王月，張金，喻劍虹，劉瑩，羅艷，張林林，郭佳茹，向陽(yáng)，張雪，趙傳波，彭干，陳鄂湘，何彥林，李策生，楊曉明

1.國(guó)藥集團(tuán)武漢血液制品有限公司，湖北 武漢 430207；2.北京天壇生物制品股份有限公司，北京 100024；3.中國(guó)生物技術(shù)股份有限公司，北京 100024

新型冠狀病毒肺炎（Coronavirus Disease 2019，COVID-19）是一種由嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARSCoV-2）感染引起的急性傳染性疾?。?］，基本傳播指數(shù) 2.2 ～ 3.9［2］。COVID-19 康復(fù)者恢復(fù)期血漿治療能夠顯著改善重癥患者的臨床癥狀并降低病毒載量，且安全性良好［3］。新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）推薦康復(fù)者血漿用于重癥或危重癥患者［4］。制備以康復(fù)者血漿為原料的血液制品時(shí)，必須嚴(yán)格檢測(cè)康復(fù)者血漿的SARS-CoV-2 和各種其他感染原情況，因此，需要一種快速高效能在體外檢測(cè)血漿中SARS-CoV-2和其他病原菌的質(zhì)控方法。

根據(jù)《新冠肺炎康復(fù)者恢復(fù)期血漿實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)質(zhì)量控制要求》［5］，本研究對(duì) COVID-19 康復(fù)者恢復(fù)期血漿中多種病原體的分子生物學(xué)檢測(cè)方法進(jìn)行系統(tǒng)驗(yàn)證，以期為COVID-19康復(fù)者恢復(fù)期血漿成功應(yīng)用于臨床重癥患者治療提供質(zhì)量保證。

1 材料與方法

1.1 樣本及菌毒株 COVID-19 康復(fù)者恢復(fù)期血漿主要由湖北省COVID-19康復(fù)者捐獻(xiàn)；病原體陰性的人類血液樣本和病原體陰性的正常人血漿樣本（已知陰性樣本）由國(guó)藥集團(tuán)武漢血液制品有限公司提供；Coriell Institute 人類基因組購(gòu)自北京孚博生物科技有限公司；22 種病原體菌株、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌、肺炎克雷伯菌、單純皰疹病毒、柯薩奇病毒A 型、柯薩奇病毒B 型及已知陽(yáng)性樣本（分別為甲型流感、百日咳鮑特菌、副流感病毒2 及冠狀病毒C229E 菌液）均由上海捷諾生物科技有限公司惠贈(zèng)。

1.2 主要試劑及儀器 人纖連蛋白購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司；鹽水噴鼻劑購(gòu)自湖北普愛藥業(yè)有限公司；保存液購(gòu)自武漢瑞新昌生物科技有限公司；GN-96S 型GNCycler 多重病原微生物核酸檢測(cè)系統(tǒng)購(gòu)自上海宏石醫(yī)療科技有限公司；QIAamp?Min Elute?Virus Spin Kit 核酸提取試劑盒（批號(hào)：163052734）購(gòu)自德國(guó)QIAGEN 公司；單管多重呼吸道病原體檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：RFV2020001）購(gòu)自上海捷諾生物科技有限公司。

1.3 COVID-19康復(fù)者恢復(fù)期血漿中病原體檢測(cè)方法

1.3.1 血漿核酸樣本提取 采用核酸提取試劑盒提取血漿核酸樣本，由于相比呼吸道樣本，血漿樣本較黏稠，將蛋白酶K 使用量增至30 μL，洗脫試劑的使用量增至 600 μL，同時(shí)取200 μL 稀釋液作為陰性對(duì)照，再向血漿樣本和陰性對(duì)照中分別加入5 μL RespiFinder內(nèi)部質(zhì)控（internal control，IC）。

