李雙花，趙萍，田洪敏，李紅，董威，陳煜，鮑路偉，吳克

武漢博沃生物科技有限公司技術中心新型疫苗與重組蛋白湖北省工程實驗室，湖北 武漢 430075

肺炎球菌是肺炎、腦膜炎、中耳炎和鼻竇炎的主要病原菌，也是引起嬰幼兒和老年人發(fā)病及死亡的重要病因［1-3］。細菌莢膜多糖疫苗在預防由肺炎球菌、腦膜炎球菌、流感嗜血桿菌等引起的侵襲性疾病中均具有良好的效果［4-5］，但肺炎球菌莢膜多糖屬于非T 細胞依賴性抗原，嬰幼兒的免疫系統(tǒng)發(fā)育不完全，多糖抗原不能對2 歲以下幼兒產(chǎn)生有效免疫應答［6］，而多糖-蛋白結合疫苗可將非 T 細胞依賴性抗原轉變?yōu)門 細胞依賴性抗原，并在嬰幼兒體內(nèi)產(chǎn)生免疫原性和保護力［7-8］。

多糖-蛋白結合疫苗的關鍵有效成分是通過化學反應方法將多糖抗原與載體蛋白共價結合制備，其制備工藝中常見的多糖活化劑包括溴化氰和1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟化硼（1-cyano-4-dimethylamino pyridinium tetrafluoroborate，CDAP）。溴化氰可在水環(huán)境下幾分鐘內(nèi)完成活化過程，操作簡便，但毒性較大［9］。相比溴化氰，CDAP活化條件相對溫和，活化效率更高，而毒性卻低很多，因此近年來將CDAP用于多糖-蛋白結合疫苗工藝制備中［10-12］。

CDAP 活化多糖后轉化為4-二甲氨基吡啶（4-dimethylamino pyridine，DMAP）［13-14］，相對于溴化氰，DMAP 是一種低毒性化合物，但仍具有毒性、刺激性，可損傷眼睛、皮膚、呼吸系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等，危害人體健康。因此，控制和監(jiān)測多糖-蛋白結合疫苗中DMAP 殘留量，對于保障其質(zhì)量和使用安全性具有非常重要的意義。

目前DMAP 檢測的相關研究較少，有報道采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（Gas Chromatograph-Mass Spectrometer，GC-MS）法［15］和高效液相色譜（HPLC）法［16-18］進行測定，其中GC-MS 法檢測靈敏度高，但方法較為繁瑣，且檢測成本較高；而HPLC 法具有操作簡便、專屬性強、檢測成本低等優(yōu)點。但DMAP 是一種強極性堿性化合物，在常規(guī)反相色譜上無保留，無法實現(xiàn)與溶劑峰的分離。本研究建立了對色譜柱類型、流動相組成優(yōu)化后的HPLC 方法，以用于肺炎球菌多糖-蛋白結合疫苗中殘留DMAP 的檢測，并對優(yōu)化后的方法進行了驗證。

1 材料與方法

1. 1 疫苗 肺炎球菌多糖-CRM197 蛋白結合疫苗（Pn 1、Pn 3、Pn 4、Pn 5、Pn 6A、Pn 6B、Pn 7F、Pn 9V、Pn 14、Pn 18C、Pn 19FA、Pn 19F、Pn 23F）購自武漢博沃生物科技有限公司。

1.2 主要試劑及儀器 DMAP標準品（純度＞99%）、CDAP標準品（純度＞99%）、脫氧膽酸鈉（分析純）購自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；乙腈、甲醇（色譜純）購自美國天地有限公司；庚烷磺酸鈉（分析純）購自天津市科密歐化學試劑有限公司；磷酸二氫鉀（分析純）購自默克化工技術（上海）有限公司；磷酸、鹽酸（分析純）購自國藥集團化學試劑有限公司；帶二極管陣列檢測器的高效液相色譜儀（Agilent 1260）購自安捷倫科技（中國）有限公司；Sepax HPC18 色譜柱（5 μm，4. 6 mm × 250 mm）購自蘇州賽分科技有限公司；Ultimate Polar-RP 色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）購自月旭科技（上海）股份有限公司；pH 計（FE20）購自梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 樣品處理

1.3.1 對照品儲備溶液配制 取DMAP對照品50 mg，用甲醇∶水= 90∶10（V／V）溶解并定容至50 mL，濃度為1 mg／mL。

1.3.2 對照品工作溶液配制 取對照品儲備溶液，分別用流動相稀釋至濃度為0.05、0.1、1、2和10 μg／mL。

1. 3. 3 供試品溶液配制 取1 mL 肺炎球菌多糖-CRM197 蛋白結合疫苗，加入100 μL 10%脫氧膽酸鈉溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用），渦旋混勻，于冰水浴中放置30 min；取出后立即加入50 μL 鹽酸溶液（8.6%，V／V），渦旋混勻，16 250 ×g離心15 min，取上清液，用0.45 μm水系濾器過濾。

