魏逸鳴， 張俊文

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科， 重慶 400042)

冠狀病毒為一種正鏈RNA病毒(+ssRNA)，因其特征為包膜上存在眾多的刺突糖蛋白、在電子顯微鏡下酷似王冠狀的外觀而得名。嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)，為目前已確定的7種能夠感染人類的人類冠狀病毒之一。自2019年12月開始暴發(fā)的2019冠狀病毒病(coronavirus disease 2019 , CoVID-19)與SARS-CoV-2野生型毒株密切相關(guān)，至今對(duì)人類社會(huì)造成了相當(dāng)大的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，已然成為全球范圍內(nèi)最受關(guān)注的公共衛(wèi)生事件[1]。SARS-CoV-2如同所有RNA病毒一樣易于遺傳進(jìn)化，導(dǎo)致了多種與祖先菌株相比具有不同特征的變體出現(xiàn)，這些特征主要表現(xiàn)為傳播力和(或)毒力的增強(qiáng)、通過自然感染和(或)疫苗接種獲得抗體的中和作用減弱、逃避檢測(cè)能力、降低治療和(或)疫苗接種的有效性等。為此，世界衛(wèi)生組織建立了一個(gè)分類系統(tǒng)，將SARS-CoV-2譜系中具有特定遺傳標(biāo)記的變體定義為感興趣的變體(variant of Interest, VOI)；而更加受到高度重視與廣泛關(guān)注的新變體則獨(dú)立為受關(guān)注的變體(variants of Concern, VOC)。截至2021年12月，已經(jīng)有4個(gè)主要譜系被世界衛(wèi)生組織確定為VOC，包括Alpha(B.1.1.7毒株)、Beta(B.1.351毒株)、Gamma(P.1毒株)和Delta(B.1.617.2毒株)。Delta變異株于2020年10月在印度首次被檢測(cè)到，最初被認(rèn)為是VOI，但其極快的傳播速度促使世界衛(wèi)生組織在2021年5月將其歸類為VOC，截至2021年11月16日，Delta變異株已經(jīng)傳播到至少110個(gè)國(guó)家，在大多數(shù)國(guó)家Delta變異株已勝過包括其他VOC在內(nèi)的所有變體[2,3]。本文就SARS-CoV-2 Delta變異株的病毒結(jié)構(gòu)、動(dòng)力學(xué)及臨床特征研究進(jìn)展作簡(jiǎn)要綜述。

1 Delta變異株的結(jié)構(gòu)及功能改變

1.1 SARS-CoV-2蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)及Delta變異株突變位點(diǎn)

了解病毒結(jié)構(gòu)對(duì)于解決Delta變異株的發(fā)病機(jī)制極其重要。SARS-CoV-2和其他冠狀病毒一樣，其主要組成部分為4種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)：刺突蛋白(S蛋白)、包膜糖蛋白(E蛋白)、核衣殼(N蛋白)和膜蛋白(M蛋白)。除此之外，還有16種非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)和5～8種輔助蛋白質(zhì)。其中，S、E、N、M基因分別編碼結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，而非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)則由14個(gè)功能性開放閱讀框(ORF)編碼[4]。刺突蛋白在病毒的致病和傳播中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。大量糖基化的刺突蛋白，位于病毒粒子的外表面，通過與宿主細(xì)胞受體結(jié)合介導(dǎo)病毒進(jìn)入，這是病毒感染的關(guān)鍵因素[5]。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶 2(angiotensin converting enzyme 2, ACE2)已被證實(shí)為SARS-CoV-2的受體，而刺突蛋白的另一個(gè)已知受體——二肽基肽酶 4(dipeptidyl peptidase 4, DPP4)，則并不能介導(dǎo)SARS-CoV-2進(jìn)入靶細(xì)胞[6]。刺突蛋白在天然狀態(tài)下作為無活性前體存在，在感染靶細(xì)胞的過程中，靶細(xì)胞膜上的蛋白酶(例如跨膜絲氨酸蛋白酶transmembrane protease serines2, TMPRSS2和Furin蛋白酶)將刺突蛋白切割成氨基端(N-端)S1亞基和羧基端(C-端)S2 亞基。其中，S1亞基中的受體結(jié)合域(receptor binding domain, RBD)負(fù)責(zé)與ACE2受體結(jié)合，而S2亞基的主要部分HR結(jié)構(gòu)域，包括HR1和HR2，主要負(fù)責(zé)病毒的融合與進(jìn)入[7-9]。在病毒的融合過程中，HR1與HR2相互作用形成6-HB，這一過程實(shí)現(xiàn)了刺突蛋白的縮短，以此拉進(jìn)其與靶細(xì)胞的距離并實(shí)現(xiàn)融合(Fig.1 SARS-CoV-2結(jié)構(gòu))。膜蛋白是含量最豐富的蛋白質(zhì)，為病毒組裝創(chuàng)造環(huán)境，并決定了病毒包膜的形狀。包膜糖蛋白是最小的主要結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，參與了病毒組裝，在病毒出芽過程中扮演了必不可少的角色。核衣殼蛋白是形成病毒核衣殼唯一的蛋白質(zhì)，其主要作用是與冠狀病毒RNA基因組結(jié)合并參與病毒基因組相關(guān)過程[10]。

