楊斯琴，王平，查干哈斯，石順利

1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)動物科技學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000；2.通遼京緣種牛繁育有限責(zé)任公司，內(nèi)蒙古 通遼 028000；3.通遼市農(nóng)牧科學(xué)研究所，內(nèi)蒙古 通遼 028000；4.通遼市畜牧業(yè)發(fā)展中心，內(nèi)蒙古 通遼 028000

大腸埃希菌（E.coli）是人和動物腸道菌群的重要組成部分，通常對宿主無害，但也可能是潛在的致病因子［1］。某些E. coli對人和動物具有致病性，稱為致病性E.coli，是人獸共患病的病原菌之一，可引起大腸埃希菌病，從而使宿主免疫功能減弱或造成養(yǎng)殖業(yè)重大經(jīng)濟(jì)損失［2］。致病性E.coli主要以家畜、家禽及其制品為主要傳播載體，可引起人類食物中毒、泌尿道感染、腦膜炎和敗血癥，甚至導(dǎo)致死亡［3］。

根據(jù) CLERMONT 等［4］建立的分群方法，可將E.coli分為A、B1、B2 和D 4 個系統(tǒng)群。研究表明，在腸外E. coli中 B2 系統(tǒng)群占優(yōu)勢［5］。另一項(xiàng)研究表明，B2 和D 系統(tǒng)群的菌株比A 和B1系統(tǒng)群的菌株具有更多與腸外致病性E. coli（extraintestinal pathogenicE. coli，ExPEC）相關(guān)的毒力基因［6］。此外，E. coli的致病性與其攜帶的毒力基因存在一定的相關(guān)性。目前，在牛源致病性E.coli中發(fā)現(xiàn)了多種毒力基因，如黏附素、編碼血凝素、鐵攝取系統(tǒng)、毒素及黏附蛋白等［7］。因此，毒力基因的檢測可對E.coli潛在的致病性做出前瞻性判定。

臨床上，大腸埃希菌病的治療以抗菌藥物為主。抗菌藥物的使用大大提高了動物的生產(chǎn)能力，但隨著抗菌藥物在畜牧業(yè)中的過度使用，其益處已被E. coli日趨嚴(yán)重的耐藥性及多重耐藥現(xiàn)象削弱，嚴(yán)重影響了畜牧業(yè)的健康發(fā)展，同時對畜產(chǎn)品和公共衛(wèi)生安全造成極大的危害［8］。有研究表明，動物可通過食物鏈或直接接觸傳播耐藥性，如動物源耐藥基因可通過食物鏈傳給人類或擴(kuò)散至環(huán)境中［9］。因此，E. coli耐藥水平的增加間接給人類健康帶來威脅。本研究對內(nèi)蒙古通遼地區(qū)犢牛腹瀉病例分離鑒定出的82 株致病性E. coli進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分群及13 種抗菌藥物的敏感性測定，并采用PCR 技術(shù)檢測了13 種毒力基因攜帶情況及12 種耐藥基因的分布情況，以期為內(nèi)蒙古通遼地區(qū)犢牛大腸埃希菌病的防控和臨床用藥提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 菌株 82 株致病性E. coli分離自內(nèi)蒙古通遼周邊規(guī)?；膛龈篂a犢牛病例糞便樣品。

1.2 主要試劑 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和營養(yǎng)肉湯購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司；瓊脂糖、2 × Tap PCR MasterMix、核酸染料、細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒、DL2000 DNA marker 購自天根生化科技（北京）有限公司；藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.3 藥敏試驗(yàn) 參照臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）［10］標(biāo)準(zhǔn)，采用紙片擴(kuò)散法（K-B 法）對82 株致病性E.coli進(jìn)行13 種抗菌藥物敏感性試驗(yàn)。選用E.coliATCC25922作為藥敏試驗(yàn)的質(zhì)控菌。

1.4 分離菌系統(tǒng)進(jìn)化分群鑒定 CLERMONT 等［4］針對E. coli設(shè)計(jì)了一種新型種群分型方法，也稱系統(tǒng)進(jìn)化分群鑒定方法，即將不同種群E.coli的3個基因chuA、yjaA和TspE4.C2采用PCR方法擴(kuò)增進(jìn)行分群，根據(jù) 3 種基因擴(kuò)增結(jié)果，可將E. coli分為 A（chuA和TspE4. C2均為陰性）、B1（chuA為陰性而TspE4. C2為陽性）、B2（chuA和yjaA均為陽性）和D（chuA為陽性而yjaA為陰性）群。參考該方法，以提取的E.coli分離株 DNA 為模板，PCR 法擴(kuò)增chuA、yjaA和TspE4.C2基因，判定分離株的系統(tǒng)進(jìn)化群。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸 30 s，共 35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。引物序列見表1，引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