1.3.4 空白溶液 取1 mL去離子水，按照1.3.3項方法處理。

1.3.5 CDAP 活化肺炎球菌多糖中間產(chǎn)物處理 第1步中間產(chǎn)物制備（加入蛋白之前）：取Pn 19F 型肺炎球菌多糖溶液攪拌均勻，加入0.5 mg／mL CDAP 乙腈溶液，NaOH 調(diào) pH 至 9.5，攪拌均勻，0.45 μm 水系濾器過濾；第2 步中間產(chǎn)物制備（加入蛋白后）：取Pn 19F型肺炎球菌多糖溶液攪拌均勻，加入0.5 mg／mL CDAP乙腈溶液，NaOH 調(diào)pH 至9.5，持續(xù)攪拌2 min，加入 CRM197 蛋白溶液，NaOH 調(diào) pH 至 9. 5，攪拌均勻，0.45 μm水系濾器過濾。

1.4 色譜條件的優(yōu)化 以1 μg／mL DMAP對照品溶液為樣品，檢測波長：280 nm，流速：1 mL／min，進樣體積：10 μL，柱溫：35 ℃。首先以 Ultimate Polar-RP（5 μm，4.6 mm ×250 mm）為色譜柱，分別考察0.1%氨水溶液（pH 8.0）-乙腈流動相體系、20 mmol／L 醋酸銨溶液（pH 6.5）-乙腈流動相體系、庚烷磺酸鈉／磷酸二氫鉀（離子對試劑緩沖液）溶液-乙腈流動相體系對色譜保留和峰形影響；繼而考察了庚烷磺酸鈉濃度（5、10、15 mmol／L）、磷酸氫二鉀濃度（15、20、25 mmol／L）、離子對試劑緩沖液pH 值（2. 5、3. 0、3.5）、離子對試劑緩沖液與乙腈比例（85∶15、87∶13、89∶11）對色譜保留和峰形的影響；在選定的色譜條件下，考察不同色譜柱Sepax HP-C18（5 μm，4.6 mm ×250 mm）和Ultimate Polar-RP色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）對色譜保留和峰形的影響。

1.5 方法的驗證

1. 5. 1 專屬性 取1 μg／mL DMAP 對照品溶液、供試品溶液及空白溶液，按照1. 4 項優(yōu)化后的色譜條件進樣檢測。

1.5.2 檢出限及定量限 將0.1 μg／mL DMAP 對照品工作溶液逐級稀釋，按照1. 4 項優(yōu)化后的色譜條件進樣檢測，分別以信噪比3∶1 和10∶1 對照品溶液濃度為儀器檢出限和定量限，通過計算得出方法的檢出限和定量限。

1.5.3 線性 將對照品工作溶液按照1.4項優(yōu)化后的色譜條件進樣檢測，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，進行線性回歸，計算相關系數(shù)。

1. 5. 4 準確度 取2 種血清型肺炎球菌多糖-CRM-197 結合疫苗（Pn 19F 和Pn 4）為供試品，分別加入已知量的DMAP 對照品，3 個濃度水平加標（Pn 19F：0. 060、0. 120、0. 180 μg／mL；Pn 4：0. 600、1. 200、1. 800 μg／mL），按照 1. 4 項優(yōu)化后的色譜條件進行檢測，每個加標濃度水平平行加標測定3 次，按下式計算加標回收率。

加標回收率（%）=實測值／理論值×100%

1.5.5 重復性及重現(xiàn)性 取Pn 6B 型肺炎球菌多糖-CRM197 結合疫苗為供試品，由1 名實驗員在同一日期內(nèi)平行測定6 次，計算6 次測定結果的相對標準偏差（RSD），即為方法的重復性；在不同實驗室間、不同日期，由不同實驗員平行測定24 次，計算24 次測定結果的RSD，即為方法的重現(xiàn)性。

1.6 方法的初步應用 取13種不同血清型的肺炎球菌多糖-CRM197 蛋白結合疫苗及CDAP 活化肺炎球菌多糖中間產(chǎn)物，按照1. 4 項優(yōu)化后的色譜條件檢測DMAP殘留量。

2 結果

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 流動相組成及比例 氨水溶液-乙腈流動相體系、醋酸銨溶液-乙腈流動相體系下DMAP 有保留，但色譜峰拖尾，柱效低，而庚烷磺酸鈉／磷酸二氫鉀溶液-乙腈流動相體系下，DMAP 不僅有保留，且峰形對稱，柱效高，見圖1。因此選擇庚烷磺酸鈉／磷酸二氫鉀溶液-乙腈為流動相。綜合考慮DMAP保留時間、峰形和色譜柱的長期穩(wěn)定性，選擇流動相為5 mmol／L 庚烷磺酸鈉溶液（含20 mmol／L 磷酸二氫鉀，磷酸調(diào)pH至3.0）∶乙腈 =87∶13（V／V）。