Fig.1 The Structure of SARS-CoV-2 (A) Relative position of SARS-CoV-2 structural protein genes. (B) Structure and domains of spike protein① and proteases on the target cell membrane—Furin (S1/S2) and TMPRSS2 (S2′) cleavage sites, in which NTD means N-terminal domain and RBM means receptor-binding motif. (C) After the spike protein binds to the ACE2 receptor, the spike protein is cleaved into S1 and S2 subunits, in which the HR1 and HR2 subunits in S2 form a 6-helix bundle (6-HB) to promote the interaction of SARS-CoV-2 with Target cell membrane fusion

SARS-CoV-2結(jié)構(gòu)的復(fù)制從附著和進(jìn)入靶細(xì)胞開始。刺突蛋白與靶細(xì)胞ACE2受體結(jié)合后，蛋白酶裂解刺突蛋白促使病毒進(jìn)入，隨之病毒RNA被釋放并翻譯多種蛋白質(zhì)組裝復(fù)制酶-轉(zhuǎn)錄酶復(fù)合物，RNA得以復(fù)制。待結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)完整組裝后，病毒粒子以囊泡形式運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞表面，并通過胞吐作用釋放。這便是SARS-CoV-2在靶細(xì)胞中的整個(gè)生命周期。

Nextstrain基因樹以淺顯易懂的預(yù)估變異株出現(xiàn)時(shí)間年份加字母排序命名各變異株，同時(shí)加注世界衛(wèi)生組織官方命名。Delta變異株(21A)在20A基礎(chǔ)上進(jìn)一步突變，與另一VOC Kappa變異株同源(Fig.2)。在基因樹上可追溯的Delta變異株與SARS-CoV-2野生株相比，總計(jì)有23個(gè)突變。其中，18個(gè)為非同義突變(見Table 1 SARS-CoV-2 Delta亞型的非同義突變(B.1.617.2))，這并不代表Delta變異株中的每個(gè)序列都擁有所有的突變[11]。Delta變異株有9個(gè)突變位點(diǎn)與刺突蛋白相關(guān)，也被認(rèn)為是其成為最具傳播性變異株的關(guān)鍵突變。在刺突蛋白上，受體結(jié)合域中的突變被普遍認(rèn)為與病毒傳染性、人與人之間的傳播、免疫逃逸緊密掛鉤，因此顯得尤為敏感。在Delta變異株中，包括L452R和T478K。

Fig.2 Phylogenetic relationships of Nextstrain clades of SARS-CoV-2 The origin and developmental relationship of the variants/clades of SARS-CoV-2. Variant names use the Nextstrain SARS-CoV-2 clade naming strategy, which means "year-letter" accorded by the official WHO designation [11]

Table 1 Non-synonymous mutation of SARS-CoV-2 Delta variant (B.1.617.2)

