倪吳花，Ashok Agarwal，孫瑩璞，孫海翔，鄧成艷，劉平，周燦權(quán)，馮云，郝桂敏，盧文紅，全松，沈浣，師娟子，滕曉明，王曉紅，王秀霞，伍瓊芳，曾勇，張松英，鐘影，黃學(xué)鋒，黃國寧

(中華醫(yī)學(xué)會生殖醫(yī)學(xué)分會第五屆委員會)

背 景

常規(guī)精液指標是目前評估男性生育力的主要手段，但研究已發(fā)現(xiàn)其預(yù)測男性生育力的價值有限[1]。精子DNA碎片(sperm DNA fragmentation，SDF)是一項新的反映精子功能的檢測指標。SDF增高常伴發(fā)少、弱精子癥，也可發(fā)生在精液常規(guī)指標正常的男性不育癥患者。SDF的發(fā)生機制復(fù)雜。很多文獻報道SDF升高與自然妊娠和輔助生殖技術(shù)結(jié)局存在負相關(guān)。因此，近年來SDF檢測已廣泛應(yīng)用于男性不育的診斷和治療。為規(guī)范SDF的臨床檢測和應(yīng)用，中華醫(yī)學(xué)會生殖醫(yī)學(xué)分會制定了本臨床專家共識，對SDF檢測方法、臨床意義和治療提出推薦建議。

方 法

本共識由中華醫(yī)學(xué)會生殖醫(yī)學(xué)分會發(fā)起，由男科與精子庫管理學(xué)組組織編寫，已在國際實踐指南注冊平臺(International Practice Guideline Registry Platform，IPGRP)國內(nèi)版進行了注冊(注冊號為IPGRP-2020CN122)。

本共識系統(tǒng)檢索了PubMed、CNKI、萬方以及Cochrane library數(shù)據(jù)庫。設(shè)計與制定步驟參考了世界衛(wèi)生組織(WHO)發(fā)布的《世界衛(wèi)生組織指南制定手冊》、中華醫(yī)學(xué)會發(fā)布的《制訂/修訂<臨床診療指南>的基本方法和程序》和中華醫(yī)學(xué)會生殖醫(yī)學(xué)分會發(fā)布的《CSRM指南共識的制定規(guī)范(2016)》。參照GRADE方法予以證據(jù)質(zhì)量評價及推薦強度評級(表1、表2)。對未能給予GRADE但有必要予以關(guān)注的問題，根據(jù)指南制定小組專家臨床經(jīng)驗推薦了良好實踐要點(GPP)。

表1 GRADE證據(jù)質(zhì)量評價及其定義

表2 推薦強度評級及其定義

共識內(nèi)容

一、總覽

本共識包含以下11項推薦建議：

序號推薦建議證據(jù)等級推薦強度1男性高齡、精索靜脈曲張、附性腺感染以及吸煙、酗酒、肥胖、高溫等不良生活習(xí)慣可導(dǎo)致SDF水平升高。B22TUNEL、SCD、SCSA和堿性Comet試驗的檢測結(jié)果之間具有相關(guān)性,可用于臨床檢測SDF。B23SDF檢測可用于不明原因不育男性,有助于發(fā)現(xiàn)不育原因。C24SDF檢測可用于不明原因反復(fù)流產(chǎn)女性患者的配偶,有助于發(fā)現(xiàn)反復(fù)流產(chǎn)的病因。C25SDF檢測可用于精索靜脈曲張結(jié)扎術(shù)前和術(shù)后檢測,有助于估計手術(shù)預(yù)后。C26SDF可用于輔助生殖技術(shù)前檢測,有助于預(yù)測治療結(jié)果,包括臨床妊娠率、流產(chǎn)率和活產(chǎn)率。B27改善不良生活方式可作為SDF的基礎(chǔ)治療。GPP8抗氧化治療可能改善SDF。C29在對高SDF精液進行處理時,應(yīng)避免精子冷凍、過高離心力、過長離心時間和長時間的37℃下體外培養(yǎng)。GPP10SDF增高的臨床型精索靜脈曲張不育患者可通過不同的精索靜脈結(jié)扎手術(shù)降低SDF水平。B211對高SDF患者多次采用精液精子行ICSI治療失敗者,可采用睪丸精子行ICSI治療。C2

