虎恩熊，賈勇正，錢棟全，李偉建，孫芳芳

(云南潤杰農業(yè)科技股份有限公司，云南 昆明 650000)

γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是由D-/L-谷氨酸單體通過γ-酰胺鍵連接而成的一種直鏈纖維狀生物大分子[1]，是一種具有生物可降解性、保濕性、高吸水性、成纖維性、生物相容性、可食用性和超強的吸附性等特性的不具毒性的新型天然高分子[2]，被廣泛運用于食品、醫(yī)藥、環(huán)保、化妝品和農業(yè)等多個領域。目前γ-聚谷氨酸的生產制備主要采用微生物發(fā)酵法，在γ-聚谷氨酸發(fā)酵生產中，細菌中芽孢桿菌屬類是應用最多的，其中以枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌為典型代表[3]。微生物發(fā)酵法生產γ-聚谷氨酸，發(fā)酵工藝和生產菌株是主要的影響因素，本文通過對實驗室現有產γ-聚谷氨酸菌株的篩選和發(fā)酵條件優(yōu)化，以期實現γ-聚谷氨酸高產量和高效率生產。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

化學試劑：蔗糖、葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、檸檬酸、甘油、酵母浸粉、谷氨酸鈉、硫酸鎂、氯化鈉、氯化鈣、磷酸氫二鉀、硫酸錳、消泡劑、95%乙醇(除消泡劑外，其余化學試劑均為分析純)。儀器：恒溫搖床，無菌操作臺，滅菌鍋，恒溫培養(yǎng)箱，電子天平，50 L 發(fā)酵罐，紫外分光光度計。

1.2 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

1.2.1 培養(yǎng)基

平板培養(yǎng)基：蛋白胨0.8%，牛肉膏0.3%，氯化鈉0.5%，葡萄糖0.25%，瓊脂1.6%，自然pH；滅菌條件：121 ℃，20 min。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖1%，蛋白胨1%，谷氨酸鈉2%，硫酸鎂0.1%，氯化鈉0.5%，磷酸氫二鉀0.05%，pH7.0；滅菌條件：121 ℃，20 min。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖3.5%，蛋白胨2%，谷氨酸鈉4%，硫酸鎂0.1%，氯化鈉0.5%，氯化鈣0.01%，磷酸氫二鉀0.05%，硫酸錳0.02%，消泡劑1%，pH7.0；滅菌條件：121 ℃，20 min。

1.2.2 培養(yǎng)方法

平板活化培養(yǎng)：在無菌條件下，挑取一環(huán)保存于 -4 ℃ 冰箱的枯草芽孢桿菌株種接種于平板培養(yǎng)基中，37 ℃ 恒溫培養(yǎng)12～14 h，作為一次活化菌種。將一次活化菌種接種于新鮮平板培養(yǎng)基中，37 ℃ 下靜置培養(yǎng)12～14 h，作為二次活化菌種。

種子培養(yǎng)：在無菌條件下，挑取平板培養(yǎng)好的二次活化菌種接種于搖瓶種子培養(yǎng)基上，置于搖床上 200 r/min，37 ℃ 恒溫培養(yǎng)約12～14 h，待OD600大于8時取出為種子液備用。

發(fā)酵培養(yǎng)：以3%的接種量將種子培養(yǎng)液接種到 250 mL 三角瓶中，按照發(fā)酵液初始pH7.0，發(fā)酵轉速 200 r/min，發(fā)酵溫度 37 ℃，裝液量60%即 150 mL 進行恒溫培養(yǎng) 72 h。

1.3 高產γ-聚谷氨酸菌株篩選

挑選實驗室現有的8株產γ-聚谷氨酸菌株，分別接種于平板培養(yǎng)基活化后，在無菌條件下接種至種子搖瓶上，待OD600值大于8時接種至發(fā)酵搖瓶上進行發(fā)酵培養(yǎng)，37 ℃ 恒溫培養(yǎng) 72 h 后測定γ-聚谷氨酸產量，對比得到聚谷氨酸產量最高的菌株HG-02，其最終產量為 21.3 g/L。菌株HG-02經 16 s rDNA鑒定為枯草芽孢桿菌，為谷氨酸依賴性菌株。