表1 E.coli系統(tǒng)進(jìn)化分群引物Tab.1 Primers used for phylogenetic groups of E.coli

1.5 毒力基因及耐藥基因檢測 參考文獻(xiàn)［1、5、8、11-14］設(shè)計(jì)并合成13 種毒力基因引物（見表2）和12 種耐藥基因引物（見表3），引物由日本TaKaRa 公司合成。13 種毒力基因包括血清抗性蛋白（iss）、P菌毛黏附素（papC）、鐵獲得系統(tǒng)（iucD）、自主轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（tsh）、HPI 毒力島（irp2、fyuA）、Lee 毒力島（eaeA）、毒素（astA）、志賀毒素（stx1、stx2）、不耐熱性腸毒素（LT1）、耐熱性腸毒素（STb）、溶血素基因（hlyA）；12種耐藥基因包括β-內(nèi)酰胺類（blaTEM、blaSHV、blaCTX-M）、四環(huán)素類（tetA、tetB、tetD）、氨基糖苷類［aac（3）-Ⅳ、aadB］、喹諾酮類（qnrA、qnrB）和磺胺類（sul1、sul2）。以提取的82 株致病性E.coli的DNA 為模板，對上述13種毒力基因（反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性 50 s，53 ～ 62 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，共 30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min）和12 種耐藥基因（反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性 1 min，54 ～ 65 ℃退火60 ～ 90 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒回收并送博邁德生物技術(shù)有限公司測序，測序結(jié)果采用NCBI-BLAST 比對，鑒定標(biāo)準(zhǔn)按照同源性≥97%判定。

表2 E.coli 13種毒力基因引物Tab.2 Primers used for 13 kinds of virulence genes of E.coli

表3 E.coli 12種耐藥基因引物Tab.3 Primers used for 12 kinds of resistance genes of E.coli

2 結(jié)果

2.1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 結(jié)果顯示，82株致病性E.coli對13 種抗菌藥物的耐藥性普遍較高，其中對四環(huán)素（TE）的耐藥菌株占比最高，為100%；對多西環(huán)素（DO）、阿莫西林（AMC）、氨芐西林（AM）、頭孢喹肟（CEF）、復(fù)方磺胺甲惡唑（SXT）、卡那霉素（K）、阿米卡星（AMI）、鏈霉素（S）和多黏菌素B（PB）的耐藥菌株占比為62. 20% ～97. 56%；而對氧氟沙星（OFL）、慶大霉素（GM）和環(huán)丙沙星（CIP）較為敏感，其敏感菌株占比分別為76.83%、69.51%和51.22%。見表4。多重耐藥統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，全部菌株耐3 種及以上藥物，多重耐藥菌株占比為100%。其中，耐8、9、10和11種抗菌藥物的菌株較多，占比分別為19.51%（16／82）、14. 63%（12／82）、17. 07%（14／82）和13.41%（11／82）；對8 種抗菌藥物耐藥的分離株最多，為19. 51%（16／82）。見圖1。表明，該地區(qū)犢牛腹瀉病例分離的82 株致病性E. coli多重耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，臨床用藥建議進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，選擇敏感性藥物進(jìn)行治療。

圖1 82株致病性E.coli的多重耐藥情況Fig. 1 Multiple drug resistance of 82 pathogenic E. coli isolates

表4 82株致病性E.coli藥敏試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Drug sensitivity test results of 82 pathogenic E.coli isolates

2. 2 系統(tǒng)進(jìn)化分群結(jié)果 利用E. coli分子分群的chuA、yiaA和TspE4. C2基因?qū)?82 株致病性E. coli進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，82株致病性E.coli中有40株（40／82，48. 78%）屬于 A 群，為優(yōu)勢群系；26 株（26／82，31.71%）屬于B1群，12株（12／82，14.63%）屬于B2 群，剩余 4 株（4／82，4. 88%）屬于 D 群。表明分離的82 株致病性E.coli以A+B1 群為主，而B2和D群分離率較低。