1.3.2 多重病原體核酸檢測(cè) 試驗(yàn)原理：?jiǎn)喂芏嘀豍CR 技術(shù)結(jié)合熔解曲線，可同時(shí)檢測(cè)22 種病原體。共分為兩步PCR 反應(yīng)：第1 步逆轉(zhuǎn)錄，進(jìn)行多重PCR反應(yīng)，該步驟的目的是富集樣本中存在的靶標(biāo)核酸；取第1步PCR 產(chǎn)物，分別進(jìn)行兩個(gè)獨(dú)立的第2步PCR反應(yīng)，該步驟擴(kuò)增病原體特異引物區(qū)域，與病原體探針結(jié)合，通過熔解曲線熔解溫度（melting temperature，Tm）值鑒定不同病原體。

擴(kuò)增反應(yīng)：第1步PCR反應(yīng)：50 ℃逆轉(zhuǎn)錄10 min；95 ℃預(yù)變性 2 min；94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 35 s，共45個(gè)循環(huán)。取第1步擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL，分別加入第2步兩個(gè)PCR 擴(kuò)增體系，95 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，共 10 個(gè)循環(huán)；94 ℃ 15 s，50 ℃15 s，72 ℃ 15 s，共 10 個(gè)循環(huán)；95 ℃變性 2 min，40 ℃90 s熔解準(zhǔn)備階段，40 ～90 ℃熔解程序。

結(jié)果判讀：選擇正確的熒光通道（FAM／ROX／Cy5），以陰性對(duì)照作為熒光信號(hào)背景，比對(duì)不同加樣孔是否出現(xiàn)特異峰型。

1.4 COVID-19 康復(fù)者恢復(fù)期血漿中病原體檢測(cè)方法的驗(yàn)證

1.4.1 專屬性

1.4.1.1 交叉試驗(yàn) 為確定本試劑盒檢測(cè)多重病原體的特異性，分別向已知陽(yáng)性樣本和已知陰性樣本混合加入其他病原體物質(zhì)。使用以下7 種常見病原體進(jìn)行特異性驗(yàn)證：金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌、肺炎克雷伯菌、單純皰疹病毒、柯薩奇病毒A型、柯薩奇病毒B型。

1.4.1.2 干擾試驗(yàn) 為了研究可能在樣本處理過程中引入的或其他可能存在的干擾物質(zhì)對(duì)檢測(cè)的干擾性，向已知陽(yáng)性樣本和已知陰性樣本分別加入以下物質(zhì)進(jìn)行干擾測(cè)試：人纖連蛋白（1%，v／v）、人類基因組DNA（300 ng）、人類血液（1%，v／v）、鹽水噴鼻劑（含防腐劑）（1%，v／v）、保存液（主要為Tricine緩沖液）。

1.4.2 重復(fù)性 對(duì)該試劑盒自帶的陽(yáng)性對(duì)照及陰性對(duì)照，由同一檢測(cè)人員進(jìn)行6 次獨(dú)立重復(fù)檢測(cè)，確認(rèn)該方法在相同檢測(cè)條件下，陽(yáng)性對(duì)照4 種病原體、陰性對(duì)照IC以及擴(kuò)增質(zhì)控（amplification quality control，AC）1和2 的Tm 值，連續(xù)多次檢測(cè)所得結(jié)果之間的一致性是否符合要求。檢測(cè)要求：陽(yáng)性對(duì)照4種病原體Tm的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relativestandard deviation，RSD）應(yīng) ≤15%，陰性對(duì)照IC及AC1、AC2 Tm值的RSD應(yīng)≤15%。

1.4.3 中間精密度 確認(rèn)不同檢測(cè)人員、不同時(shí)間，在相同檢測(cè)條件下，陽(yáng)性對(duì)照4 種病原體、陰性對(duì)照IC以及AC1和AC2的Tm值，連續(xù)多次檢測(cè)所得結(jié)果之間的一致性是否符合要求。檢測(cè)要求：陽(yáng)性對(duì)照Tm 的RSD應(yīng) ≤ 20%，陰性對(duì)照IC 及AC1、AC2 Tm 的RSD應(yīng)≤20%。

