郭冰峰，韓斌，郝一楠，王魁，殷吉祥，李巖，李楠，凌相平，潘若文

華蘭生物疫苗股份有限公司，河南 新鄉(xiāng) 453003

嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory symptom coronavirus 2，SARS-CoV-2）的發(fā)現(xiàn)最早追溯到2019年3月，西班牙巴塞羅那大學(xué)在采集的廢水樣本中檢測出SARS-CoV-2，2020年3月11日，WHO將新型冠狀病毒肺炎（Coronavirus Disease 2019，COVID-19）作為全球性大流行?。?-6］。

SARS-CoV-2屬冠狀病毒科冠狀病毒屬，為包膜病毒，基因組長29 800～29 900 bp，具有冠狀病毒的典型形態(tài)和基因組特征；SARS-CoV-2普遍呈球形，具有多形性，直徑60～140 nm［7-8］。人群普遍易感，特別是中老齡人及嬰幼兒，經(jīng)呼吸道飛沫和密切接觸傳播，以發(fā)熱、干咳、乏力為主要表現(xiàn)；部分患者以嗅覺、味覺減退或喪失等為首發(fā)癥狀，少數(shù)患者伴有鼻塞、流涕、咽痛、結(jié)膜炎、肌痛和腹瀉等癥狀［9-10］。

目前尚無有效治療COVID-19的特效藥，接種疫苗可使人體獲得一定的免疫力［11-14］。國內(nèi)接種量最大的疫苗類型為滅活疫苗，滅活疫苗的生產(chǎn)步驟通常為以Vero細胞為宿主，通過細胞工廠或生物反應(yīng)器進行病毒的增殖培養(yǎng)［15-16］，病毒收獲液經(jīng)β-丙內(nèi)酯滅活后進行滅活驗證，完全滅活的收獲液經(jīng)過濾、純化等工藝，最終制得成品疫苗［17-18］。為保證生產(chǎn)過程中質(zhì)量的穩(wěn)定性，本研究采用Karber法對病毒收獲液以及滅活樣本進行滴度檢測［19］，在保證收獲液質(zhì)量的基礎(chǔ)上，進一步確保滅活工藝能夠完全滅活病毒，為新冠疫苗的安全研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒、病毒收獲液及細胞株SARS-CoV-2毒株（工作代次為V8代）由廣東省疾病預(yù)防控制中心提供；病毒收獲液為華蘭生物BSL-3實驗室5 L生物反應(yīng)器培養(yǎng)產(chǎn)物，批號分別為202111001、202111002和202111003；非洲綠猴腎細胞（Vero）購自美國標準生物品收藏中心（ATCC CCL-81）。

1.2 主要試劑DEME培養(yǎng)基（貨號：10564011）、0.25%胰酶（貨號：25200072）和胎牛血清（貨號：10099141）購自美國Gibco公司。

1.3 Vero細胞培養(yǎng)板的制備 取長至致密單層的Vero細胞培養(yǎng)瓶，吸棄生長液，加入胰酶消化5～10 min，吸棄胰酶，加入生長液制備細胞懸液，通過細胞計數(shù)，將細胞懸液稀釋至2×105個／mL，接種至96孔細胞培養(yǎng)板，100 μL／孔，第10列補加100 μL維持液作為陰性對照，置37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞至單層，轉(zhuǎn)入生物安全三級實驗室備用。

1.4 病毒滴度穩(wěn)定性檢測 采用Karber法。取2021-11001、202111002和202111003批病毒收獲液，于2～8℃放置12 d，每隔3 d（0、3、6、9、12 d）取樣100 μL，測定病毒滴度：加至900 μL維持液中進行10倍系列稀釋（10-1～10-9），取不同稀釋倍數(shù)的病毒液100 μL，接種至96孔細胞板，每個稀釋度接種8孔，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d，以病變孔數(shù)不再增加、陰性對照細胞未老化之前進行滴度終點判定。

1.5 滅活動力學(xué)檢測 取202111001、202111002和202111003批病毒收獲液，于2～8℃冰箱過夜平衡溫度，按1∶4 000的體積分數(shù)加入β-丙內(nèi)酯，混勻后立即使用離心管進行樣品分裝，分裝的樣品繼續(xù)放至2～8℃冰箱進行滅活，并在不同的試驗條件下進行滴度檢測和滅活驗證，檢測時間點為0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、8.0、16、24 h，前7個時間點（0～4.0 h）檢測病毒滴度，后3個時間點（8.0、16、24 h）檢測病毒滴度并進行滅活驗證。

1.6 滅活驗證

1.6.1 盲傳3代 取長至單層Vero細胞的T75細胞瓶，吸棄上清，補加8 mL維持液；吸取25 mL滅活液加至T75細胞瓶內(nèi)，每個樣本設(shè)3個重復(fù)，陽性對照為吸取25 mL病毒收獲液（病毒含量10 CCID50）加至T75細胞瓶內(nèi)，陰性對照為吸取25 mL維持液加至T75細胞瓶內(nèi)，于37℃，5%CO2條件下進行盲傳1代培養(yǎng)；培養(yǎng)5 d后吸取盲傳1代上清液25 mL，加至T75細胞瓶內(nèi)（含8 mL維持液），于37℃，5% CO2條件下進行盲傳2代培養(yǎng)；培養(yǎng)5 d后吸取盲傳2代上清液25 mL，加至T75細胞瓶內(nèi)（含8 mL維持液），于37℃，5%CO2條件下進行盲傳3代培養(yǎng)。5 d后判定終點，觀察每次傳代培養(yǎng)是否病變，3代3個重復(fù)均無病變則證明滅活完全。

