朱圣嬰，曹嘉煒，徐進，，陳晨輝，郭清城 ，李軍，張大鵬 ，，錢衛(wèi)珠 ，，侯盛 ，，郭懷祖 ，

1.上海張江生物技術(shù)有限公司抗體藥物與靶向治療國家重點實驗室，上海 201203；2.國家藥品監(jiān)督管理局治療類單抗質(zhì)量控制重點實驗室，上海 201203；3.聊城大學(xué)藥學(xué)院，山東 聊城 252059；4.泰州邁博太科藥業(yè)有限公司，江蘇 泰州 225316

單克隆抗體（簡稱單抗）藥物以其特異性高、療效確切、半衰期長等特點，在惡性腫瘤以及自身免疫疾病治療中占有越來越重要的地位［1］。但單抗的穩(wěn)定性較差，在儲存或使用過程中易發(fā)生聚集［2］，因此需在其制劑處方中加入賦形劑、表面活性劑等保護劑以抑制其聚集體的產(chǎn)生［3］。目前已上市的單抗藥物中使用較多的表面活性劑是聚山梨酯（polysorbate，PS）20 和PS80，其主要區(qū)別在于脂肪酸側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)、長度及飽和度不同導(dǎo)致的其與蛋白親和力的不同［4-5］。一般認(rèn)為PS20 的穩(wěn)定性更好，抑制聚集體的效果更柔和［6］，PS80 的增溶性更強［7］，因此，針對不同的單抗藥物，其保護效果可能呈現(xiàn)一定的差異性。此外，PS本身在高溫或光照等惡劣條件下易被氧化形成某些過氧化物［8-9］，而這些過氧化物又會氧化單抗的某些氨基酸殘基導(dǎo)致其穩(wěn)定性下降［10］，因此，需對PS的添加量進行合理設(shè)計。針對于PS影響單抗穩(wěn)定性的研究已成為熱點，特別是其對于單抗制劑中不溶性微粒的形成機制研究［11-12］，但PS 種類間的對比研究仍較少，不同種類PS 對于單抗穩(wěn)定性影響的差異仍不明確，因此，有必要針對性地進行相關(guān)研究，明確不同種類、不同含量PS對單抗穩(wěn)定性影響的差異。

本研究以多種不同類型的單抗作為模型蛋白，分別在其制劑處方基礎(chǔ)上添加不同種類或含量的PS，并進行各種影響因素研究，通過檢測各影響因素條件下蛋白聚集體、電荷異質(zhì)體和不溶性微粒等質(zhì)量屬性的變化，評估不同種類、不同含量的PS 對于單抗藥物穩(wěn)定性的影響差異，從而為PS 在單抗藥物制劑處方中的研究應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 單抗 單抗A（mAbA，IgG1前抗體藥物）、單抗B（mAbB，IgG1 單抗）和單抗 C（mAbC，IgG1 單抗，F(xiàn)c N297A突變）均由上海張江生物技術(shù)有限公司研制。

1.2 主要試劑及儀器 磷酸二氫鈉購自默克化工技術(shù)（上海）有限公司；磷酸氫二鈉購自成都華邑藥用輔料制造有限責(zé)任公司；氯化鈉購自江蘇省勤奮藥業(yè)有限公司；CX-1 pH Gradient Buffer A 和CX-1 pH Gradient Buffer B 購自美國 Thermo Fisher 公司；PS20和PS80購自南京威爾藥業(yè)集團股份有限公司；30 KD超濾膜包和0.2 μm 針式濾器購自美國Millipore 公司；MS3002S／01 型電子天平和 220-K-CN 型 pH 計購自美國梅特勒托利多公司；PALL FS010K10 型臺式超濾系統(tǒng)購自美國Pall公司；THZ-C-1型全溫振蕩器購自蘇州培英實驗設(shè)備有限公司；ICH 110 L 恒溫培養(yǎng)箱和ICH 750 L 恒溫培養(yǎng)箱購自德國美墨爾特公司；Waters ACQUITY UPLC 高效液相色譜儀和Waters SEC 200?色譜柱（1.7 μm，4.6 mm×150 mm）購自美國Waters公司；Thermo MABPac SCX-10（10 μm，4 mm × 150 mm）購自美國Thermo Fisher 公司；GWF-8JA型微粒分析儀購自天津天河分析儀器有限公司。

1.3 PS 種類對單抗穩(wěn)定性影響的檢測 使用30 KD超濾膜包分別將mAbA、mAbB 及mAbC 置換至各自特定的制劑處方中，并按表1 添加不同種類及指定濃度的PS 以完成不同處方條件的配制，最后使用0.2 μm 濾器對各處方條件下的樣品進行過濾后分裝至離心管中，并進行高溫及振蕩等影響因素試驗，實施方式及檢測方法見表2。每個條件每個取樣點的樣品均設(shè)3 個復(fù)孔，所有檢測數(shù)據(jù)均取其平均值后繪制柱狀圖。