2.3 毒力基因檢測結(jié)果 利用PCR 法對82 株致病性E.coli進(jìn)行13種毒力基因擴(kuò)增，結(jié)果顯示，82株致病性E.coli攜帶11 種毒力基因，見圖2，總檢出率為84.6%（11／13）。其中，irp2檢出率最高，為79.27%（65／82），其次為fyuA、eaeA和STb，檢出率分別為63.41%（52／82）、53.66%（44／82）和50%（41／82）；iucD、astA、stx2、hlyA、papC、stx1和iss的檢出率分別為47. 56%（39／82）、46. 34%（38／82）、40. 24%（33／82）、32. 93%（27／82）、26. 83%（22／82）、21. 95%（18／82）和15.85%（13／82）；82 株E.coli均未檢測到毒力基因tsh和LT1。此外，含有7、6、5、4、3和2種毒力基因的菌株分別有6、11、9、16、28和8株；僅含1種毒力基因的菌株有4株。表明該地區(qū)致病性E.coli的毒力基因攜帶情況復(fù)雜，其中毒力基因irp2、fyuA、eaeA和STb的攜帶率較高。

圖2 13種毒力基因的PCR檢測結(jié)果Fig.2 PCR results of 13 virulence genes

2. 4 耐藥基因檢測結(jié)果 采用PCR 法對82 株致病性E. coli進(jìn)行12 種耐藥基因擴(kuò)增，結(jié)果顯示，氨基糖苷類耐藥基因aadB和aac（3）-Ⅳ的檢出率分別為75.6%（67／82）和2.4%（2／82）；四環(huán)素類耐藥基因tetB的檢出率最高，為91.5%（75／82），而tetD和tetA的檢出率分別為70. 7%（58／82）和31. 7%（26／82）；喹諾酮耐藥基因qnrA和qnrB的檢出率分別為43.9%（36／82）和40.2%（33／82）；磺胺類耐藥基因Sul1和Sul2的檢出率較高，分別為86. 6%（71／82）和100%（82／82）；β-內(nèi)酰胺類耐藥基因blaTEM、blaSHV和blaCTX-M的檢出率分別為100%（82／82）、69.5%（57／82）和39%（32／82）。見圖3。表明，12種耐藥基因廣泛分布于該地區(qū)犢牛腹瀉致病性E. coli中。

圖3 82株致病性E.coli的耐藥基因檢出率Fig. 3 Detection rates of resistance genes in 82 pathogenic E.coli isolates

3 討論

E.coli是臨床上分離率較高的菌株［15］，可對多種動物造成感染而出現(xiàn)各種臨床癥狀和病理變化，其發(fā)病率和死亡率較高，給養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。因此，了解并分析內(nèi)蒙古通遼地區(qū)E. coli的系統(tǒng)分群、毒力基因攜帶情況以及耐藥性和耐藥基因分布具有重要意義。本研究對分離的82 株致病性E. coli進(jìn)行了系統(tǒng)分群分析，發(fā)現(xiàn)分離株主要屬于A 群（40／82，48. 78%），B1 群占31. 71%（26／82），而 B2 群和 D 群分離率較低。陳亞強(qiáng)等［16］報(bào)道，重慶地區(qū)禽源E. coli優(yōu)勢系統(tǒng)分群為A 群（48／93，51.61%）；許騰林等［17］報(bào)道，不同動物源ExPEC 中優(yōu)勢系統(tǒng)群為A 群（28／53，52. 8%）。本研究中優(yōu)勢系統(tǒng)群與以上報(bào)道一致。

E. coli的毒力因子種類繁多，這些毒力因子與E. coli的致病性存在一定的相關(guān)性，毒力基因的攜帶在一定程度上可以加強(qiáng)E.coli的致病性［18］。本研究結(jié)果顯示，毒力基因irp2、fyuA、eaeA和STb的檢出率較高，分別為79.27%（65／82）、63.41%（52／82）、53. 66%（44／82）和50%（41／82），其他毒力基因的檢出率低于50%。本研究中irp2和fyuA的檢出率低于賈青輝等［19］和高光平等［20］報(bào)道的該毒力基因的檢出率；而eaeA和STb的檢出率高于劉麗娟等［21］和張金寶等［22］報(bào)道的該毒力基因的檢出率。表明E. coli毒力基因攜帶情況因其不同地區(qū)、不同動物來源而存在差異。根據(jù)毒力基因檢測結(jié)果，認(rèn)為內(nèi)蒙古通遼地區(qū)牛場糞便存在潛在危害，需加強(qiáng)對糞便處理，以免產(chǎn)生威脅公共安全的問題。