1.4.4 檢測(cè)限 將病原體標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行高、中、低梯度系列稀釋，qRT-PCR 進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)濃度梯度重復(fù)5 次，每個(gè)濃度梯度樣本陽(yáng)性率需符合80%，如陽(yáng)性率不符合要求，重新稀釋再次進(jìn)行檢測(cè)，反復(fù)摸索出最低濃度水平。確定目標(biāo)濃度范圍后，qRT-PCR 檢測(cè)重復(fù)20 次，陽(yáng)性率需≥90%，最終確定目標(biāo)濃度，再在此濃度水平通過數(shù)字PCR 進(jìn)行滴度測(cè)試，確定最低檢測(cè)限。具體流程見圖1。

圖1 檢測(cè)限流程圖Fig.1 Flow chart of LOD

1.5 方法的適用性檢測(cè) 采用驗(yàn)證后的方法檢測(cè)50份COVID-19康復(fù)者恢復(fù)期血漿樣本，評(píng)估該方法用于COVID-19 康復(fù)者血漿中多重病原體核酸檢測(cè)的適用性。

1.6 結(jié)果判讀 不同病原體熔解溫度Tm 值恒定且可預(yù)測(cè)，根據(jù)單管多重呼吸道病原體核酸檢測(cè)試劑盒說明書及《新型冠狀病毒肺炎康復(fù)者恢復(fù)期血漿實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)質(zhì)量控制要求》進(jìn)行判讀，見表1。

表1 病原體Tm值（℃）Tab.1 Tm values of pathogens（℃）

2 結(jié)果

2.1 方法的驗(yàn)證

2.1.1 專屬性

2.1.1.1 交叉試驗(yàn) 已知陽(yáng)性樣本檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，已知陰性樣本檢測(cè)結(jié)果為陰性，陽(yáng)性樣本和陰性樣本均未檢測(cè)到金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌、肺炎克雷伯菌、單純皰疹病毒、柯薩奇病毒A 型和柯薩奇病毒B 型，以上7種病原體均不在檢測(cè)范圍內(nèi)，對(duì)檢測(cè)無(wú)影響。

2.1.1.2 干擾試驗(yàn) 已知陽(yáng)性樣本檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，已知陰性樣本檢測(cè)結(jié)果為陰性，人纖連蛋白（1%，v／v）、人類基因組DNA（300 ng）、人類血液（1%，v／v）、鹽水噴鼻劑（含防腐劑）（1%，v／v）、保存液對(duì)檢測(cè)無(wú)干擾。

2.1.2 重復(fù)性 陽(yáng)性對(duì)照4 種病原體在反應(yīng)體系1和反應(yīng)體系 2 ROX 通道及 Cy5 通道 Tm 值的RSD分別為0.07%、0.14%、0.07%、0.14%，均 ≤15%，符合檢測(cè)要求，見表2；陰性對(duì)照IC 在反應(yīng)體系1 和反應(yīng)體系 2 FAM 通道 Tm 值的RSD均為 0.07%，AC1 和AC2 Tm 值 的RSD分 別 為 0.01% 和 0.14%，均 ≤15%，符合檢測(cè)要求，且在ROX 通道和Cy5 通道無(wú)陽(yáng)性峰出現(xiàn)，見表3，系統(tǒng)對(duì)照均符合要求。

表2 陽(yáng)性對(duì)照重復(fù)性試驗(yàn)的退火溫度（℃）Tab.2 Annealing temperatures of positive control reproducibility test（℃）

表3 陰性對(duì)照重復(fù)性試驗(yàn)的退火溫度（℃）Tab.3 Annealing temperatures of negative control reproducibility test（℃）

2.1.3 中間精密度 實(shí)驗(yàn)員A 和B 于不同時(shí)間進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性對(duì)照4種病原體在反應(yīng)體系1和2 ROX 通道及Cy5 通道Tm 值的RSD分別為0.20%和0.22%，陰性對(duì)照在Cy5 通道Ct的RSD為1.9%，均 ≤20%，見表4；陰性對(duì)照IC 在反應(yīng)體系1 和2 FAM 通道Tm值的RSD分別為 0.11% 和 0.10%，AC1 和 AC2 Tm 值的RSD分別為0.10%和0.22%，均≤20%，見表5，以上系統(tǒng)對(duì)照均符合要求。

