袁冬冬 溫艷艷 何慧麗 聶志勇 洪永貴 吳 濤

胃癌(gastric carcinoma，GC)是常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，是一種高發(fā)病率、高死亡率的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，起源于胃黏膜上皮，具有早期診斷難、晚期難治療的特征[1-2]。有研究稱(chēng)胃癌的預(yù)后與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、病理類(lèi)型、腫瘤浸潤(rùn)深度等有關(guān)[3-4]，但是無(wú)法在患者早期患病時(shí)輕松獲取此類(lèi)信息，因此需要尋找對(duì)胃癌患者的預(yù)后做出準(zhǔn)確評(píng)估的新型生物學(xué)標(biāo)志物。近期有研究發(fā)現(xiàn)胃癌的發(fā)生發(fā)展與自噬活性的改變有關(guān)，且自噬相關(guān)基因微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)和自噬相關(guān)基因-5(autophagy related gene-5，ATG5)均是參與自噬活性調(diào)控的重要基因[5-6]。在多種被發(fā)現(xiàn)的 lncRNAs 中，SATB2 反義RNA 1(SATB2 antisense RNA 1，SATB2-AS1)定位于2q33.1 區(qū)域，為 SATB2 的天然反義 lncRNA，最早被報(bào)道為一種在骨肉瘤中發(fā)揮致癌作用的lncRNA，能在體外促進(jìn)細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)和細(xì)胞周期進(jìn)程[7-8]。因此，本研究探討胃癌組織中LC3、ATG5和SATB2-AS1在不同部位表達(dá)與臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性，在臨床中具有重要的研究?jī)r(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2018年5月至2019年10月本院收治的胃癌患者50例，年齡38～77歲，平均(67.32±7.64)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《胃癌規(guī)范化診療指南(試行)》[9]中關(guān)于胃癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)，患者經(jīng)病理檢查確診為胃癌； ②行根治術(shù)或姑息術(shù)切除腫瘤，且術(shù)前未接受過(guò)放化療、免疫治療患者；③所有患者病理組織均可進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)；④患者簽署自愿受試同意書(shū)，患者及其家屬需簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他器官?lài)?yán)重性病變患者；②合并其他惡性腫瘤患者。

1.2 免疫組化法檢測(cè)LC3和ATG5表達(dá)

獲取手術(shù)完整切除的胃癌組織，經(jīng)固定、脫水、包埋、切片，由病理科醫(yī)師選定蠟塊。將包埋制作好的組織芯片蠟塊切成3～5 um的薄片，烘片后置于二甲苯中20 min，經(jīng)無(wú)水乙醇、90%、80%、70%梯度乙醇清洗，ddH2O清洗后，3%H2O2溶液浸泡，PBS浸泡后加封閉液37 ℃封閉1 h。PBS浸泡后加一抗，4 ℃孵育過(guò)夜。PBS浸泡后加二抗，室溫孵育1 h，PBS浸泡清洗后加DAB顯色。ddH2O漂洗后蘇木精襯染后自來(lái)水沖洗玻片，65 ℃烘干后中性樹(shù)膠封固。結(jié)果判定：應(yīng)用Dmetrix 掃描系統(tǒng)掃描成數(shù)字切片，采用雙盲法閱片。在低倍鏡(100×)、高倍鏡(400×)下觀察癌周與癌巢部位染色強(qiáng)度，細(xì)胞核呈棕黃色顆粒為陽(yáng)性。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比計(jì)分：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為0分，<10%為1分，10%～50%為2分，>50%為3分。其中低表達(dá)為0～1分，高表達(dá)為2～3分。

1.3 RT-PCR檢測(cè)SATB2-AS1表達(dá)

采用TRIzol提取組織中總RNA，選取500 ng總RNA與2 μl 5×PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time)混勻后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，隨后取擴(kuò)增產(chǎn)物行qPCR，25 μl反應(yīng)體系包含TB GreenFast qPCR Mix(2×)12.5 μl、上下游引物各1 μl、DNA模板2 μl和滅菌水8.5 μl，反應(yīng)條件:預(yù)變性95 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)的95 ℃ 5 s、60 ℃ 10 s，整個(gè)qPCR操作于ABI 7300實(shí)時(shí)熒光定量PCR上完成。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt表示SATB2-AS1的相對(duì)表達(dá)量。SATB2-AS1上游引物：5'-GAGGAG-CAGGGGGTAGAGAA-3'，下游引物:5'-GTGTCAC-CCAACCTCTCCTG-3'；GAPDH上游引物:5'-GTAT-GACTGGGGGTGTTGGG-3'，下游引物:5'-AGCCACACCATCCTAGTTGC-3。

1.4 隨訪

收集患者年齡、性別、腫瘤分化程度、腫瘤最大徑等臨床資料。采用電話(huà)及門(mén)診或住院復(fù)查等方式進(jìn)行隨訪，了解患者生存情況。隨訪時(shí)間截止2021年5月。根據(jù)隨訪結(jié)果將患者分為死亡組和生存組。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 胃癌中LC3、ATG5和SATB2-AS1在癌周和癌巢表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

