鄭 豪 李東亮 朱清海

胃癌是我國(guó)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，目前其具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚[1]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是近些年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類調(diào)控型大分子非編碼RNA，在多種生命活動(dòng)中具有調(diào)控作用。lncRNA 01287在多種癌組織及癌細(xì)胞中高表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA 01287與乳腺癌較差的臨床結(jié)局密切相關(guān)，而且lncRNA 01287高表達(dá)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[2]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長(zhǎng)度在25 nt范圍內(nèi)的非編碼RNA，miR-298在腫瘤中的抑癌作用已被廣泛報(bào)道，miR-298在甲狀腺癌中低表達(dá)，甲狀腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-298模擬物則可抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[3]。有研究報(bào)道，lncRNA 01287在肝癌中通過(guò)負(fù)向調(diào)控miR-298，從而在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起作用[4]。信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer andactivator of transcription，STAT3)是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在胃癌中高表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)，miR-298通過(guò)靶向作用于STAT3在肝癌細(xì)胞的增殖遷移以及上皮轉(zhuǎn)化中發(fā)揮調(diào)控作用[5]。因此，本研究以胃癌SGC-7901細(xì)胞為研究對(duì)象，探討lncRNA 01287是否能通過(guò)調(diào)節(jié)miR-298表達(dá)，從而調(diào)控STAT3信號(hào)通路，在肝癌中發(fā)揮作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系

人胃癌SGC-7901細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 試劑與儀器

LncRNA 01287模擬物(mimic)、模擬物陰性對(duì)照(mimic-NC)、抑制劑(inhibitor)以及抑制劑陰性對(duì)照(inhibitor-NC)購(gòu)自上海吉瑪制藥有限公司；Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；p-STAT3、STAT3、上皮鈣粘蛋白(E-cadherin，E-cad)、神經(jīng)鈣粘蛋白(N-cadherin，N-cad)和波形蛋白(Vimentin)抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；倒置顯微鏡購(gòu)自日本OLYMPUS公司；多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)MD公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

人胃癌SGC-7901細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱環(huán)境為37 ℃、5%CO2，每2天更換一次培養(yǎng)基，顯微鏡下觀察細(xì)胞融合度為80%左右時(shí)，胰蛋白酶消化，DMEM培養(yǎng)基將細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，進(jìn)行傳代。將第4代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、inhibitor-NC組、inhibitor組、mimic-NC組和mimic組，除對(duì)照組外，其余組分別轉(zhuǎn)染inhibitor NC、inhibitor、mimic NC以及mimic，轉(zhuǎn)染24 h后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 qRT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞中Lnc RNA01287和miR-298的表達(dá)水平

離心收集細(xì)胞，加入Trizol試劑提取細(xì)胞中總RNA，測(cè)定RNA濃度和純度，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，2-△△CT法計(jì)算Lnc RNA01287和miR-298表達(dá)水平，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率

收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，DMEM培養(yǎng)基將細(xì)胞制成密度為5×104/ml的單細(xì)胞懸液，以每孔200 μl接種于96孔板，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，每孔加入5 mg/ml的MTT溶液50 μl，4 h后棄上清，每孔加入DMSO 150 μl，振蕩混合15 min，置于波長(zhǎng)為490 nm的酶標(biāo)儀上，測(cè)定吸光度(A)值，并計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)×100%。

1.6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，制成密度為1×106/ml的單細(xì)胞懸液，每孔100 μl接種于6孔板，至于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)80%以上時(shí)，用100 μl無(wú)菌槍頭垂直培養(yǎng)板底部均勻劃線，預(yù)冷PBS清洗3次，除去細(xì)胞碎片，加入無(wú)血清培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在0 h和24 h拍照測(cè)量劃痕寬度，細(xì)胞劃痕愈合率(%)=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.7 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力

Matrigel基質(zhì)膠與無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基按照1∶3的比例稀釋混勻，將100 μl稀釋后的基質(zhì)膠平鋪于Transwell小室中，置于恒溫培養(yǎng)箱中1 h，使基質(zhì)膠凝固。收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/ml，在上室中加入細(xì)胞懸液100 μl，下室中加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基600 μl，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出小室，濕棉簽將小室上層未遷移細(xì)胞拭去，預(yù)冷PBS清洗3次，多聚甲醛固定15 min，結(jié)晶紫染色20 min，預(yù)冷PBS清洗3次，顯微鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野計(jì)數(shù)。