聚谷氨酸質量濃度采用酒精法測量：取 10 mL 發(fā)酵液，10000 r/min 離心 30 min，去除菌體。加入3倍體積的95%乙醇，充分攪拌待聚谷氨酸析出后，加入蒸餾水進行重溶，再加入3倍體積的95%乙醇析出聚谷氨酸，反復溶3次后，將聚谷氨酸置于 50 ℃ 烘干至恒重，得到聚谷氨酸質量濃度。

1.4 單因素試驗優(yōu)化初始發(fā)酵培養(yǎng)基

1.4.1 氮源種類與質量濃度篩選

以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎，分別設置不同的氮源：牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉，其它條件相同，通過發(fā)酵培養(yǎng)測定聚谷氨酸質量濃度獲得最佳氮源。再設置最佳氮源的添加量分別為 30 g/L，35 g/L，40 g/L，45 g/L，50 g/L。每個試驗組設置3個平行，37 ℃ 恒溫培養(yǎng) 72 h 后，測定發(fā)酵液中聚谷氨酸質量濃度。

1.4.2 碳源種類與質量濃度篩選

以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎，分別設置不同的碳源：蔗糖、葡萄糖、檸檬酸，其它條件相同，通過發(fā)酵培養(yǎng)測定聚谷氨酸質量濃度獲得最佳碳源。再設置最佳碳源的質量濃度分別為 20 g/L，25 g/L，30 g/L，40 g/L，45 g/L。每個試驗組設置3個平行，37 ℃ 恒溫培養(yǎng) 72 h 后，測定發(fā)酵液中聚谷氨酸質量濃度。

1.4.3 谷氨酸鈉添加量篩選

對于谷氨酸依賴型菌株，發(fā)酵培養(yǎng)基中必須有谷氨酸存在才能合成聚谷氨酸，如果培養(yǎng)基中沒有谷氨酸，則不能合成聚谷氨酸[4]。谷氨酸鈉的質量濃度就顯得非常重要，設置質量濃度分別為 30 g/L，40 g/L，50 g/L，60 g/L，70 g/L。每個試驗組設置3個平行，37 ℃ 恒溫培養(yǎng) 72 h 后，測定發(fā)酵液中聚谷氨酸質量濃度。

1.5 單因素試驗優(yōu)化發(fā)酵工藝

1.5.1 搖瓶轉速篩選

發(fā)酵培養(yǎng)基的轉速影響發(fā)酵體系的物質傳遞、氧氣傳遞[5]。為探尋發(fā)酵中最佳搖瓶轉速，分別設置轉速為 160 r/min，180 r/min，200 r/min，220 r/min，240 r/min。每個試驗組設置3個平行，37 ℃ 恒溫培養(yǎng) 72 h 后，測定發(fā)酵液中聚谷氨酸質量濃度。

1.5.2 接種量篩選

接種量影響發(fā)酵液中菌體的富集速度和含量，從而影響產物的積累。為探尋發(fā)酵中最佳接種量，分別設置接種量為3%，4%，5%，6%，7%。每個試驗組設置3個平行，37 ℃ 恒溫培養(yǎng) 72 h 后，測定發(fā)酵液中聚谷氨酸質量濃度。

1.5.3 初始pH值篩選

pH對微生物的生長和代謝產物生成都有很大影響,不同的微生物對pH值的要求是不同的，為探尋發(fā)酵中最佳初始pH值，分別設置初始pH值為6.4，6.6，6.8，7.0，7.2。每個試驗組設置3個平行，37 ℃ 恒溫培養(yǎng) 72 h 后，測定發(fā)酵液中聚谷氨酸質量濃度產量。