胃癌中LC3在癌周和癌巢表達(dá)與患者腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)(P<0.05)；ATG5在癌周表達(dá)與患者腫瘤分化程度、腫瘤分期有關(guān)(P<0.05)，ATG5在癌巢表達(dá)與腫瘤分化程度、腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)(P<0.05)；SATB2-AS1在癌周表達(dá)與患者腫瘤分化程度、腫瘤最大直徑有關(guān)(P<0.05)，SATB2-AS1在癌巢表達(dá)與患者腫瘤分化程度、腫瘤最大直徑和臨床分期有關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表1～3。

表1 胃癌中LC3在癌周和癌巢表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

表2 胃癌ATG5在癌周和癌巢表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

表3 胃癌中SATB2-AS1在癌周和癌巢表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.2 影響胃癌患者預(yù)后的單因素分析

隨訪至2021年5月，50例患者死亡23例。單因素分析發(fā)現(xiàn)分化程度、淋巴結(jié)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、癌巢LC3、ATG5和SATB2-AS1表達(dá)是影響胃癌預(yù)后的因素(P<0.05)，見(jiàn)表 4。

表4 影響胃癌患者預(yù)后的單因素分析/例

2.3 影響胃癌患者預(yù)后的多因素分析

多因素分析顯示腫瘤分化程度、淋巴結(jié)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、癌巢LC3、ATG5和SATB2-AS1表達(dá)是影響胃癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見(jiàn)表5。

表5 影響胃癌患者預(yù)后的多因素分析

3 討論

胃癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，發(fā)生率與死亡率分別位居全球第5位與第3位[10]。我國(guó)胃癌發(fā)病率與死亡率僅次于肺癌，居第2位，是造成社會(huì)負(fù)擔(dān)的重要因素，多數(shù)患者因中晚期胃癌就診[11-12]。胃癌的主要臨床表現(xiàn)為遠(yuǎn)期生存狀況低下、臨床治療效果差，且具有易復(fù)發(fā)、易轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)[13]。盡管近年來(lái)晚期胃癌患者手術(shù)及放化療方案不斷發(fā)展，但是5年生存率仍然較低[14]。針對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體、c-met等藥物正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)，但是胃癌的發(fā)生、發(fā)展是多因素、多步驟的復(fù)雜過(guò)程，在胃癌中的應(yīng)用存在局限性[15-16]。另外關(guān)于胃癌發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制尚不清楚，因此探討胃癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)等過(guò)程的作用機(jī)制，尋找新的預(yù)后指標(biāo)是目前臨床研究亟待解決的問(wèn)題。

LC3 是酵母 Atg8p 的哺乳動(dòng)物同源物，被認(rèn)為是自噬體的重要組成部分[17]，包括 LC3A、LC3B、LC3C 3種同工型，其中 LC3B 與自噬水平相關(guān)[18]。LC3 已被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤包括卵巢癌、腦癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、乳腺癌、黑色素瘤中異常表達(dá)[19-20]。LC3 表達(dá)與FIGO 分期相關(guān)[21]。 LC3 表達(dá)與血管浸潤(rùn)顯著相關(guān)；高 LC3 表達(dá)表明總體生存率 (OS) 較差[22-23]。ATG5是一種重要的自噬體形成相關(guān)蛋白，在真核細(xì)胞中充當(dāng) E1 樣激活酶[24]。ATG5 已被證明在病毒感染、腫瘤細(xì)胞凋亡和腫瘤增殖中起到重要作用，有望成為臨床癌癥治療的新靶點(diǎn)[25-26]。LncRNA 是一類(lèi)長(zhǎng)度大于 200 個(gè)核苷酸且沒(méi)有蛋白質(zhì)編碼能力的轉(zhuǎn)錄子[27]。越來(lái)越多的研究數(shù)據(jù)表明，lncRNAs是基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)因子，參與多種生理和病理過(guò)程，包括腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[28]。有研究發(fā)現(xiàn)了一種新的 lncRNA，SATB2-AS1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)水平顯著降低，并且與結(jié)直腸癌的預(yù)后相關(guān)[29]。有研究發(fā)現(xiàn)SATB2-AS1可以抑制結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移并調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌細(xì)胞中TH1型趨化因子的分泌[30]。本研究發(fā)現(xiàn)雖然癌周組織中LC3、ATG5和SATB2-AS1的表達(dá)和患者的預(yù)后不存在相關(guān)性，但與臨床病理特征有關(guān)，提示癌周組織中LC3、ATG5和SATB2-AS1表達(dá)參與胃癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。本研究中癌巢LC3、ATG5和SATB2-AS1表達(dá)與患者預(yù)后存在相關(guān)，即高表達(dá)的患者的生存率更低，癌巢LC3、ATG5和SATB2-AS1表達(dá)是影響胃癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示癌巢LC3、ATG5和SATB2-AS1表達(dá)有潛力成為預(yù)測(cè)胃癌患者預(yù)后的生物標(biāo)志物，但其中具體作用機(jī)制尚不明確，潛在的原因還需進(jìn)一步試驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)驗(yàn)證。

綜上所述，本研究胃癌癌周和癌巢組織中LC3、ATG5和SATB2-AS1表達(dá)與臨床病理特征存在相關(guān)性，癌巢組織LC3、ATG5和SATB2-AS1表達(dá)可作為預(yù)測(cè)胃癌患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。