1.8 雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)檢測(cè)靶向關(guān)系

Targetscan軟件進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，構(gòu)建野生型LncRNA 01287(WT LncRNA 01287)和突變型LncRNA 01287(Mut LncRNA 01287)熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，采用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將野生型和突變型質(zhì)粒與miR-298 mimic與mimic-NC共同轉(zhuǎn)染如SGC-7901細(xì)胞，48 h后收集細(xì)胞，測(cè)定熒光素酶活性，結(jié)果以海參熒光素酶的發(fā)光強(qiáng)度與螢火蟲(chóng)熒光素酶發(fā)光強(qiáng)度的比值反映LncRNA 01287與miR-298的結(jié)合強(qiáng)度。采用同樣的方法構(gòu)建WT-STAT3和Mut-STAT3質(zhì)粒，將兩種質(zhì)粒與miR-298 mimic與mimic-NC共轉(zhuǎn)染入SGC-7901細(xì)胞，檢測(cè)miR-298與STAT3的靶向關(guān)系。

1.9 蛋白印跡法檢測(cè)細(xì)胞中各蛋白表達(dá)

預(yù)冷PBS清洗細(xì)胞3次，加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞，離心收集上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度，加入上樣緩沖液，煮沸變性。濃縮膠每孔加入蛋白樣品20 μl，80 v電泳直至蛋白樣品到達(dá)分離膠，120 v電泳直至蛋白樣品到達(dá)分離膠底部。0.3 A恒流濕轉(zhuǎn)2 h，取出PVDF膜，TBST洗膜3次，室溫封閉1 h，p-STAT3、STAT3、E-cad、N-cad、Vimentin以及GAPDH抗體(1∶1000)4 ℃過(guò)夜，TBST洗膜3次，二抗(1∶5000)室溫孵育1 h，ECL法顯色，Image J分析條帶灰度值，目的蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果

LncRNA 01287和miR-298表達(dá)水平組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。對(duì)照組、inhibitor-NC組以及mimic-NC組LncRNA 01287和miR-298表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；與mimic-NC組比較，mimic組LncRNA 01287表達(dá)水平升高，miR-298表達(dá)水平降低；與inhibitor-NC組比較，inhibitor組LncRNA 01287表達(dá)水平降低，miR-298表達(dá)水平升高，見(jiàn)表2。

表2 各組細(xì)胞中LncRNA 01287和miR-298表達(dá)水平比較

2.2 細(xì)胞存活率檢測(cè)結(jié)果

細(xì)胞存活率組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與inhibitor-NC組比較，inhibitor組細(xì)胞存活率降低(P<0.05)；對(duì)照組、mimic-NC組、mimic組以及inhibitor-NC組細(xì)胞存活率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表3。

表3 各組細(xì)胞存活率比較

2.3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果

劃痕愈合率組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與mimic-NC組比較，mimic組劃痕愈合率升高(P<0.05)；與inhibitor-NC組比較，inhibitor組劃痕愈合率降低(P<0.05)；對(duì)照組、mimic-NC組以及inhibitor NC組劃痕愈合率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表4。

表4 各組細(xì)胞劃痕愈合率比較

2.4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果

侵襲細(xì)胞數(shù)組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與mimic-NC組比較，mimic組侵襲細(xì)胞數(shù)增多(P<0.05)；與inhibitor-NC組比較，inhibitor組侵襲細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05)；對(duì)照組、mimic-NC組以及inhibitor NC組侵襲細(xì)胞數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表5。

表5 各組侵襲細(xì)胞數(shù)比較

2.5 LncRNA 01287和miR-298 mimic的靶向關(guān)系

SGC-7901細(xì)胞轉(zhuǎn)染W(wǎng)T LncRNA 01287和miR-298 mimic后，相對(duì)熒光素酶活性明顯降低；而轉(zhuǎn)染Mut LncRNA 01287和miR-298 mimic后，相對(duì)熒光素酶活性無(wú)影響，見(jiàn)圖1、表6。

圖1 LncRNA 01287和miR-298的結(jié)合位點(diǎn)和突變位點(diǎn)

表6 相對(duì)熒光素酶活性比較

2.6 miR-298和STAT3的靶向關(guān)系

SGC-7901細(xì)胞轉(zhuǎn)染W(wǎng)T STAT3和miR-298 mimic后，相對(duì)熒光素酶活性明顯降低；而轉(zhuǎn)染Mut STAT3和miR-298 mimic后，相對(duì)熒光素酶活性無(wú)影響。見(jiàn)圖2、表7。

圖2 STAT3和miR-298結(jié)合位點(diǎn)和突變位點(diǎn)

表7 相對(duì)熒光素酶活性比較

2.7 蛋白印跡法檢測(cè)結(jié)果

p-STAT3、N-cad、E-cad和Vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與mimic-NC組比較，mimic組p-STAT3、N-cad和Vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量升高，E-cad蛋白相對(duì)表達(dá)量降低(P<0.05)；與inhibitor-NC組比較，inhibitor組p-STAT3、N-cad和Vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，E-cad蛋白相對(duì)表達(dá)量升高(P<0.05)；對(duì)照組、mimic-NC組以及inhibitor-NC組各蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表8，圖3。

