黃鍵鋒， 王 瑩， 祝塍軻， 范孝俊， 劉 菲， 李迎澳， 張曉林， 嚴小軍， 廖 智

(浙江海洋大學 海洋科學與技術(shù)學院 海洋生物資源與分子工程實驗室，浙江， 舟山 316022)

近年來，隨著環(huán)境的變化，特別是海水酸化的日益嚴重，貝類養(yǎng)殖業(yè)開始顯現(xiàn)各種問題，包括貝類大規(guī)模死亡[1-3]、疾病爆發(fā)[4]、生長和發(fā)育遲緩[5]等。自工業(yè)革命以來，大氣中二氧化碳濃度已從280 ppm上升到380 ppm，導致海水的平均pH 值已下降了約0.1單位，繼而導致海水中碳酸氫根離子濃度的升高以及碳酸根離子濃度的顯著下降[6]。已知碳酸根離子是生物礦化過程中的關(guān)鍵分子，特別是對于以碳酸鈣作為其生物礦化無機相的物種，例如貝類、珊瑚、藤壺、以及部分藻類等。碳酸根離子濃度的下降將導致其生物礦化速率受到明顯抑制，從而直接影響其生存[7,8]。此外，海洋酸化還會導致貝類貝殼出現(xiàn)溶解速率加快，從而影響貝殼的發(fā)育與形成[9]。

貽貝(Mytilus)是一類全球廣泛性分布且具有重要經(jīng)濟價值的雙殼貝類，因其強繁殖能力、強環(huán)境適應性以及濾食性特征，在自然界能量流動、水質(zhì)保護、環(huán)境監(jiān)測等方面具有重要意義[10,11]。值得注意的是，盡管在實驗室條件下，貽貝也表現(xiàn)出對海水酸化的敏感性[12,13]，但在不同海域的調(diào)查分析中，貽貝通常表現(xiàn)出對于海洋酸化具有較強抗性[14,15]，具體表現(xiàn)為：貽貝貝殼生物礦化速率并未明顯受到海水二氧化碳濃度升高的影響；在食物充足的情況下，海水二氧化碳濃度升高也未降低貽貝的生存率[16]。上述特征導致貽貝成為部分高二氧化碳濃度海域的優(yōu)勢物種[14,16]。由此可見，貽貝貝殼的生物礦化過程對海洋酸化具有較強的耐受性，但這種耐受性的具體機制目前尚不清楚。

近年來，隨著貽貝貝殼蛋白質(zhì)組學研究的深入，從中已鑒定到與貽貝貝殼生物礦化過程直接相關(guān)的部分蛋白質(zhì)，例如碳酸酐酶等[17,18]。此外，在厚殼貽貝中已發(fā)現(xiàn)存在鳥氨酸-尿素循環(huán)途徑(ornithine-urea cycle，OUC)以及脲酶基因[19]。目前已知，碳酸酐酶在貝類貝殼生物礦化過程中與碳酸根的產(chǎn)生以及貝殼的形成具有重要關(guān)聯(lián)[20,21]；而在部分低等生物(例如珊瑚、細菌等)中，脲酶分解尿素所產(chǎn)生的碳酸根也已被證實與其生物礦化直接相關(guān)[22,23]。這一過程的關(guān)鍵步驟在于脲酶催化尿素的降解，產(chǎn)生碳酸和氨，氨的存在導致pH 值上升，進而促進碳酸分解，并為碳酸根離子與鈣離子結(jié)合形成碳酸鈣[24]。值得關(guān)注的是，已證實在細菌中，脲酶和碳酸酐酶通過協(xié)同作用共同促進了生物礦化過程[25]。綜合以上結(jié)論，我們認為，碳酸酐酶和脲酶可能都在貽貝貝殼生物礦化過程中發(fā)揮了重要的碳酸根離子調(diào)控作用，且該作用可能與其對海洋酸化的耐受性具有關(guān)聯(lián)。本文以厚殼貽貝(Mytiluscoruscus)碳酸酐酶和脲酶為研究對象，對其在海水酸化以及殼損傷條件下，2種酶在貽貝生物礦化相關(guān)組織中的表達譜以及酶活力開展分析，以期為了解碳酸酐酶和脲酶與貽貝生物礦化之間的分子關(guān)聯(lián)提供新的科學認知。