1.5.4 發(fā)酵溫度篩選

從酶反應動力學來看，溫度升高，反應速度加大，生長代謝加快，產物生成提前。但是，溫度越高酶失活越快，菌體易于衰老，影響產物的生成。為探尋發(fā)酵過程中的最佳溫度，分別設置發(fā)酵溫度為 32 ℃，34 ℃，36 ℃，38 ℃，40 ℃。每個試驗組設置3個平行，37 ℃ 恒溫培養(yǎng) 72 h 后，測定發(fā)酵液中聚谷氨酸質量濃度。

1.5.5 發(fā)酵時間篩選

發(fā)酵時間的長短直接關系到產物的積累，為探尋最佳發(fā)酵時間，分別設置發(fā)酵時間為 24 h，36 h，48 h，60 h，72 h。每個試驗組設置3個平行，37 ℃ 恒溫培養(yǎng) 72 h 后，測定發(fā)酵液中聚谷氨酸質量濃度。

1.5.6 裝液量篩選

裝液量影響發(fā)酵液的溶氧，為探尋最佳發(fā)酵裝液量，分別設置裝液量為20%，30%，40%，50%，60%。每個試驗組設置3個平行，37 ℃ 恒溫培養(yǎng) 72 h 后，測定發(fā)酵液中聚谷氨酸質量濃度。

1.6 正交試驗優(yōu)化發(fā)酵條件

根據單因素實驗情況，選擇培養(yǎng)基及含量、發(fā)酵溫度、初始發(fā)酵pH、接種量、裝液量等來確定最優(yōu)的發(fā)酵條件。正交試驗表根據實際情況選擇，每組試驗設置3個平行，通過測定最終γ-聚谷氨酸質量濃度確定最佳發(fā)酵條件。

1.7 小試發(fā)酵

根據單因素試驗和正交試驗結果進行 50 L 罐子小試發(fā)酵試驗，驗證優(yōu)化后的發(fā)酵條件。種子液接種方法為火焰接種法，從發(fā)酵開始每隔 2 h 記錄pH和溶氧的變化，同時發(fā)酵 12 h 后每隔 2 h 取樣測量γ-聚谷氨酸質量濃度直至發(fā)酵結束。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗優(yōu)化培養(yǎng)基成分

采用 250 mL 三角瓶進行單因素優(yōu)化發(fā)酵試驗，按照發(fā)酵初始pH7.0，發(fā)酵轉速 200 r/min，發(fā)酵溫度 37 ℃，裝液量 150 mL，接種量4%進行培養(yǎng)，發(fā)酵時間 48 h，發(fā)酵完成后檢測發(fā)酵終點發(fā)酵液中的γ-聚谷氨酸質量濃度，按γ-聚谷氨酸質量濃度來確定培養(yǎng)基最優(yōu)成分及用量。發(fā)酵試驗結果如圖1，圖2，圖3，圖4，圖5所示。

圖1 不同氮源對γ-聚谷氨酸質量濃度的影響

圖2 不同碳源對γ-聚谷氨酸質量濃度的影響

圖3 蔗糖含量對γ-聚谷氨酸質量濃度的影響

圖4 蛋白胨含量對γ-聚谷氨酸質量濃度的影響

圖5 谷氨酸鈉含量對γ-聚谷氨酸質量濃度的影響

由圖可知，菌株HG-02發(fā)酵生產γ-聚谷氨酸的最佳碳源為蔗糖，最佳氮源為蛋白胨，其中蔗糖最佳質量濃度為 40 g/L，蛋白胨最佳質量濃度為 35 g/L，谷氨酸鈉最佳質量濃度為 50 g/L。

2.2 單因素試驗優(yōu)化發(fā)酵工藝

采用 250 mL 三角瓶進行單因素優(yōu)化發(fā)酵試驗，按照單因素優(yōu)化的培養(yǎng)基配方蔗糖4%，蛋白胨4%，谷氨酸鈉5%，硫酸鎂0.1%，氯化鈉0.5%，氯化鈣0.01%，磷酸氫二鉀0.05%，硫酸錳0.02%來進行發(fā)酵，發(fā)酵完成后檢測發(fā)酵終點發(fā)酵液中的γ-聚谷氨酸質量濃度，按γ-聚谷氨酸質量濃度來確定培養(yǎng)基最優(yōu)成分及用量。發(fā)酵試驗結果如圖6，圖7，圖8，圖9，圖10，圖11所示。