表1 mAbA、mAbB及mAbC的各處方條件Tab.1 Formulations of mAbA，mAbB and mAbC

1.4 PS 含量對單抗穩(wěn)定性影響的檢測 使用30 KD超濾膜包將mAbC 置換至特定的制劑處方中，加入PS20 使其終濃度分別為 0.025、0.05 及 0.5 g／L，以完成3 種處方條件的配制，最后使用0.2 μm 濾器對各處方條件下的樣品過濾后分裝至離心管中進行高溫、光照及振蕩等影響因素試驗，實施方式及檢測方法見表2。每個條件每個取樣點的樣品均設(shè)3 個復(fù)孔，所有檢測數(shù)據(jù)均取其平均值后繪制柱狀圖。

表2 各影響因素試驗及檢測方法Tab.2 Test and detection methods of various influencing factors

1.5 指標(biāo)檢測

1.5.1 尺寸排阻色譜法（SEC-HPLC）純度分析 色譜柱：Waters SEC 200? column（1.7μm，4.6 mm ×150 mm）；流動相：200 mmol／L磷酸鹽緩沖液，pH 7.0；流速：0.2 mL／min；上樣量：50 μg；柱溫：25 ℃；樣品池溫度：5 ℃；檢測波長：280 nm。使用Waters ACQUITY UPLC 高效液相色譜儀對試驗結(jié)果進行數(shù)據(jù)處理，用面積歸一化法計算純度。

1.5.2 離子交換色譜法（IEX-HPLC）純度分析 色譜柱：Thermo MABPac SCX-10（10 μm，4 mm × 150 mm）；mAbA 和 mAbB 所用流動相 A：125 mmol／L 磷酸二氫鈉，流動相B：125 mmol／L磷酸氫二鈉，流動相C：1 mol／L 氯化鈉，流動相 D：超純水；mAbC 所用流動相A：CX-1 pH Gradient Buffer A，pH 5.8，流動相B：CX-1 pH Gradient Buffer B，pH 10.2；流速：0.5 mL／min；上樣量：50 μg；檢測波長：280 nm。使用Waters ACQUITY UPLC 高效液相色譜儀對試驗結(jié)果進行數(shù)據(jù)處理，用面積歸一化法計算純度。

1.5.3 不溶性微粒檢測 取合并后總體積不少于25 mL的供試品，置于檢測容器中，靜置20 min后檢測。直接將檢測容器置于微粒分析儀的取樣器上，開啟攪拌，使溶液混勻，由儀器直接抽取適量溶液。測定4次，每次抽取量不少于5 mL。第1 次數(shù)據(jù)不計，取后續(xù)測定結(jié)果的平均值，打印原始數(shù)據(jù)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用JMP13.2.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組之間比較采用t檢驗，多組之間比較采用方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PS種類對單抗穩(wěn)定性的影響

2.1.1 SEC-HPLC mAbA 在經(jīng)歷高溫及振蕩后，其聚集體含量呈顯著上升趨勢，穩(wěn)定性較差，高溫條件下PS80和PS20組的聚集體含量分別為0.82%和0.81%，振蕩條件下聚集體含量分別為0.51%和0.50%，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（t分別為 1.512 和 0.522，P分別為 0.207 和 0.631）。相比較而言，mAbB 和 mAbC 呈現(xiàn)出較優(yōu)的穩(wěn)定性，其聚集體含量均無太大改變，且mAbB 在高溫條件下PS80 及PS20 組的聚集體含量分別為0.49%和0.52%，振蕩條件下的聚集體含量分別為0.48%和0.49%，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（t分別 為 -1.765 和 0.632，P分別為 0.167 和 0.567）。mAbC 在高溫條件下PS80 及PS20 組的聚集體含量分別為0.83%和0.87%，振蕩條件下的聚集體含量分別為0.89%和0.91%，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（t分別為-1.037 和-1.809，P分別為 0.407 和 0.150）。見圖1。

圖1 不同影響因素試驗下各條件組SEC 聚集體的變化趨勢圖Fig.1 Change trend diagram of SEC aggregates in groups with various conditions in test under different influencing factors

2.1.2 IEX-HPLC 相較于振蕩條件，3 種單抗對于高溫條件的影響均較為敏感，3 者在經(jīng)歷高溫后，其IEX 主峰含量均呈不同程度的遞減趨勢（主峰大部分轉(zhuǎn)化為酸性變異體），而在經(jīng)振蕩后，其主峰含量均無顯著變化。mAbA 在高溫條件下PS80 及PS20組的主峰含量分別為12.7%和12.6%，振蕩條件下的主峰含量分別為21.9%和21.7%，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（t分別為 0.265 和 1.095，P分別為 0.808 和0.344）。mAbB 在高溫條件下 PS80 及 PS20 組的主峰含量分別為58.5%和58.3%，振蕩條件下的主峰含量分別為73.3%和73.1%，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（t分別為 1.581 和 0.318，P分別為 0.200 和 0.767）。mAbC 在高溫條件下PS80 及PS20 組的主峰含量分別為62.6%和62.7%，振蕩條件下的主峰含量分別為74.0%和74.1%，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（t分別為-1.000和-1.225，P分別為0.387和0.288）。見圖2。