1 材料與方法

1.1 厚殼貽貝碳酸酐酶和脲酶的序列分析

厚殼貽貝基因組數(shù)據(jù)目前已公布，其EBI(European Bioinformatics Institute)數(shù)據(jù)庫編號為ERZ1292486[26]；從其基因組數(shù)據(jù)庫中可分別獲得厚殼貽貝碳酸酐酶(CAC5401222.1)和脲酶(CAC5389250.1)基因序列；通過生物信息學手段，對厚殼貽貝碳酸酐酶和脲酶開展序列分析。其中，開放閱讀框采用Lasergene軟件(版本7.0)進行分析；二級結(jié)構(gòu)采用NOVOPRO在線工具的PSIPRED模塊(https://www.novopro.cn/tools/secondary-structure-prediction.html)進行預測；結(jié)構(gòu)域預測采用TBtools(https://github.com/CJ-Chen/TBtools/releases)在線進行。

1.2 熒光定量PCR分析

成年厚殼貽貝采集自浙江舟山嵊泗海域，以潔凈海水暫養(yǎng)于恒溫水族箱中(溫度22 ℃，鹽度25 ‰)。首先，將厚殼貽貝分為2組，其中一組保持殼的完整狀態(tài)，命名為CS(complete shell)組；另一組為殼損傷組，命名為DS(damaged shell)組，參照文獻[27],采用1 mm直徑鉆頭在貝殼上進行鉆孔方式構(gòu)建殼損傷模型貽貝。其中，CS組貽貝分別飼養(yǎng)于正常海水(pH值8.1，命名為CS-NW組，即complete shell in normal water)以及酸化海水(pH值7.3，命名為CS-AW組，即complete shell in acidic water)中。DS組分別飼養(yǎng)于正常海水，酸化海水，以及添加尿素的酸化海水中，分別命名為DS-NW(damaged shell in normal water)組，DS-AW(damaged shell in acidic water)組，以及DS-AW+Ur(damaged shell in acidic water with urea)組。酸化海水參照文獻方法[28]，采用稀鹽酸(1 mol/L)進行調(diào)配，每2 h調(diào)節(jié)1次pH值，使其穩(wěn)定在pH7.3。尿素添加濃度為1 mmol/L。以上5組貽貝在飼養(yǎng)過程中均采用螺旋藻粉作為飼料定時投喂。飼養(yǎng)時間均為5 d。

對上述5組貽貝分別收集其外套膜及血淋巴。其中，血淋巴采用內(nèi)含抗凝劑(Alsever’s Solution, Sigma)的注射器從其后閉殼肌中抽取，抽取后經(jīng)1 000 g,4℃條件下離心10 min，以獲得血細胞。對外套膜和血細胞分別采用柱式RNA抽提試劑盒(上海生工)進行組織總RNA提取，并按照說明書操作；之后采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit, TaKaRa)進行逆轉(zhuǎn)錄；以逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA作為模板進行熒光定量PCR擴增。針對厚殼貽貝碳酸酐酶和脲酶開放閱讀框序列設計特異性引物；以厚殼貽貝EF-1α為內(nèi)參基因；相關(guān)引物序列見Table 1；熒光定量PCR擴增的條件為95 ℃預變性3 min，95 ℃ 20 s，59 ℃ 20 s，72 ℃ 25 s，循環(huán)數(shù)為35，采用3次重復試驗，參照文獻[29]，以最小二乘法(2-ΔΔCt法)處理數(shù)據(jù)并計算相對表達量。

Table 1 Primers sequence for qPCR analysis

1.3 酶活力分析

收集厚殼貽貝外套膜及血細胞后，經(jīng)液氮速凍并研磨成粉末，進一步進行超聲細胞破碎。之后，離心(8 000 g, 4 ℃, 15 min)，上清液分別采用脲酶酶活力測試試劑盒(BC4115，索萊寶)，參照其說明書進行脲酶活力測定；組織碳酸酐酶酶活力測試參照文獻[30]方法進行。