1.2 Delta變異株突變位點(diǎn)對(duì)中和抗體和血清的影響

L452R突變用精氨酸替代了452位的亮氨酸，在全球范圍的刺突蛋白受體結(jié)合域流行突變頻率中高居第二[12]。親水性452R突變消除了L452殘基的疏水作用，使得突變復(fù)合物具有較低的最小能量，這可能有助于與水分子的相互作用以及復(fù)合物的整體穩(wěn)定性，進(jìn)而允許刺突蛋白以更高的親和力附著在ACE2受體上[13]。這樣的特點(diǎn)使得L452R突變面對(duì)多種抗體均表現(xiàn)出了中和效力降低。例如，LY-CoV555/bamlanivimab單克隆抗體，原本L452殘基與其結(jié)合界面為疏水區(qū)，基因突變的發(fā)生導(dǎo)致了抗體敏感性的降低[14]。針對(duì)LY-CoV555的所有逃避抗體結(jié)合的受體結(jié)合域突變組合中，L452R表現(xiàn)出了第2高頻率的抗體逃逸，也從反面印證了這一突變特征[15]。目前，bamlanivimab EUA的情況說明書中已明確提示，L452R突變使bamlanivimab中和作用降低了1 000倍以上，這意味著bamlanivimab的抗體應(yīng)用應(yīng)避免單藥治療，尤其對(duì)于Delta變異株廣泛傳播的地區(qū)。

T478K突變，用正氨基酸(賴氨酸)取代了不帶電荷的氨基酸(蘇氨酸)，這可能顯著改變了蛋白質(zhì)的靜電表面，使其較突變前擁有了更高的凈電荷、偶極矩，產(chǎn)生較低的溶劑化和表面自由能，從而降低蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，使刺突蛋白得以更容易與ACE2受體相結(jié)合[16]。結(jié)果顯示，L452R+T478K的基因突變組合的確增加了受體結(jié)合域與ACE2受體之間的結(jié)合親和力[17]。通過與Kappa變異株比較得出，T478K突變極有可能影響imdevimab單克隆抗體的中和效力，其機(jī)制尚不明確[18]。

除了直接影響受體結(jié)合域，基因突變還能通過影響刺突蛋白的切割來加快病毒傳播進(jìn)程，例如P681R突變。P681R突變用精氨酸取代了681位的脯氨酸，這可能增加了靶細(xì)胞膜上蛋白酶額外接觸，促進(jìn)S1～S2亞基切割，允許病毒更好地融合和整合到靶細(xì)胞中[13]。

D614G突變用甘氨酸取代了614位的天冬氨酸，這增加了刺突蛋白R(shí)BD的空間靈活性，使得刺突蛋白有更高的可能性與ACE2結(jié)合與融合[19]。在體外研究中，D614G突變已被證明提高了病毒傳染性[20,21]。

與先前提及的單克隆抗體的作用機(jī)制不同，BNT162b2是一種通過脂質(zhì)納米配方將SARS-CoV-2完整的刺突蛋白固定在病毒融合前構(gòu)象的mRNA疫苗[22]。已有研究證實(shí)，接種BNT162b2后的人類血清對(duì)Delta變異株相比于SARS-CoV-2野生株依然有超過80%的中和效力[23,24]，說明Delta變異株的強(qiáng)感染力并不是通過刺突蛋白的顯著改構(gòu)而產(chǎn)生抗原性的變化。與BNT162b2類似，ZF2001是一種以刺突蛋白R(shí)BD為抗原的蛋白質(zhì)亞單位疫苗，其對(duì)Delta變異株同樣保有中和活性[25]。事實(shí)上，相比于B.1.1.7毒株的活病毒顆粒，Delta變異株中檢測(cè)到更多的切割刺突[26]。這進(jìn)一步證實(shí)，其刺突蛋白基因上的關(guān)鍵突變所引起的蛋白酶切割增加效應(yīng)增強(qiáng)了Delta變異株的感染力。

1.3 Delta變異株的蛋白質(zhì)表征

在體外研究中證實(shí)，當(dāng)刺突蛋白在細(xì)胞表面以飽和水平表達(dá)時(shí)，Delta變異株可以比其他變體更快地融合細(xì)胞膜和感染靶細(xì)胞，尤其會(huì)更有效地與產(chǎn)生低水平ACE2受體的靶細(xì)胞融合，這使得Delta變異株能在相對(duì)短暫的暴露后傳播，并迅速感染更多的宿主細(xì)胞，從而導(dǎo)致潛伏期縮短和感染期間病毒載量變大。但是，研究表明，完整的全長(zhǎng)Delta變異株的刺突蛋白受氟林蛋白酶(靶細(xì)胞膜上蛋白酶)切割的效率并無顯著增加，且與ACE2受體的親和力亦無明顯升高[27]，這與單獨(dú)研究Delta變異株突變位點(diǎn)相關(guān)變化截然相反。

2 病毒動(dòng)力學(xué)