圖2 不同影響因素試驗下各條件組IEX 主峰的變化趨勢圖Fig.2 Change trend diagram of main peak of IEX in groups with various conditions in test under different influencing factors

2.1.3 不溶性微粒 針對于mAbA，PS80 及PS20 處理的樣品在振蕩后其直徑≥10 μm 的不溶性微粒個數(shù)分別為6.9和6.3個／mL，直徑≥25 μm的不溶性微粒個數(shù)分別為1.1 和1.4 個／mL，兩者差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（≥ 10 μm：t=0.593，P=0.587，≥ 25 μm：t= -0.368，P= 0.733）；針對于 mAbB，PS80 及 PS20處理的樣品在振蕩后其直徑≥10 μm 的不溶性微粒個數(shù)分別為7.8 和11.3 個／mL，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t= -3.137，P= 0.046），直徑 ≥ 25 μm 的不溶性微粒個數(shù)分別為2.4 和3.6 個／mL，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t= -1.108，P= 0.331），即PS80 對于抑制mAbB中直徑≥10 μm 的不溶性微粒增加的效果更為顯著；針對于mAbC，PS80及PS20處理的樣品在振蕩后其直徑≥10 μm 的不溶性微粒個數(shù)分別為13.7 和7.9 個／mL，直徑 ≥ 25 μm 的不溶性微粒個數(shù)分別為3.3 和1.1 個／mL，兩者差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（≥10 μm：t=4.669，P=0.037，≥ 25 μm：t=6.128，P=0.022），即PS20 對于抑制mAbC 中不溶性微粒增加的效果更為顯著。見圖3。上述結(jié)果也表明，不同種類的PS 對于抑制不同類型單抗不溶性微粒增加的效果具有一定差異性。

圖3 振蕩試驗下各條件組 ≥ 10 μm（A）和 ≥ 25 μm（B）不溶性微粒個數(shù)比較Fig.3 Comparison of number of insoluble particles ≥ 10 μm（A）and ≥ 25 μm（B）in groups with various conditions after shaking

2.2 PS含量對單抗穩(wěn)定性的影響

2.2.1 SEC-HPLC 0.025、0.05 及 0.5 g／L PS20 濃度下的mAbC 在經(jīng)歷高溫、光照及振蕩后，其聚集體含量均呈上升趨勢，高溫后生成的聚集體含量分別為0.77%、0.76%和0.80%，三者差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F= 1.444，P= 0.308）；光照后生成的聚集體含量分別為0.79%、0.76%和0.77%，三者差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F= 0.536，P= 0.611）；振蕩后生成的聚集體含量均為0.90%，三者差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=0.071，P=0.932）。見圖4。表明PS20濃度在0.025 ～0.5 g／L 范圍內(nèi)對于抑制mAbC 聚集體生成的效果趨于一致。

圖4 不同PS20濃度下mAbC的SEC聚集體變化趨勢圖Fig.4 Change trend diagram of aggregates of SEC of mAbC under different concentrations of PS20

2.2.2 IEX-HPLC 0.025、0.05 及 0.5 g／L PS20 濃度下的mAbC在經(jīng)歷振蕩后，其IEX 主峰均無顯著變化；而在經(jīng)歷高溫及光照后，3 種PS20 濃度下的樣品其主峰含量均呈遞減趨勢（主峰大部分轉(zhuǎn)化為酸性變異體）。高溫后生成的主峰含量分別為60.7%、62.7%和62.4%，即0.025 g／L PS20濃度下的mAbC與0.05 及0.5 g／L PS20 組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t分別為15.491和13.168，P分別為0.000和0.001），0.025 g／L PS20組其主峰含量相對較低。光照后生成的主峰含量分別為53.7%、55.4%和53.7%，三者差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F= 3.757，P= 0.088）；振蕩后生成的主峰含量分別為74.2%、74.0%和74.1%，三者差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=0.867，P=0.467）。見圖5。表明PS20濃度在0.025 ～0.5 g／L范圍內(nèi)對于mAbC中電荷異質(zhì)體的影響基本一致，但較低的PS20 濃度也可能會影響該單抗主峰的含量。

圖5 不同PS20濃度下mAbC的IEX主峰變化趨勢圖Fig.5 Change trend diagram of main peak of IEX of mAbC under different concentrations of PS20