1.4 貝殼內(nèi)表面的顯微觀察

對厚殼貽貝貝殼在正常海水、酸化海水及殼損傷后的貝殼進行內(nèi)表面顯微觀察。貝殼樣品事先以5%氫氧化鈉溶液進行浸泡和超聲，以去除表面附著的污染物和雜質(zhì)；再用去離子水清洗；經(jīng)冷凍干燥后進行顯微觀察。其中，光學顯微鏡采用奧特光學(SZ810，重慶奧特)體式顯微鏡進行觀察；進一步將貝殼樣品經(jīng)噴金處理后，置于掃描電子顯微鏡(SU8010，日立)進行觀察，掃描電壓為20 kV。

1.5 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)采用平均值±方差(mean±SD)展示。采用3次平行試驗。利用 SPSS 25.0軟件包中one-wayANOVA單因素方差檢驗進行統(tǒng)計學分析,P<0.05代表顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 厚殼貽貝碳酸酐酶和脲酶具有不同的序列特征

厚殼貽貝碳酸酐酶基因開放閱讀框長度為975 bp，編碼一條324個氨基酸殘基的前體蛋白質(zhì)；二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果表明，碳酸酐酶的二級結(jié)構(gòu)含有21.60%的α-螺旋，23.15%的完全伸展區(qū)，以及5.86%的β-轉(zhuǎn)角(Fig.1)；碳酸酐酶序列中含有典型的信號肽序列(1～21號殘基)，表明厚殼貽貝碳酸酐酶可能是一種分泌蛋白質(zhì)。此外，碳酸酐酶序列中含有1個典型的碳酸酐酶結(jié)構(gòu)域(carbonic anhydrase domain)，位于第26～278號殘基(Fig.2)。厚殼貽貝脲酶基因開放閱讀框長度為2 478 bp，編碼一條由825個氨基酸殘基組成的前體蛋白質(zhì)；二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果表明，脲酶序列中含有33.09% 的α-螺旋以及19.88% 的完全伸展區(qū)(Fig.1)；其序列中具有真核生物脲酶所具有的典型5種結(jié)構(gòu)域，包括Urease_alpha、beta和gamma結(jié)構(gòu)域，以及2個酰胺水解酶結(jié)構(gòu)域(amidohydro_1和3)(Fig.2)。

Fig.1 The predicted secondary structure of carbonic anhydrase and urease The secondary structure was predicted by PSIPRED of NOVOPRO (https://www.novopro.cn/tools/secondary-structure-prediction.html). Red spiral line represents α-helix, and blue arrow represents the extension region

Fig.2 Domain prediction of carbonic anhydrase (CA) and urease (URE) of M.coruscus The domain was predicted by TBtools (https://github.com/CJ-Chen/TBtools/releases). Carbonic anhydrase (CA) contains two domains including signal peptide and Carb_anhydrase domain; Urease (URE) contains five domains: urease_gamma, urease_beta, urease_alpha, amidohydro_1 and amidohydro_3