Delta變異株有人群快速傳播的特點(diǎn)，這個(gè)特點(diǎn)以更加具體的方式反映在單個(gè)感染者身上。與SARS-CoV-2野生株相比，Delta變異株感染患者的峰值病毒載量明顯更高，且病毒的脫落時(shí)間更長(zhǎng)[28,29]。在相對(duì)小而密閉的空間中，Delta變異株表現(xiàn)出了更強(qiáng)的流通性。在俄克拉荷馬州，一項(xiàng)針對(duì)體操設(shè)施相關(guān)的Delta變異株暴發(fā)案例提示，室內(nèi)運(yùn)動(dòng)場(chǎng)所具有高風(fēng)險(xiǎn)性，并且家庭中的二次傳播率有顯著升高[30]。與Alpha變異株相比，Delta變異株相關(guān)的家庭傳播幾率增加了70%[31]。

2021年5月至6月，在中國(guó)廣東省集中暴發(fā)了COVID-19 Delta變異株感染，盡管在廣東省的積極干涉措施下最終得以控制，其快速傳播力仍導(dǎo)致共167例病例感染。相較于2019年12月中國(guó)湖北省首次暴發(fā)的COVID-19 野生株感染，廣東省COVID-19 Delta變異株感染平均潛伏期由5.2 d縮短至4.4 d，平均感染間隔時(shí)間更是由5.7 d縮短至2.9 d[32]。這一階段疫情中，Delta變異株感染患者病毒載量在血清學(xué)檢測(cè)陽性初期有顯著增高[33]。

3 臨床特征

3.1 SARS-CoV-2野生株感染COVID-19患者的臨床特征

據(jù)統(tǒng)計(jì)，有17.9%至33.3%的COVID-19 SARS-CoV-2 野生株感染患者為無癥狀感染者，而在有癥狀的患者中，絕大多數(shù)的臨床表現(xiàn)為發(fā)燒、咳嗽和氣短，其余較少出現(xiàn)的癥狀包括喉嚨痛、嗅覺障礙、味覺障礙、厭食、惡心、不適、肌痛和腹瀉等[34,35]。在美國(guó)一項(xiàng)針對(duì)373 883例確診的有癥狀的COVID-19病例研究中，70%的患者有發(fā)燒、咳嗽和呼吸急促的表現(xiàn)。除此外,第2、第3高頻率癥狀，肌痛與頭痛，分別僅占36%和34%[36]。在中國(guó)，COVID-19 SARS-CoV-2 野生株感染患者的臨床特征與世界其他國(guó)家差異不大。對(duì)中國(guó)8 697名COVID-19患者臨床病理特征的研究表明，發(fā)燒(78.4%)和咳嗽(58.3%)仍為最普遍的癥狀。這項(xiàng)研究中的無癥狀患者僅占5.4%[37]。

3.2 SARS-CoV-2 Delta變異株感染COVID-19患者的臨床特征

目前，已知的SARS-CoV-2 Delta變異株感染常見癥狀包括發(fā)燒、咳嗽、呼吸急促、嘔吐、腹瀉、喉嚨痛和頭痛，諸如肌痛、味覺喪失、嗅覺喪失、疲勞和流涕等癥狀亦有報(bào)道。其中，發(fā)燒與咳嗽依然占據(jù)主要比例，整體臨床表現(xiàn)不具備特異性。一項(xiàng)針對(duì)中國(guó)廣州的159例確診Delta變異株感染患者的研究中，中度癥狀的感染患者以61.6%的比例占大多數(shù)；輕癥患者占25.8%；重癥及危急癥患者占12.5%。其中，呼吸道癥狀與野生株感染患者相差不大，但腹瀉、嘔吐等消化道癥狀明顯少于SARS-CoV-2野生株感染患者，同時(shí)老年患者更多[28]。在蘇格蘭，SARS-CoV-2 Delta變異株感染患者有年輕化的特點(diǎn)[38]。