表8 各組細(xì)胞中蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

3 討論

胃癌是臨床上常見(jiàn)的高度異質(zhì)性的消化道腫瘤，嚴(yán)重威脅人類生命健康，因其發(fā)病具有隱匿性，因此大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于進(jìn)展期[6]。進(jìn)展期胃癌伴發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移是臨床上治療的難點(diǎn)，腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移是一個(gè)多基因、多步驟以及多階段的復(fù)雜過(guò)程，腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)灶，運(yùn)動(dòng)至細(xì)胞外基質(zhì)、鄰近組織器官或遠(yuǎn)處器官生長(zhǎng)成肉眼可見(jiàn)的實(shí)質(zhì)性腫瘤細(xì)胞團(tuán)的過(guò)程。胃癌術(shù)后化療常存在較多不良反應(yīng)，造成患者五年生存率較低，預(yù)后效果不理想[7]。因此，深入研究胃癌的發(fā)病機(jī)制，尋找調(diào)控胃癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵分子對(duì)臨床治療胃癌，提高患者生存率至關(guān)重要。

A為對(duì)照組；B為mimic-NC組；C為mimic組；D為inhibitor-NC組；E為inhibitor組。

本研究通過(guò)過(guò)表達(dá)或抑制胃癌細(xì)胞SGC 7901中l(wèi)ncRNA 01287的表達(dá)，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性、劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力以及Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力，結(jié)果顯示：細(xì)胞中l(wèi)ncRNA 01287過(guò)表達(dá)后劃痕愈合率升高，侵襲細(xì)胞數(shù)增多，抑制細(xì)胞中l(wèi)ncRNA 01287的表達(dá)后細(xì)胞存活率和劃痕愈合率降低，侵襲細(xì)胞數(shù)減少。結(jié)果表明：lncRNA 01287可促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。近年來(lái)，miR-298被認(rèn)為與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)，miR-298靶向PTEN在結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲中發(fā)揮作用[8]。Rui等[9]研究發(fā)現(xiàn)lncRNA GAS6-AS2直接靶向抑制miR-298表達(dá)，因此降低膀胱癌細(xì)胞的增殖活性，抑制腫瘤的生長(zhǎng)。沉默環(huán)狀RNA0005797靶向調(diào)節(jié)miR-298抑制子宮內(nèi)膜癌進(jìn)展[10]。本研究雙熒光素酶報(bào)告基因顯示，lncRNA 01287靶向作用于miR-298，qRT-PCR結(jié)果顯示：過(guò)表達(dá)SGC 7901細(xì)胞中miR-298表達(dá)后miR-298表達(dá)水平降低，而抑制lncRNA 01287表達(dá)可上調(diào)miR-298表達(dá)。結(jié)果表明：lncRNA 01287靶向抑制miR-298表達(dá)。

STAT3是細(xì)胞內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子之一，參與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、分化及細(xì)胞周期等過(guò)程，是多種惡性腫瘤發(fā)生的重要因子之一，參與腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[11]。研究發(fā)現(xiàn)，p-STAT3表達(dá)水平與胃癌患者的不良預(yù)后及胃癌分化程度，TNM分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤浸潤(rùn)深度密切相關(guān)[12]。miR-223通過(guò)靶向抑制胃癌細(xì)胞中STAT3蛋白的轉(zhuǎn)錄活性，從而減弱胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力[13]。本研究雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-298可直接靶向作用于STAT3。蛋白印跡法結(jié)果顯示：lncRNA 01287過(guò)表達(dá)后，p-STAT3蛋白表達(dá)升高，抑制lncRNA 01287表達(dá)后，p-STAT3蛋白表達(dá)降低。結(jié)果表明：lncRNA 01287通過(guò)抑制miR-298表達(dá)，激活STAT3的轉(zhuǎn)錄活性。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是上皮細(xì)胞逐漸失去上皮表型，而獲得間質(zhì)細(xì)胞表型的現(xiàn)象，是腫瘤細(xì)胞發(fā)生浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的重要原因。研究發(fā)現(xiàn)，外源性17肽胃泌素激活STAT3信號(hào)通路，下調(diào)E-cad，上調(diào)N-cad和Vimentin蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞SGC-7901發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[14]。幽門螺桿菌通過(guò)激活I(lǐng)L-6/STAT3信號(hào)通路誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的形成[15]。本研究結(jié)果顯示：過(guò)表達(dá)lncRNA 01287的細(xì)胞中E-cad蛋白表達(dá)降低，N-cad和Vimentin蛋白表達(dá)升高，抑制lncRNA 01287表達(dá)的細(xì)胞中E-cad蛋白表達(dá)升高，N-cad和Vimentin蛋白表達(dá)降低。結(jié)果表明：lncRNA 01287誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

綜上所述，lncRNA 01287上調(diào)可增強(qiáng)胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲活性，其可能是通過(guò)調(diào)控miR-298/STAT3信號(hào)通路發(fā)揮作用，為臨床治療胃癌提供理論依據(jù)。