2.2 海水酸化及殼損傷均明顯影響厚殼貽貝脲酶和碳酸酐酶的表達量

采用熒光定量PCR技術(shù)，以CS-NW組為對照，對不同條件處理后的貽貝開展外套膜和血細胞組織中脲酶和碳酸酐酶的基因相對表達量分析，結(jié)果見Fig.3和Fig.4。由圖可見，在正常海水中，殼損傷后的厚殼貽貝(DS-NW組)外套膜組織的脲酶基因的相對表達量在1～2 d中，未出現(xiàn)明顯變化(P>0.05)，但是，在第3 d，其相對表達量明顯上調(diào)(P<0.05)，隨后在第4和第5 d恢復正常水平(Fig 3A)；而在酸化海水中，CS-AW組貽貝外套膜中的脲酶基因在第1 d出現(xiàn)明顯上調(diào)(P<0.05)，但是在第3 d出現(xiàn)明顯下調(diào)(P<0.05)，隨后至第4和第5 d又出現(xiàn)明顯上調(diào)，呈現(xiàn)出波動特征(Fig.3A)；在DS-AW組中，脲酶基因的相對表達量在第1至第5 d均呈明顯下調(diào)狀態(tài)(P<0.05)(Fig.3A)；添加尿素后的DS-AW+Ur組中，脲酶的表達量則在第3 d出現(xiàn)明顯上調(diào)(Fig.3A)。碳酸酐酶則表現(xiàn)出與脲酶明顯不同的表達量變化。結(jié)果如Fig.3B所示，相比于對照組，殼損傷貽貝在正常海水中(DS-NW組)，其外套膜碳酸酐酶的相對表達量呈現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)狀態(tài)，即在第1到第3 d呈現(xiàn)明顯上調(diào)(P<0.05)，而在第5 d出現(xiàn)明顯下調(diào)；在CS-AW組中，碳酸酐酶的相對表達量同樣出現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)的變化特征；在DS-AW組中，與對照組相比，外套膜中碳酸酐酶的相對表達量在第3至第5 d出現(xiàn)明顯下調(diào)(P<0.05)，表明酸化對碳酸酐酶的表達具有抑制作用；而在添加尿素后的DS-AW+Ur組中，外套膜碳酸酐酶的相對表達量也呈現(xiàn)出先上調(diào)后下調(diào)狀態(tài)(Fig.3B)。

Fig.3 The log2 fold change of expression level of urease and carbonic anhydrase gene in mantle (A) The log2 fold change of relative expression level of urease in mantle of Mytilus coruscus; (B) The log2 fold change of relative expression level of carbonic anhydrase in mantle of Mytilus coruscus. M. coruscus’ mantle was collected respectively at post induction of 1, 2, 3, 4 and 5 days under different treating conditions: DS-NW, CS-AW, DS-AW, DS-AW+Ur. The relative expression levels of two genes were calculated by 2-△△Ct method and presented as mean ± SD (n=3). The statistical analysis of differences was performed by SPSS (v25. 0) with one-way ANOVA followed by Tukey’s multiple range test.* and ** represent the significance with P<0.05 and P<0.01, respectively, compared with that of control. DS-NW represents damaged shell in normal sea water; CS-AW represents complete shells in acidic sea water; DS-AW represents damaged shells in acidic sea water; DS-AW+Ur represents damaged shells in acidic sea water with urea

在血細胞中，與對照組相比，殼損傷以及海水酸化條件均明顯抑制了脲酶基因的相對表達量，導致脲酶基因的相對表達量呈現(xiàn)明顯下調(diào)；但是在酸化海水中，CS-AW組血細胞的脲酶基因在第4 d出現(xiàn)明顯上調(diào)(Fig.4A)。此外，如Fig.4B所示，與對照組相比，血細胞中碳酸酐酶的相對表達量在DS-NW組中在第1至第5 d中均呈現(xiàn)明顯上調(diào)趨勢(P<0.05)；在CS-AW組中，碳酸酐酶的相對表達量與對照組相比在第1 d出現(xiàn)明顯下調(diào)(P<0.05)，但是在第2至第4 d明顯上調(diào)(P<0.05)；在DS-AW組中，碳酸酐酶的相對表達量與對照組相比呈現(xiàn)逐漸上調(diào)趨勢，在第5 d達到峰值；而在DS-AW+Ur組中，尿素的添加促進了血細胞中碳酸酐酶的相對表達量出現(xiàn)明顯上調(diào)趨勢(P<0.05)。

Fig.4 The log2 fold change of expression level of urease and carbonic anhydrase gene in hemocyte (A) The log2 fold change of relative expression level of urease in hemocyte of Mytilus coruscus; (B) The log2 fold change of relative expression level of carbonic anhydrase in hemocyte of Mytilus coruscus. M. coruscus’ mantle was collected respectively at post induction of 1, 2, 3, 4 and 5 days under different treating conditions: DS-NW, CS-AW, DS-AW, DS-AW+Ur. The relative expression levels of two genes were calculated by 2-△△Ct method and presented as mean ± SD (n=3). The statistical analysis of differences was performed by SPSS (v25. 0) with one-way ANOVA followed by Tukey’ s multiple range test.* and **represent the significance with P<0. 05 and P<0. 01, respectively, compared with that of control. DS-NW represents damaged shell in normal sea water; CS-AW represents complete shells in acidic sea water; DS-AW represents damaged shells in acidic sea water; DS-AW+Ur represents damaged shells in acidic sea water with urea

