李瑋浩 溫豐標(biāo) 崔廣暉

食管癌作為全世界范圍內(nèi)具有很高發(fā)病率且患者通常預(yù)后較差的癌癥之一，而我國(guó)食管癌人數(shù)約占全球數(shù)量的一半，特別是在河北等地區(qū)的發(fā)病率最高。盡管的斷食管癌及后期治療在臨床上取得了不錯(cuò)的進(jìn)展，但多數(shù)患者治療后的預(yù)期并不能讓人滿意。檢測(cè)食管上脫落的細(xì)胞是篩查食管癌額重要手段之一，但因其具有一定的創(chuàng)傷性，無(wú)法在廣大人群篩選使用。尋找穩(wěn)定、可靠且無(wú)創(chuàng)的早期篩查指標(biāo)已成為食管癌診療中亟待攻克的難題之一。

微小RNA(microRNA，miR)是一類長(zhǎng)度約為22核苷酸的非編碼RNA，通過(guò)調(diào)控并參與人體的各個(gè)生理及病理相關(guān)過(guò)程，并與腫瘤的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[1-2]。近年有報(bào)道指出miR-148b參與多個(gè)消化道腫瘤發(fā)生、發(fā)展，如肝癌患者體內(nèi)miR-148b存在異常表達(dá)，且與肝癌的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲等過(guò)程密切相關(guān)[3]。癌胚抗原(CEA)是一個(gè)較廣譜的腫瘤標(biāo)志物，已被證實(shí)在食管癌中有異常表達(dá)?；|(zhì)金屬蛋白酶-1(MMP-1)作為人體中的水解細(xì)胞外基質(zhì)的酶，參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移等過(guò)程[4]。馬新義等[5]指出，MMP-1蛋白水平在食管鱗狀類細(xì)胞癌中高，且MMP-1水平與食管鱗狀類細(xì)胞癌的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期相關(guān)，可作為判斷食管鱗狀細(xì)胞癌惡性生物學(xué)行為的重要參考指標(biāo)。本研究通過(guò)對(duì)比健康人群與食管癌體內(nèi)的miR-148b、MMP-1與CEA水平差異，分析這些指標(biāo)和食管癌臨床病理特征間的關(guān)系及在食管癌的臨床價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2018年6月至20121年6月治療的90例食管癌患者為觀察組，男女比例為58∶32，平均年齡在(52.2±4.3)歲；食管癌位置中上段為15例，中段為52例，下段為23例；食管癌中20例為早期患者，70例為中晚期患者；78例為鱗癌，7例為腺鱗癌，5例為腺癌；16例為低分化,64例為中分化，10例為高分化。患者全部是第一次住院并經(jīng)過(guò)內(nèi)鏡確診。依據(jù)患者的病理學(xué)資料評(píng)估其食管癌具體的分化情況，分期則依據(jù)患者的影像學(xué)檢查、臨床特點(diǎn)和內(nèi)鏡下結(jié)果予以判斷。對(duì)照組為同期在我院實(shí)施體檢的100例健康成年人，男女比例為62∶38，平均年齡在(52.9±3.8)歲。全部的對(duì)象均排除其他臟器惡性腫瘤，合并糖尿病，伴有自身免疫性疾病或心腦血管疾病。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 資料采集與樣本檢測(cè)