2.2.3 不溶性微粒 0.025、0.05及0.5 g／L PS20濃度下的mAbC 在經(jīng)歷振蕩后，其直徑 ≥10 μm 的不溶性微粒個數(shù)分別為 225.5、7.9 和 17.2 個／mL，0.025 g／L PS20 濃度與其他2 個濃度之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t分別為-36.235 和-32.727，P分別為0.001和0.000）；直徑 ≥ 25 μm 的不溶性微粒個數(shù)分別為 13.7、1.1 和 7.8 個／mL，3 種濃度兩兩之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t分別為-30.660、-4.556和5.502，P分別為 0.001、0.031 和 0.031）。見圖 6。mAbC 在0.025 g／L PS20 濃度下，其不溶性微粒的生成數(shù)量最多；在PS20 濃度為0.05 g／L 時，其不溶性微粒的生成數(shù)量最少。表明0.025 g／L PS20 對于抑制不溶性微粒增加的效果有限，而隨著PS20 濃度上升，其抑制效果逐漸增強，當(dāng)濃度達0.5g／L 時，其作用趨于飽和。

圖6 不同PS20 濃度下mAbC 中 ≥ 10 μm（A）和 ≥ 25 μm（B）不溶性微粒個數(shù)比較Fig.6 Comparison of number of insoluble particles ≥ 10 μm（A）and ≥ 25 μm（B）of mAbC under different concentrations of PS20

3 討論

為探究PS 種類及含量對于不同類型單抗類藥物穩(wěn)定性影響的差異，本研究以對于單抗類藥物具有一定代表性的幾種不同類型的抗體作為模型蛋白，并在每種單抗制劑處方基礎(chǔ)上加入不同種類或不同含量的PS 以進行相關(guān)質(zhì)量參數(shù)的比較。PS 種類的研究結(jié)果顯示，mAbA 相較于其他2 種單抗，對于外界影響因素的作用更為敏感，PS80或PS20 的加入并不能很好地改善其純度大幅降低的情況，且兩種PS 在抑制其聚集體及不溶性微粒形成的效果方面相似，抑制聚集體形成的程度也有限，因此，為進一步提高mAbA 的穩(wěn)定性，可能還需對制劑處方中的其他輔料進行篩選優(yōu)化。針對于mAbB 及mAbC，制劑處方中添加不同種類的PS 對于抑制單抗聚集體形成及維持抗體電荷異質(zhì)體方面起到了一定的作用，且二者所起的作用無顯著性差異，而在不溶性微粒的抑制效果方面，mAbB 在添加PS80 的處方中其不溶性微粒形成數(shù)目更少，相反mAbC 更適合添加PS20。上述研究結(jié)果也表明，針對于不同類型的單抗，PS的保護效果具有一定的相似性，但在不溶性微粒指標(biāo)上呈現(xiàn)一定的差異，因此，在設(shè)計單抗藥物的制劑處方時，可基于這些共性和差異，對PS 的種類進行篩選評估，從而挑選出最適合于該單抗的PS種類。

PS 含量研究結(jié)果顯示，當(dāng)PS20 濃度在0.025 ～0.5 g／L 范圍內(nèi)時，mAbC 在聚集體含量上的變化趨于一致，即PS20 濃度在一個較寬的范圍內(nèi)對抑制聚集體增加呈相似的效用。但對于mAbC 的其他特性，如電荷變異體的指標(biāo)方面，PS20濃度過低將導(dǎo)致電荷變異體中主峰的含量下降。此外，過低的PS20濃度還將無法有效抑制制劑中不溶性微粒數(shù)目的增加，而隨著PS20 濃度上升，其抑制作用也將逐步增強并最終達到飽和。該研究結(jié)果也表明，PS 含量的多少將直接影響其保護單抗的能力，過低濃度的PS其保護作用有限，而高濃度的PS 又無法進一步提升其保護性能，且會增加PS 降解后引入相關(guān)雜質(zhì)從而造成蛋白免疫原性增強及穩(wěn)定性降低的風(fēng)險，因此，單抗的制劑處方設(shè)計中同樣需關(guān)注PS的添加量。

PS 對于單抗類藥物穩(wěn)定性的影響，涉及到不同的層面及深度［13-15］，本研究僅針對其種類及含量進行了相關(guān)的考察和評估，旨在說明不同類型的單抗其對于不同種類、不同含量PS 的敏感度各不相同，因此在設(shè)計單抗的制劑處方時需對PS 種類及含量進行全面的篩選和比較。而隨著PS 在單抗藥物制劑中的應(yīng)用越來越廣泛，如何正確合理地選擇PS 仍是未來單抗藥物制劑處方開發(fā)的重要課題［16］，對于其如何影響單抗藥物穩(wěn)定性的機理也需進行更深入的研究。