2.3 海水酸化及殼損傷明顯影響厚殼貽貝脲酶和碳酸酐酶的酶活力

進一步采用相同的處理條件，分析了脲酶和碳酸酐酶在外套膜和血細胞中的活力變化，結(jié)果如Table 2和Table 3所示。在正常海水中，與對照組(CS-NW)相比，殼損傷后的厚殼貽貝外套膜組織中，其脲酶活性并無明顯變化(P>0.05)；但在酸化海水中，CS-AW組貽貝外套膜組織中的脲酶活力相比對照組出現(xiàn)明顯上升(P<0.05)，在第5 d達到峰值；而在DS-AW組中，外套膜組織中的脲酶活力相比對照組僅在第1 d出現(xiàn)輕微上升(P<0.05)；在添加尿素的DS-AW+Ur組中，外套膜組織中的脲酶活力相比對照組在第3 d出現(xiàn)下降，但在第5 d出現(xiàn)了明顯上升(P<0.05)(Table 2)。對碳酸酐酶而言，其酶活力值相比對照組，在DS-NW組中主要呈現(xiàn)下降趨勢，特別是在第2和第5 d，外套膜中碳酸酐酶活力相比對照組明顯下降(P<0.05)；但是在酸化海水中，CS-AW組外套膜中的碳酸酐酶活力呈現(xiàn)明顯上升趨勢，其峰值出現(xiàn)在第1 d(P<0.05)；在DS-AW組中，外套膜中碳酸酐酶活力相比對照組(CS-NW)多呈下降趨勢，且在第2 d下降幅度為最大(P<0.05)；而在添加尿素后的DS-AW+Ur組中，外套膜中碳酸酐酶活力相比對照組在第2 d出現(xiàn)明顯上升(Table 2)。

Table 2 Urease (UA) and carbonic anhydrase (CA) activity in mantle

Table 3 Urease (UA) and carbonic anhydrase (CA) activity in hemocyte

在血細胞中，與對照組相比，脲酶活力在DS-NW組中主要在第4 d出現(xiàn)明顯下降(P<0.05)；在CS-AW組中，脲酶活力在第4 d呈明顯下降趨勢(P<0.05)；在DS-AW組中，脲酶活力則同樣在第4和第5 d出現(xiàn)明顯下降(P<0.05)；而在添加尿素的DS-AW+Ur組中，脲酶活力在第2 d出現(xiàn)明顯上升(P<0.05)，隨后在第4和第5 d中出現(xiàn)明顯下降(P<0.05)(Table 3)。此外，血細胞中碳酸酐酶的活力在各實驗組中呈現(xiàn)與外套膜中不一樣的變化特征。其中，在DS-NW組中，血細胞碳酸酐酶的酶活力相比對照組在第1 d和第3 d(P<0.05)有輕微上升；在CS-AW組中，血細胞碳酸酐酶的酶活力相比對照組在第1 d有輕微上升(P<0.05)，但隨后在第3和第4 d出現(xiàn)明顯下降(P<0.05)；在DS-AW組中，碳酸酐酶活力變化呈現(xiàn)與CS-AW組類似的趨勢，即先上升后下降模式；而在DS-AW+Ur組中，尿素的添加促使血細胞中碳酸酐酶的酶活力在第4和第5 d呈現(xiàn)明顯上升趨勢(P<0.05)(Table 3)。

2.4 海水酸化及殼損傷對厚殼貽貝貝殼表面微觀結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響

首先，采用光學顯微鏡對3組殼損傷5 d后的厚貽貝貝殼損傷部位進行觀察，設置了3組平行樣品，結(jié)果見Fig.5。由圖可見，經(jīng)打孔方式構(gòu)建的殼損傷模型的貽貝，正常海水中飼養(yǎng)5 d(DS-NW組)，其貝殼內(nèi)表面在其打孔部位可觀察到一圈白色質(zhì)地的表面結(jié)構(gòu)；而在酸化海水中(DS-AW組)，該白色表面層不明顯；但在添加尿素后，即DS-AW+Ur組中，其貝殼內(nèi)表面打孔部位附近重新出現(xiàn)了白色表面層(Fig.5)。