4 問題與展望

SARS-CoV-2 Delta變異株作為目前印度新型冠狀病毒肺炎的主要致病株，已經(jīng)表現(xiàn)出了驚人的傳播力，并對(duì)歐美國(guó)家造成了大面積的感染。中國(guó)作為目前全世界抗疫防疫最為嚴(yán)格與成功的國(guó)家，亦需要對(duì)其進(jìn)行全面深入的了解，以做到提前預(yù)防、盡早發(fā)現(xiàn)、妥善治療。事實(shí)上，中國(guó)針對(duì)新型冠狀病毒肺炎的防控措施已被證明是有效的，這些包括戴口罩、保持社交距離、限制社交活動(dòng)和社區(qū)區(qū)域封鎖等措施也有助于遏制目前SARS-CoV-2 Delta變異株的爆發(fā)。

盡管快速傳播已是SARS-CoV-2 Delta變異株受世界公認(rèn)的特點(diǎn)，但其發(fā)生機(jī)制仍有爭(zhēng)議。追溯其基因組的突變位點(diǎn)，位于RBD的L452R和T478K突變被認(rèn)為是影響其傳播力的根本因素，因?yàn)楹苡锌赡芡ㄟ^改變RBM對(duì)ACE2受體的親和力來增加病毒感染效率。P681R可能增加靶細(xì)胞膜蛋白對(duì)S1～S2亞基的切割效率。D614G突變則通過提升刺突蛋白R(shí)BD空間靈活性來增加與ACE2受體的結(jié)合可能。總而言之，Delta變異株的刺突蛋白基因突變都指向Delta變異株通過增加與靶細(xì)胞膜的親和力而非改變抗原性來實(shí)現(xiàn)感染力的增強(qiáng)。然而，根據(jù)Zhang等[27]對(duì)全長(zhǎng)刺突蛋白的研究，SARS-CoV-2 Delta變異株對(duì)ACE2低表達(dá)水平細(xì)胞有更明顯的傳播增強(qiáng)效果。反之，對(duì)ACE2受體親和力以及靶細(xì)胞膜蛋白的切割效率均無明顯變化。目前仍需要更多的研究證據(jù)來解釋SARS-CoV-2 Delta變異株的快速傳播特點(diǎn)。

SARS-CoV-2 Delta變異株被列為受關(guān)注變體的另一個(gè)重要原因是其對(duì)中和抗體和血清的免疫逃避。基于L452R突變，單克隆抗體bamlanivimab中和效力降低了1 000倍以上。單克隆抗體imdevimab對(duì)于Delta變異株的中和效力同樣有所降低。然而，擁有完整SARS-CoV-2野生型刺突蛋白結(jié)構(gòu)的mRNA疫苗BNT162b2，以及蛋白質(zhì)亞單位疫苗ZF2001仍對(duì)Delta變異株保有可觀的中和效力，這對(duì)未來的疫苗接種提供了方向。目前，中國(guó)廣泛接種的主流疫苗類型為滅活疫苗。研究表明，滅活SARS-CoV-2疫苗對(duì)Delta變異株感染估計(jì)疫苗有效性較野生株降低了20%，不過根據(jù)世界衛(wèi)生組織設(shè)定的50% 的疫苗有效性最低閾值，接種滅活疫苗對(duì)Delta變異株依然有效[39]。

SARS-CoV-2 Delta變異株感染所致癥狀仍以咳嗽、發(fā)熱為主要表現(xiàn)。這表明，其易感器官及致病作用并未發(fā)生本質(zhì)改變。但是，仍有值得注意的臨床特征。SARS-CoV-2 Delta變異株感染表現(xiàn)出消化道癥狀明顯減少的特征。這提示，COVID-19的胃腸道表現(xiàn)可能并不以ACE2介導(dǎo)的腸粘膜病毒細(xì)胞毒性為主要的發(fā)病機(jī)制。多個(gè)研究表明，相比于SARS-CoV-2野生株，Delta變異株更容易感染青少年及老年人。其中，老年人的易感性與其免疫衰老有關(guān)，尤其是炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生增加[40]。

在全球新型冠狀病毒危機(jī)的大環(huán)境下，Delta變異株以其廣泛的傳播能力成為了全世界都無法忽視的SARS-CoV-2變體。但目前看來，它可能并不是病毒遺傳變異的終點(diǎn)。2021年11月9日，在南非首次被檢測(cè)到的Omicron變體(B.1.1.529菌株)已以毫不遜色于Delta變異株的傳播速度散布于多個(gè)國(guó)家和地區(qū)。面對(duì)SARS-CoV-2 Delta病毒變異株，未來仍需更多研究成果證實(shí)其作用機(jī)制以指導(dǎo)治療與預(yù)防。