由專業(yè)研究人員對(duì)受試者性別、年齡等一般信息進(jìn)行記錄。受試者在入院當(dāng)天由專業(yè)的護(hù)士采用抗凝管采集10 ml靜脈血，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)方式測(cè)定血漿中的miR-148b和GAPDH內(nèi)參基因濃度；操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)實(shí)行，反應(yīng)總體系為：20 μl，其中上下游的引物均為0.8 μl，Mix 10 μl，cDNA為 2 μl，最后添加6.4 μl DEPC。循環(huán)條件設(shè)置為：95 ℃條件下5 min變性；接下來(lái)進(jìn)行45個(gè)循環(huán)(95 ℃條件下30 s，60 ℃條件下30 s，72 ℃條件下30 s)，每組增加復(fù)孔3個(gè)。檢測(cè)過(guò)程中所用引物序列如下：miR-148b上游引物：5'-TACAACCACTGCACTACCTG-3'，下游引物：5'-TGGAATGCTTGAAGGCTGCT-3'；GAPDH 上游引物：5'-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3'，下游引物：5'-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3'。 采用2-ΔΔCt法將miR-148b相對(duì)的表達(dá)量計(jì)算出來(lái)，△Ct值=樣本和內(nèi)參基因的Ct值之差。

應(yīng)用化學(xué)發(fā)光法和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定MMP-1、CEA 的濃度，其中CEA為化學(xué)發(fā)光法(上海百蕊生物科技有限公司)；腫瘤的高、低值質(zhì)控品則購(gòu)自英國(guó)朗道公司，質(zhì)控的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)則依據(jù)Westgard分析。

MMP-1為酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定。全部標(biāo)本稀釋100倍后分別加入微孔板，然后加抗體在室溫情況下予以40 min孵育(分別加10 pg/mL、50 pg/mL、100 pg/mL濃度的3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品以及陽(yáng)、陰性對(duì)照)，5次洗板后，在避光情況下加具有酶標(biāo)記的單抗在室溫情況下40 min孵育，接下來(lái)5次洗板，加入底物等待15民的反應(yīng)后在終止，于Nanodrop ND 2000型分析儀(購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾公司)分析吸光值(A)。

分別計(jì)算血漿miR-148b、MMP-1和CEA的批內(nèi)、批間變異系數(shù)(CV)情況，用以判定本次操作的精確度及重復(fù)性。

1.3 試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中用到的儀器以及試劑由：H-1850R型的4 ℃離心機(jī)(購(gòu)自中國(guó)湘儀集團(tuán))；C1000型的RT-qPCR儀(購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)： 16072513，中國(guó)Takara公司)；提取血漿RNA的試劑盒(批號(hào)：BC1814115OA，購(gòu)自中國(guó)Bioteke公司)；RSV1型的PCR儀(購(gòu)自美國(guó) Bio-Rad公司)；SYBR Green Mixture(批號(hào)：MIC102608，中國(guó)康為世紀(jì)公司)；UniCel DxI 800型的生化分析儀(購(gòu)自美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 兩組血清miR-148b、MMP-1與CEA表達(dá)水平對(duì)比

觀察組與對(duì)照組間的性別、年齡、吸煙史等均無(wú)差異(P>0.05)。觀察組血清miR-148b、CEA和MMP-1水平均較對(duì)照組高，且差異明顯(P<0.05)，見(jiàn)表1。血清miR-148b、CEA和MMP-1檢測(cè)的批內(nèi)CV值是3.7%、2.9%和4.5%，批間CV值是3.9%、3.3%和4.6%，均小于5%，表明本次操作的精確度、重復(fù)性較好。

表1 兩組一般資料及血清miR-148b、CEA與MMP-1水平比較

2.2 miR-148b、CEA與MMP-1水平與食管癌臨床病理特點(diǎn)的關(guān)系

食管癌血漿miR-148b與MMP-1水平與其分化程度、分期和組織學(xué)類型呈明顯相關(guān)性(P<0.05)。且miR-148b與MMP-1水平在食管腺鱗癌、中晚期食管癌和低分化患者中上升最明顯，而血漿CEA與食管癌分化程度、分期和組織學(xué)類型無(wú)關(guān)(P>0.05)。此外三者與食管癌患者的性別、年齡、飲酒史等均無(wú)相關(guān)性(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 血漿miR-148b、CEA與MMP-1水平與食管癌臨床病理特征的關(guān)系