Fig.5 The photos of light microscopy observation of the inner surface around damaged shell After shell damage, mussels were fed in normal sea water (DS-NW), acidic sea water (DS-AW) and acidic sea water with urea (DS-AW+Ur), respectively. 5 days later, the shell inner surface was observed with light microscopy. The white layer newly formed in DS-AW+Ur group was denoted by a black arrow. The test was repeated three times, and the scale bar is 1 000 μm for each photo

進一步采用掃描電鏡對白色表面層進行觀察，結(jié)果見Fig.6。由圖可見，在正常海水中飼養(yǎng)且殼正常的貽貝(即CS-NW組)，其貝殼內(nèi)表面呈現(xiàn)出方格狀紋理結(jié)構(gòu)(Fig.6A)；而在酸化海水中的貽貝(CS-AW組)貝殼內(nèi)表面，未見方格狀紋理結(jié)構(gòu)(Fig.6B)；打孔后且飼養(yǎng)于正常海水中的貽貝(DS-NW組)，其貝殼內(nèi)表面在打孔部位附近出現(xiàn)波浪狀的紋理結(jié)構(gòu)(Fig.6C)；而打孔后且飼養(yǎng)于酸化海水中的貽貝，其貝殼內(nèi)表面打孔部位附近，其波浪狀紋理結(jié)構(gòu)不明顯(Fig.6D)；而在海水中添加尿素后的DS-AW+Ur組貽貝中，其打孔部位的貝殼內(nèi)表面出現(xiàn)類似于DS-NW組中的波浪狀紋理結(jié)構(gòu)(Fig.6E)。

Fig.6 SEM observations of the shell inner surface from mussel with complete or damaged shell in normal or acidic sea water CS-NW: surface of complete shell in normal seawater; CS-AW: surface of complete shell in acidic sea water; DS-NW: surface of damaged shell in normal water; DS-AW: surface of damaged shell in acid water; DS-AW+Ur: surface of damaged shell in acidic water with 1mmol/Lurea

3 討論

貝類的生物礦化不僅賦予了貝類具有重要保護意義的貝殼組織，其礦化過程涉及的分子機制也成為當前針對貝殼的仿生學和材料學研究的重要領(lǐng)域。目前，海洋酸化已對貝類的生存帶來重大影響，其影響機制包括降低海水中碳酸根離子的濃度[3]，加速貝殼中碳酸鈣晶體的溶解速度[9, 31]，以及改變貝殼中碳酸鈣晶體晶型[32]等。海水中的碳酸根離子是貝殼形成的無機碳來源，主要包括外源性碳酸根(例如海水中溶解的碳酸根)，以及內(nèi)在的碳酸根(通過代謝產(chǎn)生的碳酸根離子)[33]。對貝類而言，其生物礦化是一個極為復雜的合成過程。目前，已發(fā)現(xiàn)海洋酸化會對貝類的多種代謝途徑產(chǎn)生明顯的影響[34]。其中，碳酸酐酶負責貝類生物礦化過程中碳酸根離子的調(diào)節(jié)，因而被認為是生物礦化過程中最重要的蛋白質(zhì)之一[35]。此外，脲酶也是一種生物礦化相關(guān)蛋白質(zhì)，但主要在微生物以及部分藻類中被發(fā)現(xiàn)具有生物礦化輔助作用[36]，而在軟體動物中尚不清楚脲酶對生物礦化的貢獻。本文的研究結(jié)果顯示，首先注意到脲酶和碳酸酐酶在貽貝外套膜和血細胞中，和在殼損傷與海水酸化等不同處理條件下，其基因表達量和酶活力變化呈現(xiàn)較為復雜的變化特征，體現(xiàn)出脲酶和碳酸酐酶在貽貝生物礦化過程中，具有較為復雜的組織特異性和生理過程的特異性。