研究表明，在人類和動物醫(yī)學(xué)中長期和過度使用抗菌藥物是導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性增加的重要因素［23］。本研究藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離的82株致病性E.coli對13 種抗菌藥物均有不同成程度的耐藥，全部菌株對3種及以上藥物呈現(xiàn)耐藥，主要以8 ～11種耐藥為主。分離株中對四環(huán)素類、β-內(nèi)酰胺類和氨基糖苷類中的卡那霉素（K）、阿米卡星（AMI）、鏈霉素（S）和多黏菌素B（PB）的耐藥菌株均占60%以上，表明抑菌效果不明顯，臨床用藥建議不使用或謹(jǐn)慎使用。82株致病性E.coli對氧氟沙星（OFL）、慶大霉素（GM）和環(huán)丙沙星（CIP）較為敏感，敏感菌株占50%以上，但耐藥性依然存在。因此，在大腸埃希菌性犢牛腹瀉時可選擇該3 種藥物或聯(lián)合用藥。張星星等［24］報(bào)道，新疆犢牛源E. coli表現(xiàn)出嚴(yán)重的多重耐藥現(xiàn)象，主要以3 ～7 種耐藥為主，且對氨芐西林（AM）、鏈霉素（S）和四環(huán)素（TE）的耐藥菌株占比較高，分別為71. 4%、66%和55. 3%。劉勃興等［25］報(bào)道，河北省犢牛腹瀉E. coli多重耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，分離的菌株全部對2 種及以上藥物耐藥，且耐10 種及以上藥物的菌株占34%。表明犢牛源E.coli多重耐藥現(xiàn)象普遍存在，且各個國家及地區(qū)的檢測結(jié)果存在差異，這可能是各個國家、地區(qū)對抗菌藥物的使用情況和飼養(yǎng)管理模式不同導(dǎo)致的。此外，抗生素治療是降低感染致病性E.coli導(dǎo)致的畜禽發(fā)病率和死亡率的主要治療方法，謹(jǐn)慎使用抗菌藥物對保持其在動物及人類治療中的應(yīng)用具有重要意義。

據(jù)研究，耐藥基因是細(xì)菌先天具有的，也可通過質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子等獲得并傳播［26］。E.coli通常攜帶多種耐藥質(zhì)粒，在抗生素選擇壓力下，易將這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)移給其他細(xì)菌，并使其產(chǎn)生耐藥性或耐藥譜變得更廣，且耐藥基因可通過與動物直接接觸或通過畜產(chǎn)品生產(chǎn)鏈或農(nóng)業(yè)中使用動物糞便肥料而間接傳播給人類［27］。本研究中β-內(nèi)酰胺類耐藥基因blaTEM和磺胺類耐藥基因Sul1和Sul2的檢出率較高，分別為100%（82／82）、86.6%（71／82）和100%（82／82）。多數(shù)研究報(bào)道，以上 3 種耐藥基因檢出率均較高［8，28］。表明E.coli易對磺胺類和β-內(nèi)酰胺類藥物產(chǎn)生耐藥性。此外，在不耐藥菌株中也檢測到了氨基糖苷類耐藥基因，因此耐藥性與耐藥基因的相關(guān)性仍需進(jìn)一步研究。耐藥基因檢測結(jié)果的差異可能與不同國家、不同地區(qū)E.coli的不同抗生素壓力所致。

本研究檢測并分析了內(nèi)蒙古通遼地區(qū)犢牛腹瀉致病性E.coli的藥物敏感性、毒力基因和耐藥基因的攜帶情況，結(jié)果顯示，分離株對13種藥物均具有不同程度的耐藥，存在多重耐藥現(xiàn)象，且毒力基因和耐藥基因攜帶情況復(fù)雜，可能對公共衛(wèi)生安全具有潛在危害。因此，應(yīng)規(guī)范使用抗菌藥物，并加強(qiáng)對糞便的處理。