表4 陽(yáng)性對(duì)照中間精密度試驗(yàn)的退火溫度（℃）Tab.4 Annealing temperatures of positive control intermediate precision test（℃）

表5 陰性對(duì)照中間精密度試驗(yàn)的退火溫度（℃）Tab.5 Annealing temperatures of negative control intermediate precision test（℃）

2.1.4 檢測(cè)限 本方法可檢測(cè)22 種病原體，各病原體的最低檢測(cè)限見表6。

表6 22種病原體的最低檢測(cè)限Tab.6 Minimum LOD of 22 pathogens

2.2 方法的適用性 50 份COVID-19 康復(fù)者恢復(fù)期血漿樣本檢測(cè)結(jié)果均為陰性，未出現(xiàn)特異峰形，未檢出病原體，見圖2。

圖2 COVID-19康復(fù)者恢復(fù)期血漿病原體檢測(cè)性能確認(rèn)Fig.2 Detection performance of plasma pathogen of CPs with COVID-19

3 討論

呼吸道感染大多由病毒感染引起［6］，如常見呼吸道合胞病毒、腺病毒、流感病毒、副流感病毒、鼻病毒，此外肺炎支原體等也是常見的引起呼吸道疾病的病原體［7］。大多呼吸道病原體臨床指癥類似，僅根據(jù)臨床癥狀很難做出準(zhǔn)確的診斷，必須進(jìn)行病原學(xué)診斷以明確病原體。針對(duì)呼吸道病原體有多種檢測(cè)手段，包括病原體培養(yǎng)、酶聯(lián)免疫法和血清中和試驗(yàn)等［8-10］。病原體培養(yǎng)雖有“金標(biāo)準(zhǔn)”之稱，但其技術(shù)復(fù)雜、費(fèi)時(shí)長(zhǎng)，不適合用于早期診斷；酶聯(lián)免疫法雖然操作簡(jiǎn)便，但其靈敏度和特異性變化較大，易出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性，以上檢測(cè)手段耗時(shí)、操作難度大、無(wú)法標(biāo)準(zhǔn)化，不易廣泛開展［9-10］。多重 PCR 作為一種新型的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，具有高效、快捷、特異性和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，能夠同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段，克服了普通PCR 只能擴(kuò)增一種病原體的缺點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)多種病原微生物同時(shí)檢測(cè)［11-12］。

本研究采用多重PCR 結(jié)合熔解曲線分析不同病原體，首先第1 步PCR 富集樣本中靶標(biāo)核酸，第2 步PCR 擴(kuò)增病原體特異引物區(qū)域，與病原體探針結(jié)合，通過熔解曲線熔解溫度Tm 值鑒定不同病原體。由于血漿樣本較黏稠不易提取核酸，本研究將蛋白酶K 使用量增至 30 μL，洗脫試劑增至600 μL，并結(jié)合試劑盒要求，在核酸提取階段加入IC，可準(zhǔn)確監(jiān)控提取和PCR 抑制，當(dāng)存在強(qiáng)感染或多重感染時(shí)，可能無(wú)IC 溶解曲線，因?yàn)榇蠖鄶?shù)試劑優(yōu)先與樣品中核酸提取物反應(yīng)。第2 步擴(kuò)增反應(yīng)緩沖液1 和2 中帶有特異擴(kuò)增質(zhì)控AC1 和AC2，可有效監(jiān)控第2 步PCR 反應(yīng)。同時(shí)設(shè)有陽(yáng)性質(zhì)控、陰性質(zhì)控及空白質(zhì)控，可監(jiān)測(cè)整個(gè)擴(kuò)增過程，空白質(zhì)控可檢查擴(kuò)增反應(yīng)是否存在交叉污染及環(huán)境污染。本研究結(jié)果證實(shí)，該方法專屬性強(qiáng)、穩(wěn)定可靠、重復(fù)性好，適用于COVID-19康復(fù)者恢復(fù)期血漿中多重病原體檢測(cè)。