在正常海水中，殼損傷處理對外套膜中的脲酶和碳酸酐酶的基因表達量均表現(xiàn)出明顯的激活作用，特別是脲酶基因表達量呈現(xiàn)持續(xù)上調(diào)的趨勢。表明脲酶和碳酸酐酶可能在外套膜中均參與了殼損傷的修復過程。酶活力的測試結(jié)果雖然也表現(xiàn)出類似的變化趨勢，但相比對照組，差異不明顯。可能的原因在于從基因到成熟蛋白質(zhì)發(fā)揮功能，需要經(jīng)歷轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯以及翻譯后修飾等一系列復雜過程，因而基因表達量的測試結(jié)果和酶活測試結(jié)果存在不完全對應的現(xiàn)象。此外，在前期研究中，已發(fā)現(xiàn)厚殼貽貝各組織中均存在較高濃度的尿素分子，且穩(wěn)定性同位素標記檢測證實了尿素的碳元素可轉(zhuǎn)移至貝殼，但存在一定的飽和性，表明尿素分子在一定程度上參與了貝殼的形成[19]。本文研究結(jié)果進一步表明，外套膜中的脲酶基因表達量在殼損傷后明顯上升，推測其可通過催化尿素的分解產(chǎn)生碳酸根離子，從而參與了殼損傷的修復，但具體機制仍有待進一步研究。而在血細胞中，正常海水中的殼損傷同樣誘導了碳酸酐酶的表達量明顯上調(diào)，但脲酶基因表達受到抑制；酶活力測試數(shù)據(jù)也得到了類似結(jié)果。從整體水平呈現(xiàn)出碳酸酐酶活力呈上升趨勢，而脲酶活僅在第2 d出現(xiàn)上升，之后呈現(xiàn)明顯下降趨勢。這表明，貽貝血細胞可能主要通過碳酸酐酶參與了正常海水條件下的貝殼損傷的修復。目前，已知貝殼的修復與貝殼的生長具有不同的生物礦化機制[37]。盡管此前外套膜被認為是貝類貝殼生長和修復的主要組織，但貝類血細胞在貝殼修復過程中的作用也已被證實[38]。本文數(shù)據(jù)表明，貽貝貝殼損傷的修復中，外套膜中的脲酶以及血細胞中的碳酸酐酶可能分別發(fā)揮了不同的作用。

而在貝殼完整的情況下，海水酸化可誘導外套膜組織中的脲酶和碳酸酐酶的基因表達量均出現(xiàn)上調(diào)趨勢，且脲酶和碳酸酐酶活力也呈現(xiàn)類似的上升趨勢?？紤]到脲酶對尿素的分解作用所產(chǎn)生氨可導致局部的堿性環(huán)境[24]，以及碳酸酐酶對二氧化碳的調(diào)控作用[35]，脲酶和碳酸酐酶的基因表達量在酸化條件下有明顯上調(diào)，意味著2種酶可能均在貽貝對抗海水酸化的過程中發(fā)揮了重要作用。值得關(guān)注的是，碳酸酐酶不僅是貝殼生物礦化過程中的關(guān)鍵酶之一，目前也是衡量海水酸化對生物礦化抑制作用的主要靶標分子[20]，但其表達量在不同物種中呈現(xiàn)不同的特征。例如，在珊瑚的生物礦化研究中，發(fā)現(xiàn)海水酸化能強烈抑制碳酸酐酶基因的表達和酶活性[39]。而在已適應海洋酸化的物種，例如牡蠣中，其碳酸酐酶的表達量則不受影響[34]。而本文研究中，貽貝碳酸酐酶和脲酶的基因表達量在酸化條件下，均表現(xiàn)出上調(diào)，表明貽貝可能通過脲酶和碳酸酐酶來產(chǎn)生對海洋酸化的適應，這可能是貽貝對抗海洋酸化的一種耐受性機制。另外，酸化疊加殼損傷處理，導致貽貝外套膜的脲酶和碳酸酐酶以及血細胞中的脲酶基因表達量均呈下調(diào)狀態(tài)，其酶活性也呈現(xiàn)類似特征，表明海水酸化可能抑制了貽貝外套膜對殼損傷的修復。但同樣條件下，血細胞中碳酸酐酶表達量卻呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，其酶活力也在第1 d明顯上升。一方面，表明血細胞中碳酸酐酶可能參與了酸化海水條件下的二氧化碳調(diào)節(jié)，另一方面，也表明血細胞中的碳酸酐酶可能參與了酸化條件下對于殼損傷的修復。但上述推測尚需進一步的研究。