2.3 血漿miR-148b、CEA與MMP-1水平對(duì)食管癌的鑒別診斷

ROC曲線結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血漿miR-148b、CEA與MMP-1在區(qū)分食管癌與非食管癌的AUC分別是0.890(95% CI：0.852～ 0.921，P<0.001)、0.654(95% CI：0.504～ 0.807，P=0.012)和0.814(95% CI：0.742～0.908，P<0.001)；而各個(gè)指標(biāo)的約登指數(shù)處于最大值時(shí)所對(duì)應(yīng)的特異度和靈敏度是：84.0%/83.2%、80.3%/32.5%和82.1%/77.6%；診斷界值是16.4、6.3 ng/ml和24.8 pg/ml。當(dāng)聯(lián)合miR-148b、CEA與MMP-1時(shí)，logistics回歸將上述miR-148b、CEA與MMP-1這3個(gè)指標(biāo)擬合后得到變量-“PRE-1值”，并帶入ROC曲線分析，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合3種指標(biāo)在區(qū)分食管癌與非食管癌的AUC為0.902(95% CI：0.850～0.964，P<0.001)，靈敏度為81.1%，特異度為92.4%，見(jiàn)圖1。

圖1 miR-148b、CEA與MMP-1對(duì)食管癌的鑒別診斷

2.4 miR-148b、CEA與MMP-1水平對(duì)食管癌風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)價(jià)值

單因素分析發(fā)現(xiàn)，高miR-148b、CEA與MMP-1水平是造成食管癌的危險(xiǎn)因素。多因素結(jié)果顯示，在校正年齡、性別、飲酒、吸煙等因素影響后，高miR-148b與MMP-1水平仍是誘發(fā)食管癌的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，見(jiàn)表3。

表3 血漿miR-148b、CEA與MMP-1水平對(duì)食管癌風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)價(jià)值

3 討論

食管癌作為全世界范圍內(nèi)比較常見(jiàn)的上消化系統(tǒng)惡性腫瘤，極大地威脅了全球人民的的健康。生物敏感標(biāo)志物作為尿液、血液及組織中可以用于診斷早期疾病情況的指標(biāo)，具有操作便捷、創(chuàng)傷小、成本低等優(yōu)勢(shì)，可診斷并評(píng)估疾病具體情況[6-7]。其在人體中的濃度改變情況可以判斷疾病具體進(jìn)展，最好的情況下，生物敏感標(biāo)志物需要有較高的診斷早期腫瘤的敏感性及特異性，其在非腫瘤組織中濃度并不上升。顯然，挑選更多高價(jià)值的生物敏感標(biāo)志物是目前臨床診斷食管癌的熱點(diǎn)，對(duì)早期診斷并針對(duì)性治療食管癌意義重大。

CEA是食管癌的輔助診斷指標(biāo)之一，對(duì)食管癌的早期診斷有一定價(jià)值。ukaszewicz等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，利用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清CEA在區(qū)分食管癌患者與健康人群中的敏感性/特異性分別為17.0%/93.0%，提示血清CEA對(duì)于食管癌診斷敏感性較低。在本次研究中，CEA區(qū)分食管癌及健康人群的敏感性/特異性分別是32.5%/80.3%，敏感性較低，與之前的報(bào)道基本一致[8]。但CEA作為食管癌診斷的傳統(tǒng)指標(biāo)，尚存在敏感性不足的問(wèn)題。