圖6 搖瓶轉速對γ-聚谷氨酸質量濃度的影響

圖7 接種量對γ-聚谷氨酸質量濃度的影響

圖8 初始pH對γ-聚谷氨酸質量濃度的影響

圖9 溫度對γ-聚谷氨酸質量濃度的影響

圖10 發(fā)酵時間對γ-聚谷氨酸質量濃度的影響

圖11 裝液量對γ-聚谷氨酸質量濃度的影響

由圖可知，菌株HG-02發(fā)酵生產γ-聚谷氨酸的最佳轉速為 220 r/min，最佳接種量為6%，最佳初始pH為6.8，最佳發(fā)酵溫度為 36 ℃，最佳發(fā)酵時間為 48 h，最佳裝液量為40%。

2.3 正交試驗優(yōu)化發(fā)酵條件

根據以上單因素實驗情況，選擇發(fā)酵溫度、谷氨酸鈉、蔗糖、發(fā)酵溫度進行正交試驗來確定最優(yōu)的發(fā)酵條件，正交設計表及結果如表2所示，各因素水平如表1所示。

從正交試驗結果表可知，影響γ-聚谷氨酸產率的因素順序為B>A>D>C，即谷氨酸鈉>蔗糖>發(fā)酵溫度>初始pH，選擇最優(yōu)的組合為A2B3C3D3，即：谷氨酸鈉 60 g/L,蔗糖 40 g/L,初始pH值7.0，發(fā)酵溫度 37 ℃。根據此條件進行搖瓶發(fā)酵，至 48 h 發(fā)酵結束，測定γ-聚谷氨酸含量為 34.2 g/L。

表1 正交試驗各因素水平

表2 正交試驗設計表及結果

2.4 小試發(fā)酵

在無菌條件下，用接種針挑取一環(huán)在平板上活化的菌體接種至種子搖瓶種中，放置于 37 ℃ 恒溫搖床上，設置轉速為 220 r/min，培養(yǎng)12～14 h，待菌液OD600大于 8 h，接種至 50 L 發(fā)酵罐上。發(fā)酵罐空消 121 ℃ 滅菌 20 min，實消 121 ℃ 滅菌 30 min，裝液量為 20 L(實消后體積為 21.5 L)，初始pH為7.01(實消后pH為6.86)，接種量為6%，攪拌轉速為 220 r/min，通風量為 1.6 m3/h，罐壓為 0.07 Mpa，37 ℃ 恒溫培養(yǎng)。發(fā)酵結束后，測量聚谷氨酸最高質量濃度為 35.9 g/L。發(fā)酵過程中的pH、溶氧及聚谷氨酸質量濃度變化如圖12所示。

圖12 小試發(fā)酵pH、溶氧及聚谷氨酸質量濃度變化

3 小結

從實驗室現有產γ-聚谷氨酸菌株中篩選出一株高產菌株HG-02，經16srDNA鑒定為枯草芽孢桿菌。以初始培養(yǎng)基為基礎，通過單因素試驗和正交試驗獲得菌株HG-02產γ-聚谷氨酸的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方和工藝：蔗糖4%，蛋白胨3.5%，谷氨酸鈉6%，硫酸鎂0.1%，氯化鈉0.5%，氯化鈣0.01%，磷酸氫二鉀0.05%，硫酸錳0.02%，初始pH7.0，121 ℃ 滅菌 30 min，250 mL 三角瓶，裝液量40%即 100 mL，接種量6%，搖床轉速為 220 r/min，37 ℃ 振蕩培養(yǎng) 48 h。最后用 50 L 小試發(fā)酵試驗驗證，測得聚谷氨酸最終質量濃度為 35.9 g/L，相較于初始發(fā)酵工藝產量提高了68.5%，后續(xù)將繼續(xù)進行放大試驗。