本文進一步的研究表明，酸化海水中添加尿素可誘導殼損傷后貽貝外套膜中的脲酶和碳酸酐酶的基因表達量的明顯上調(diào)，但呈現(xiàn)不同的波動特征。而在血細胞中，同樣條件下，碳酸酐酶的基因表達量受尿素誘導也明顯上調(diào)，但脲酶的表達量與添加尿素前相比未受影響。上述結(jié)果表明，尿素在外套膜和血細胞中對于在酸化條件下的殼損傷修復具有不同的激活機制。對外套膜而言，尿素添加可能通過激活脲酶和碳酸酐酶參與酸化海水中殼損傷的修復，而在血細胞中，尿素可能僅通過激活碳酸酐酶來參與貝殼在酸化海水中的修復。

貝殼顯微觀察結(jié)果也初步證實，酸化對貝殼損傷的抑制以及尿素在酸化海水中對貝殼損傷過程的激活作用。光學顯微鏡的結(jié)果顯示，貝殼打孔后在正常海水和酸化海水中，在打孔部位附近的紋理質(zhì)地有明顯區(qū)別。在正常海水中，打孔部位附近的白色質(zhì)地層，可視為貽貝在殼損傷后，在其損傷部位出現(xiàn)的修復層。該修復層主要涉及貝殼內(nèi)表面的有機質(zhì)膜。該有機質(zhì)膜已被證實與貝殼的形成有關(guān)[40]。而在掃描電鏡觀察中，正常貝殼在正常海水和酸化海水中表現(xiàn)出不同的表面結(jié)構(gòu)，在酸化海水中，其貝殼內(nèi)表面出現(xiàn)不規(guī)則片狀結(jié)構(gòu)，推測是無定型碳酸鈣晶體(amorphous calcium carbonate，ACC)。已有文獻報道，海水酸化會導致貝殼的碳酸鈣晶體從有序向無序狀態(tài)改變，從而導致ACC增加[32]。此外，打孔部位的白色修復層在掃描電鏡觀察中表現(xiàn)為較為規(guī)則的波浪狀結(jié)構(gòu)，而在酸化海水中，相同部位未出現(xiàn)規(guī)則波浪狀結(jié)構(gòu)。但是尿素的添加會誘導該結(jié)構(gòu)重新出現(xiàn)，表明尿素對于在酸化海水條件下的貝殼修復具有某種激活作用。

通過以上研究，本文初步得出以下結(jié)論：脲酶與碳酸酐酶均在貽貝貝殼的損傷修復以及對海洋酸化的適應性方面具有重要作用，但兩者在不同組織以及不同處理條件下，其基因表達量和酶活性有著不同的響應過程。盡管其具體過程和分子機制尚不明確，但根據(jù)已有文獻報道，在巨大芽孢桿菌的生物礦化過程中，脲酶和碳酸酐酶已被證實存在協(xié)同作用[25]。但該研究基于的證據(jù)是體外實驗，其協(xié)同作用的機制推測為脲酶催化尿素形成堿性環(huán)境，該堿性環(huán)境進一步促使碳酸酐酶分解碳酸產(chǎn)生的碳酸氫根轉(zhuǎn)化為碳酸根離子。本文的結(jié)果表明，脲酶和碳酸酐酶僅在外套膜中表現(xiàn)出不同實驗條件下具有響應同步性，但在血細胞中并無這一趨勢，推測有較為復雜的調(diào)控機制。此外，貽貝的生物礦化過程對海洋酸化的耐受性必然有其內(nèi)在機制，而脲酶和碳酸酐酶很可能是貽貝對酸化耐受的關(guān)鍵分子；此外，尿素對于貽貝貝殼的殼損傷修復具有促進作用，而該作用很可能與脲酶有關(guān)，其機制類似于細菌中脲酶參與生物礦化的機制。

致謝感謝浙江大學電鏡中心宋丹丹老師在掃描電鏡觀察中的幫助。