1.6.2 滴度檢測 采用Karber法對傳代樣本進行滴度檢測，具體操作步驟同1.4項。

1.7 病毒滅活液電鏡觀察 取滅活24 h的病毒滅活液，加入戊二醛固定，使其終濃度為2.5%，置2～8℃冰箱過夜保存。吸取固定樣品20 μL，滴加至有噴碳支持膜的銅網(wǎng)上，使之形成小液滴，放置1 min后用濾紙吸棄多余液體，純化水洗滌1次后，滴加1%醋酸雙氧鈾染液，染色1 min；吸棄多余染液，自然干燥后進行透射電鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 病毒滴度穩(wěn)定性202111001、202111002和2021-11003批病毒收獲液于2～8℃環(huán)境下放置12 d，滴度呈下降趨勢，第3天滴度下降幅度不明顯，病毒滴度降幅分別為1.6%、2.1%和5%；第12天病毒滴度降幅分別為25.8%、22.9%和16.7%。見表1。

表1 3批SARS-CoV-2收獲液放置不同時間的滴度變化（lgCCID50／mL）Tab.1 Changes of titers of three batches of SARS-CoV-2 harvest solution stored for different time durations（lgCCID50／mL）

2.2 滅活動力學(xué)檢測202111001和202111002批病毒收獲液均滅活2 h檢測不出病毒滴度，202111003批病毒收獲液滅活3 h檢測不出病毒滴度，因此，病毒收獲液經(jīng)3 h滅活處理均可將病毒完全滅活，見表2。

表2 3批SARS-CoV-2收獲液滅活動力學(xué)滴度檢測結(jié)果（lgCCID50／mL）Tab.2 Inactivation kinetic titers of three batches of SARS-CoV-2 harvest solution（lgCCID50／mL）

2.3 病毒滅活驗證 滅活8、16、24 h的病毒收獲液盲傳3代樣品均無細胞病變，每次傳代樣品均未檢出病毒滴度；陽性對照細胞發(fā)生完全病變，陰性對照細胞未發(fā)生病變。見圖1。表明1∶4 000體積分數(shù)的β-丙內(nèi)酯處理8 h以上能夠完全滅活SARS-CoV-2。

圖1 滅活驗證樣品的顯微鏡觀察（×40）Fig.1 Microscopy of inactivation verification of samples（×40）

2.4 病毒滅活液電鏡觀察 透射電鏡觀察可見，滅活的病毒呈圓球狀，直徑約100 nm，包膜周圍有明顯的刺突蛋白且分布均勻，見圖2。表明該滅活工藝對病毒顆粒完整性影響不大。

圖2 滅活的SARS-CoV-2的透射電鏡觀察Fig.2 Transmission electron microscope observation of inactivated SARS-CoV-2

3 討論

目前國內(nèi)已上市的新冠疫苗種類有滅活疫苗、腺病毒疫苗以及重組亞單位疫苗，其中滅活疫苗是國內(nèi)接種量最多的疫苗類型［20-22］；對于滅活疫苗的研發(fā)及生產(chǎn)，其滴度穩(wěn)定性影響成品的質(zhì)量，病毒滅活工藝參數(shù)決定產(chǎn)品的安全，因此，對于SARSCoV-2滴度穩(wěn)定性以及滅活動力學(xué)研究顯得至關(guān)重要［23-25］。

本研究采用Karber法對置于2～8℃的SARSCoV-2收獲液進行滴度檢測，病毒滴度隨著放置時間的延長不斷降低；放置3 d后，3批樣本的滴度降幅為1.6%、2.1%和5%，放置12 d后，滴度降幅達25.8%、22.9%和16.7%，表明2～8℃環(huán)境下SARS-CoV-2滴度穩(wěn)定性較差；為保證后續(xù)純化工藝順利進行，建議病毒收獲液于3 d內(nèi)進行滅活處理。

滅活動力學(xué)研究中，按1∶4 000的體積比加入β-丙內(nèi)酯處理3 h以上，病毒滴度降至0，表明β-丙內(nèi)酯能夠有效滅活SARS-CoV-2；無論是7.875 lgCCID50／mL的高滴度病毒，還是5.75 lgCCID50／mL的低滴度病毒，β-丙內(nèi)酯均能在3 h內(nèi)滅活完全，表明在此滴度范圍之內(nèi)，滅活劑的加入量是足量且冗余的。WANG等［18］的研究表明，β-丙內(nèi)酯在4 h內(nèi)將病毒滅活完全，與本研究結(jié)果差異不大。本研究對滅活8、16、24 h的樣本進行滅活驗證，表明病毒完全滅活；對SARSCoV-2進行電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)滅活24 h的樣本病毒顆粒完整，刺突蛋白分布均勻，與GAO等［17］和WANG等［18］的研究一致。表明該滅活工藝對SARS-CoV-2顆粒完整性影響較小，為后續(xù)生產(chǎn)工藝以及滅活時間的確定提供了理論依據(jù)。

綜上所述，本研究對SARS-CoV-2在2～8℃環(huán)境下的滴度穩(wěn)定性以及滅活動力學(xué)進行了探討，在保證病毒收獲液質(zhì)量的基礎(chǔ)上，進一步確保了滅活工藝能夠完全滅活病毒，為新冠滅活疫苗的安全研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。