴露對蚯蚓腦部Glu含量的抑制是導致蚯蚓記憶障礙的因素之一.

暴露28 d時，所有毒死蜱處理組中蚯蚓腦部的5-HT、DA含量均顯著低于對照組(P均小于0.05)，但12 mg/kg毒死蜱處理組中這兩種神經(jīng)遞質(zhì)的含量與8 mg/kg毒死蜱處理組中并無顯著差異.隨著暴露時間的增加，這兩種神經(jīng)遞質(zhì)含量均持續(xù)降低，暴露56 d時毒死蜱不同暴露濃度處理組中蚯蚓腦部DA含量差異顯著(P均小于0.05)，但不同處理組中蚯蚓腦部的5-HT含量無顯著差異〔見圖3〕.

圖3 毒死蜱對蚯蚓神經(jīng)遞質(zhì)的影響Fig.3 Effects of chlorpyrifos on neurotransmitters in earthworms

5-HT、DA均為單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，5-HT在學習記憶過程中以興奮作用為主，可觸發(fā)學習記憶能力的易化作用[28]，DA與記憶的關(guān)系初步推測是通過調(diào)節(jié)精神活動、情緒、識別、思維和推理過程間接影響記憶能力[29].大腦中5-HT、DA等單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量減少會導致神經(jīng)元的缺失、細胞死亡和退化變質(zhì)，進而引起學習記憶等認知功能障礙[30].此外，DA除了參與學習記憶等神經(jīng)行為外，還與肌肉協(xié)調(diào)能力聯(lián)系密切，DA含量下降會導致運動能力受損[29].筆者研究中毒死蜱暴露引發(fā)的蚯蚓腦部5-HT、DA分泌抑制，不僅導致蚯蚓的學習記憶障礙，還導致蚯蚓的運動能力受損、移動緩慢，毒死蜱處理組中無論是學習訓練前、訓練結(jié)束時或訓練結(jié)束24 h的蚯蚓，其到達移動位移閾值的時間均顯著高于對照組.

乙酰膽堿(Ach)是中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)的一種重要遞質(zhì)，由神經(jīng)末梢胞漿中的膽堿和乙酰輔酶A在膽堿轉(zhuǎn)移酶作用下生成并進入囊泡貯存.當接受外界刺激時，在Ca2+的參與下突觸小泡與突觸前膜融合被釋放至突觸間隙后再與突觸后膜的Ach受體作用，從而介導信息的傳遞，參與學習記憶功能的完成.由圖3可見，暴露期內(nèi)毒死蜱處理組中蚯蚓腦部的Ach含量均顯著高于對照組(P均小于0.05)，且隨著暴露時間的增加，毒死蜱處理組中蚯蚓腦部Ach含量持續(xù)升高，表明毒死蜱暴露導致蚯蚓腦部Ach含量的異常升高.

毒死蜱作為有機磷農(nóng)藥，由于其分子中具有親電子性磷原子和帶有正電荷的部分，其正電荷部分與膽堿酯酶氨基酸的側(cè)鏈結(jié)合，親電子性磷原子與活性中心酯解部分(絲氨酸殘基的羧基)結(jié)合，Ach分子中的羰基碳與乙酰膽堿酯酶酯解部位的絲氨酸中的羥基以共價鍵結(jié)合生成磷酰化膽堿酯酶，使乙酰膽堿酯酶發(fā)生乙?；饔?，造成Ach的大量積累，導致蚯蚓腦部Ach含量的異常升高.

Ach積累會引起突觸傳遞受阻，引起突觸傳遞受阻，無法及時在神經(jīng)元間進行信號傳遞，出現(xiàn)學習記憶等行為障礙.如果Ach積累嚴重，神經(jīng)沖動傳導的過度刺激將使神經(jīng)纖維長期處于興奮狀態(tài)，引發(fā)一系列的神經(jīng)系統(tǒng)中毒導致生理失調(diào)甚至死亡[31].筆者研究中由于毒死蜱的暴露劑量較小，試驗中并未出現(xiàn)蚯蚓中毒死亡現(xiàn)象，但暴露組中蚯蚓出現(xiàn)了記憶障礙、運動遲緩等神經(jīng)行為變化，結(jié)合毒死蜱暴露誘發(fā)蚯蚓神經(jīng)遞質(zhì)的異常變化推測毒死蜱對蚯蚓的神經(jīng)損傷主要是由于Ach、DA等神經(jīng)遞質(zhì)的異常變化所致.

2.3 毒死蜱對蚯蚓神經(jīng)離子通道特征酶活性影響

毒死蜱對蚯蚓神經(jīng)離子通道特征酶活性影響如圖4所示.由圖4可見，暴露期內(nèi)毒死蜱處理組中蚯蚓腦部的Ca2+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性與對照組均無顯著差異，表明毒死蜱暴露對蚯蚓的神經(jīng)離子通道特征酶(Ca2+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶)的活性并無顯著影響.