miR是新型和基因調(diào)控相關(guān)的因子，能在轉(zhuǎn)錄后將靶基因具體表達(dá)過(guò)程以及蛋白質(zhì)的翻譯過(guò)程抑制，已被證明了在胃癌[9]和神經(jīng)膠質(zhì)瘤[10]等多種腫瘤中存在異常表達(dá)。miR-148b是近年研究發(fā)現(xiàn)的重要的原癌基因。高表達(dá)的miR-148b通過(guò)對(duì)直接靶基因如抑癌基因ROCK1轉(zhuǎn)錄結(jié)束后可以負(fù)性調(diào)控并抑制癌細(xì)胞凋亡，加速細(xì)胞的增殖和遷移[3]。Chen等[3]通過(guò)體外培養(yǎng)肝癌細(xì)胞并經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染含有si-miR-148b的質(zhì)粒，下調(diào)肝癌細(xì)胞中miR-148b的表達(dá)水平，觀察到下調(diào)miR-148b可顯著降低肝癌細(xì)胞遷移能力。然而，關(guān)于miR-148b在食管癌中的機(jī)制研究尚未見(jiàn)報(bào)道。在本次研究中，我們發(fā)現(xiàn)血漿miR-148b在食管癌患者中水平顯著高于健康女性，且在食管腺鱗癌、中晚期食管癌和低分化食管癌患者中上升最明顯，本次研究結(jié)果通過(guò)大樣本量的檢測(cè)對(duì)前期基礎(chǔ)研究結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證，證實(shí)血漿miR-148b的異常表達(dá)在食管癌早期鑒別診斷及疾病進(jìn)展程度具有一定價(jià)值。

國(guó)內(nèi)外近年來(lái)很多的研究均證實(shí)了血漿中的MMP-1在腫瘤的微環(huán)境重塑、加速腫瘤細(xì)胞向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和診斷并治療腫瘤中具有很高的應(yīng)用價(jià)值[11-12]。早前的相關(guān)報(bào)道指出，胃癌患者血漿內(nèi)的MMP-1基因表達(dá)相較于健康人群明顯上升，并濃度增加的MMP-1和胃癌細(xì)胞向遠(yuǎn)處的轉(zhuǎn)移相關(guān)[11]。Benson等[12]研究亦發(fā)現(xiàn)癌組織內(nèi)的MMP-1基因較癌旁組織的表達(dá)更高。這些研究都證實(shí)了MMP-1調(diào)控腫瘤發(fā)生和發(fā)展。本研究試我們第一次利用大樣本檢測(cè)食管癌患者血漿內(nèi)的MMP-1表達(dá)差異大，且食管腺鱗癌、中晚期食管癌與低分化食管癌患者中的血漿MMP-1濃度上升最多，與前期的試驗(yàn)相互對(duì)應(yīng)[11-12]。

ROC曲線分析顯示，血漿miR-148b與MMP-1在區(qū)分子食管癌與對(duì)照組的靈敏度/特異度分別為83.2%/84.0%和77.6%/82.1%，均高于單獨(dú)應(yīng)用CEA；而聯(lián)合miR-148b、CEA與MMP-1在區(qū)分食管癌和對(duì)照組特異度明顯上升，達(dá)到92.4%，提示聯(lián)合應(yīng)用血漿miR-148b、CEA與MMP-1在食管癌鑒別診斷中具有較高價(jià)值。Logistic回歸多因素分析顯示，在校正性別、年齡、飲酒、吸煙等因素影響后，血漿高miR-148b和高M(jìn)MP-1水平仍是食管癌發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。然而，本次研究仍有如下不足：(1)本次研究納入的患者均挑選自本院，過(guò)于集中的患者來(lái)源可能會(huì)對(duì)本次研究結(jié)果產(chǎn)生了偏倚的影響，今后可以從多中心的隊(duì)列進(jìn)一步驗(yàn)證相關(guān)的結(jié)果；(2)本研究納入90例食管癌患者，納入病例的數(shù)目仍然存在一定的限的，后期需要增加更多的樣本量進(jìn)行研究證實(shí)血漿miR-148b、CEA與MMP-1在我國(guó)食管癌患者中的臨床價(jià)值。

綜上，通過(guò)本次研究我們發(fā)現(xiàn)聯(lián)合血漿miR-148b、CEA與MMP-1在食管癌鑒別診斷中臨床意義重大，有望為食管癌患者的診療提供新的途徑與思路。