目前臨床用血或血液制品生產(chǎn)用原料血漿實(shí)行檢疫期管理，在酶聯(lián)免疫吸咐法基礎(chǔ)上增加病毒核酸擴(kuò)增法檢測(cè)血漿樣本HIV、HBV 和HCV，時(shí)限為自血漿采集之日起不少于60 d，核酸檢測(cè)（nucleic acid testing，NAT）比ELISA 檢測(cè)平均縮短9 d（20%）、59 d（80%）、11 d（50%），可顯著縮短HIV、HBV和HCV的血清學(xué)檢測(cè)窗口期［13］，同時(shí)能有效檢出病毒抗體或抗原檢測(cè)陰性的慢性或隱匿攜帶者，免疫靜默以及變異株病毒感染者，從而降低血液制品病毒污染的風(fēng)險(xiǎn)［14］。血液和血液制品常作為藥物來拯救生命，除了血液常規(guī)篩查的4種病原體（HIV、HBV、HCV 和梅毒）外，在合格的血漿中仍可能存在其他病原體殘余威脅血液安全，并可能通過輸血傳播疾病，如細(xì)小病毒 B19［15］、HAV［16］、HEV［17］、人巨細(xì)胞病毒［18］、單純性皰疹病毒［19］以及登革熱病毒［20］等，目前，《中國(guó)藥典》三部（2020 版）未將以上病原體納入生產(chǎn)用人血漿常規(guī)篩查項(xiàng)目［21］，《歐洲藥典》規(guī)定合并血漿需進(jìn)行HAV 及細(xì)小病毒B19 檢測(cè)，且細(xì)小病毒含量不得高于10.0 IU／μL［22］?；谖覈?guó)獻(xiàn)血漿者與血液制品安全性的系統(tǒng)研究，鼓勵(lì)相關(guān)企業(yè)及科研機(jī)構(gòu)盡快開發(fā)B19 DNA 檢測(cè)的商業(yè)化血源性篩查試劑，在此基礎(chǔ)上參照國(guó)外的風(fēng)險(xiǎn)控制策略，逐步建立和完善我國(guó)相關(guān)技術(shù)要求，以最大限度地降低和消除血液制品B19以及其他相關(guān)病毒污染及傳播風(fēng)險(xiǎn)。

本研究中COVID-19 康復(fù)者恢復(fù)期血漿在常規(guī)血漿篩查酶聯(lián)免疫吸附法和核酸檢測(cè)的基礎(chǔ)上，同時(shí)進(jìn)行新冠病毒核酸檢測(cè)［23-24］以及22種呼吸道病原體篩查，可有效排除常規(guī)血液傳播疾病的感染，以及新冠病毒和呼吸道病原體感染的風(fēng)險(xiǎn)，充分保證COVID-19 康復(fù)者恢復(fù)期血漿的安全性，為COVID-19康復(fù)者恢復(fù)期血漿用于臨床重癥或危重癥患者治療提供質(zhì)量保證。多重PCR 結(jié)合熔解曲線分析病原體，具有較高的檢測(cè)特異性及靈敏度，檢測(cè)通量高，可充分滿足COVID-19 康復(fù)者恢復(fù)期血漿的質(zhì)控要求［15］。多重PCR 技術(shù)與環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loopmediated isothermal amplification，LAMP）［25］、基因芯片［26］等實(shí)驗(yàn)技術(shù)結(jié)合，可進(jìn)一步提高病原體檢測(cè)的靈敏性、可重復(fù)性，實(shí)現(xiàn)高通量病原體檢測(cè)、混合感染多種微生物的準(zhǔn)確檢測(cè)，可為臨床病原體鑒別診斷、基因分型、血液篩查及血液制品質(zhì)量監(jiān)控等領(lǐng)域的研究提供新的思路，具有較大發(fā)展前景。

志謝誠(chéng)摯感謝上海捷諾生物科技有限公司提供技術(shù)指導(dǎo)