圖4 毒死蜱對蚯蚓神經(jīng)離子通道特征酶活性的影響Fig.4 Effect of chlorpyrifos on the activity of characteristic enzymes of neural ion channels in earthworms

鈣離子在神經(jīng)系統(tǒng)中起十分重要的作用，它可影響軸突運輸、神經(jīng)遞質(zhì)釋放及神經(jīng)質(zhì)膜的穩(wěn)定性.研究[32]顯示，Ca2+在學習記憶功能的突觸模型—海馬長時程增強(LTP)的誘導和維持中起重要作用，動物學習記憶的下降與海馬突觸內(nèi)Ca2+超載有關(guān).正常情況下，神經(jīng)膜內(nèi)外Ca2+分布是不同的，呈膜外高于膜內(nèi)的特征.而Ca2+在膜內(nèi)外的調(diào)節(jié)主要依靠Ca2+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶完成[33].

Ca2+-ATP酶可以催化質(zhì)膜內(nèi)側(cè)的ATP水解，釋放出能量驅(qū)動細胞內(nèi)的Ca2+泵出細胞或泵入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中儲存，以維持細胞內(nèi)低濃度的游離Ca2+.由于其活性依賴于ATP與Mg2+的結(jié)合，所以與Ca2+-Mg2+-ATP酶一起構(gòu)成了鈣泵，是維持神經(jīng)細胞內(nèi)低Ca2+穩(wěn)態(tài)的重要基礎(chǔ).研究[34]表明，Ca2+-ATP酶可以水解ATP，使細胞內(nèi)Ca2+泵到細胞外，以維持細胞內(nèi)相對較低的Ca2+濃度，Ca2+-Mg2+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性的下降，可能會導致神經(jīng)膜內(nèi)外Ca2+分布的異常，出現(xiàn)胞內(nèi)鈣超載，從而導致記憶障礙.筆者研究中毒死蜱暴露對蚯蚓Ca2+-Mg2+-ATP酶、Ca2+-ATP酶的活性均無抑制作用，表明Ca2+-Mg2+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性抑制引發(fā)的胞內(nèi)鈣超載并不是毒死蜱暴露誘發(fā)的蚯蚓記憶障礙存在的可能機制.

2.4 毒死蜱對蚯蚓的亞慢性神經(jīng)毒性IBR分析

用Ach、Glu、DA等6種神經(jīng)毒性生物指示物含量、酶活性及記憶行為的變化率做雷達圖(見圖5)，比較不同暴露濃度的毒死蜱對蚯蚓各指示物的影響程度.由圖5可見，蚯蚓Ach、Glu等神經(jīng)遞質(zhì)含量對毒死蜱的響應(yīng)較顯著，而神經(jīng)離子通道特征酶—Ca2+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性對毒死蜱無響應(yīng)作用.

圖5 毒死蜱對蚯蚓神經(jīng)毒性標志物的影響Fig.5 Effects of chlorpyrifos on neurotoxic markers of earthworms

運用蚯蚓神經(jīng)毒性標志物的綜合毒性指數(shù)(IBR)來評價蚯蚓生物標志物變化，評估毒死蜱對蚯蚓的亞慢性神經(jīng)毒性.由圖6可見：暴露28 d時，8、12 mg/kg毒死蜱對蚯蚓的亞慢性神經(jīng)毒性IBR值分別為3.227 5、4.524 6；暴露56 d時，IBR值分別為3.884 8、5.899 5.結(jié)果表明，12 mg/kg毒死蜱對蚯蚓的亞慢性神經(jīng)毒性大于8 mg/kg毒死蜱，隨著暴露時間的增加，不同暴露濃度的毒死蜱對蚯蚓的亞慢性神經(jīng)毒性增強.毒死蜱對蚯蚓的亞慢性神經(jīng)毒性會導致蚯蚓的神經(jīng)損傷，但這種神經(jīng)損傷是否會隨著暴露消除而修復，還有待進一步研究.

圖6 毒死蜱對蚯蚓亞慢性神經(jīng)毒性綜合毒性指數(shù)的影響Fig.6 Subchronic neurotoxicity IBR values of chlorpyrifos to earthworms

3 結(jié)論

a) 毒死蜱對蚯蚓的神經(jīng)損傷導致了蚯蚓的運動遲緩和學習記憶障礙.暴露28～56 d內(nèi) ，毒死蜱處理組中蚯蚓腦部的Ach含量均顯著高于對照組(P＜0.05)，而蚯蚓腦部DA、5-HT、Glu含量均顯著低于對照組(P均小于0.05).隨著暴露時間的增加，毒死蜱對這4種神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響加重，毒死蜱暴露誘發(fā)的蚯蚓神經(jīng)遞質(zhì)異常是蚯蚓運動遲緩、學習記憶障礙神經(jīng)行為變化的可能機制之一.

b) 暴露 28 d時，8、12 mg/kg毒死蜱對蚯蚓的IBR值分別為3.227 5、4.524 6，暴露56 d時的IBR值分別為3.884 8、5.899 5，毒死蜱對蚯蚓的亞慢性神經(jīng)毒性隨著毒死蜱的暴露濃度、暴露時間增加而增強.