圖1 供試品及對照品溶液色譜圖Fig.1 HPLC profile of test sample and control solutions

2.1.2 色譜柱 Ultimate Polar-RP 色譜柱柱效低，壽命短；Sepax HP-C18 色譜柱柱效高，峰形對稱，且壽命長。因此選擇Sepax HP-C18色譜柱。

2.2 優(yōu)化后的色譜條件 色譜柱：Sepax HP-C18（5 μm，4. 6 mm × 250 mm）；流動相：5 mmol／L 庚烷磺酸鈉溶液（含20 mmol／L 磷酸二氫鉀，磷酸調(diào)pH 至3. 0）∶乙腈 = 87∶13（V／V）；檢測波長：280 nm；流速：1 mL／min；進樣體積：10 μL；柱溫：35 ℃。

2.3 方法的驗證

2.3.1 專屬性 供試品溶液中DMAP 色譜峰與對照品溶液主峰保留時間一致；供試品溶液中DMAP 色譜峰無雜質(zhì)干擾，其光譜圖與對照品溶液一致，歸一化后兩者完全重合；利用二極管陣列檢測器的峰純度鑒定功能得出，供試品溶液中DMAP 色譜峰純度為99.8%。見圖2。表明該方法不受供試品機制和前處理溶劑的干擾，專屬性強，是一種高選擇的分離方法。

圖2 對照品與供試品溶液中DMAP色譜峰光譜圖Fig.2 DMAP peaks in control and sample solutions

2.3.2 檢出限及定量限 方法的檢出限和定量限分別為3.6（S／N=4.4）和14.4 ng／mL（S／N=14.1）。

2. 3. 3 線性 DMAP 濃度在 0. 05 ～ 10 μg／mL 范圍內(nèi)，線性關系良好，線性回歸方程為：Y=1×107X+340 514，相關系數(shù)R2=0.999 9。

2. 3. 4 準確度 兩種血清型肺炎球菌多糖-CRM197結合疫苗各9份樣品的加標回收率均在83%～105%之間，滿足痕量分析的準確度要求，見表1。表明該方法準確度較高。

表1 準確度驗證結果Tab.1 Verification for accuracy

2.3.5 重復性及重現(xiàn)性 同一實驗員同一日期對同一供試品平行6次測定結果的RSD為0.28%～0. 72%，不同實驗員不同實驗室間不同日期平行24 次測定結果的RSD為7.38%，見表2。表明該方法重復性和重現(xiàn)性較好。

表2 結合疫苗中DMAP殘留量的重復性和重現(xiàn)性（μg／mL）Tab. 2 Repeatability and reproducibility of residual DMAP content in conjugate vaccine（μg／mL）

2.4 方法的初步應用 13 種不同血清型的肺炎球菌多糖-CRM197 蛋白結合疫苗中DMAP 殘留量為0. 135 ～ 1.635 μg／mL；CDAP 活化肺炎球菌多糖第一步中間產(chǎn)物即可檢測出DMAP，未檢測到CDAP，見圖3。表明CDAP 在pH 9.5 的堿性條件下活化多糖后可完全轉化為DMAP。

圖3 Pn 19F型多糖活化過程中間產(chǎn)物色譜圖Fig. 3 HPLC profile of intermediates in activation process of Pn polysaccharide of serotype 19F

3 討論

DMAP 是一種強極性的堿性化合物，在反相色譜分離模式下無保留，且峰形不佳。本研究建立了肺炎球菌多糖-CRM197蛋白結合疫苗中DMAP 殘留量的HPLC 測定方法，采用極性C18 色譜柱，離子對試劑為流動相。經(jīng)驗證該方法專屬性好，供試品溶液中DMAP 色譜峰與對照品溶液主峰保留時間一致，且供試品中其他成分對檢測無干擾；該方法準確度高，重現(xiàn)性好，操作簡便，可有效檢測肺炎球菌多糖-蛋白結合疫苗中DMAP 殘留量，對疫苗的質(zhì)量控制及用藥安全具有重要意義。

有研究報道 CDAP 活化多糖有 2 種機理［14］，第 1種機理為CDAP 活化多糖羥基即生成多糖衍生物和DMAP，而第2 種機理是CDAP 活化多糖羥基后先生成多糖衍生物，加入蛋白后生成DMAP。本研究對CDAP 活化肺炎球菌多糖中間產(chǎn)物進行了檢測，結果顯示，CDAP 在pH 9. 5 的堿性條件下活化多糖后可完全轉化為DMAP，即CDAP 活化多糖為第1 種活化機理，為肺炎球菌多糖-蛋白結合機理提供了依據(jù)。