二、SDF的定義和原因

1.定義：SDF是指精子DNA完整性受損，包括精子DNA發(fā)生堿基錯配、丟失、修飾、DNA加合和交聯(lián)、單鏈和雙鏈斷裂等，但主要指精子DNA發(fā)生單鏈和/或雙鏈斷裂[2]。

2.SDF的發(fā)生機制和原因：SDF可發(fā)生于睪丸內(nèi)精子發(fā)生和成熟過程，也可發(fā)生于男性生殖道中精子運輸過程。在睪丸內(nèi)精子發(fā)生過程中，精子不全凋亡(abortive apoptosis)和成熟異常是導(dǎo)致SDF的主要原因[2]。氧化應(yīng)激導(dǎo)致過高的氧自由基也可激活凋亡通路誘導(dǎo)睪丸內(nèi)精子發(fā)生異常凋亡，也可直接導(dǎo)致精子運輸過程中精子的脂質(zhì)膜和DNA過氧化損傷而導(dǎo)致SDF[3-6]。文獻報道了可導(dǎo)致SDF增高的各種臨床因素，如男性高齡、精索靜脈曲張、附性腺感染等，以及肥胖、吸煙、酗酒和高溫等不良生活習(xí)慣可由于精子生精障礙和/或通過氧化應(yīng)激導(dǎo)致SDF[7-13]。

序號共識建議證據(jù)等級推薦強度1男性高齡、精索靜脈曲張、附性腺感染以及吸煙、酗酒、肥胖、高溫等不良生活習(xí)慣可導(dǎo)致SDF水平升高。B2

三、SDF的檢測方法

1.檢測方法：文獻報道了不同的SDF檢測方法[14-18]，其中，精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析(SCSA)、精子染色質(zhì)擴散法(SCD)、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標記法(TUNEL)和彗星實驗(Comet)為目前最為常用的方法(表3)。

不同檢測方法的生物學(xué)意義可能不同，一些方法直接檢測DNA斷裂，其他方法實際上通過檢測雙鏈DNA變性為單鏈的敏感性以間接檢測DNA斷裂。目前檢測方法的不足包括：(1)檢測到的SDF 可能不具有臨床意義，如少量的單鏈DNA斷裂可被另一條完整的DNA鏈修復(fù)和復(fù)制；(2)較難以檢測特定的重要DNA位點的斷裂；(3)未能檢測精子DNA斷裂的范圍和程度；(4)沒有公認的檢測閾值。

表3 SDF的常用檢測方法

2.不同檢測方法的比較：不同SDF檢測的方法學(xué)不同，診斷特異性和敏感性有所不同，但其結(jié)果相互間仍高度相關(guān)。很多研究比較了SCSA和SCD檢測精子DNA損傷的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)兩種方法間存在顯著的正相關(guān)[19-22]。比較SCSA和TUNEL方法的研究也顯示兩者之間顯著相關(guān)[23]。一項研究比較了TUNEL和SCD與SCSA的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)相關(guān)系數(shù)>0.866(P<0.01)[24]。另有研究探討了TUNEL、SCD、SCSA和Comet試驗在男性不育和對照組的檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)雖然不同方法的預(yù)測值不同，但TUNEL、SCD、SCSA和堿性Comet試驗都可以預(yù)測不育，但中性Comet試驗則不具預(yù)測作用[25]。一項Meta分析發(fā)現(xiàn)TUNEL、SCD和堿性Comet試驗都可以預(yù)測男性不育，但TUNEL方法的預(yù)測作用較強[26]。一項評估SDF對IVF和ICSI臨床結(jié)果影響的綜述和Meta分析發(fā)現(xiàn)，不同方法(TUNEL、SCD、SCSA和Comet試驗)檢測的SDF都可預(yù)測IVF和ICSI的臨床妊娠率[27]。

目前沒有足夠的研究證據(jù)支持和反對上述某種特定的SDF檢測方法[28]。

3.質(zhì)量控制：與常規(guī)精液指標一樣，SDF檢測結(jié)果可能在不同時間存在個體內(nèi)差異。在一項對282名進行宮腔內(nèi)人工授精(IUI)或輔助生殖技術(shù)的不育男性的精液進行SDF檢測的結(jié)果表明，重復(fù)SCSA檢測SDF的平均變異系數(shù)(CV)為29%，其中大約1/3的患者在重復(fù)檢測中超過閾值水平[29]。SDF檢測結(jié)果還受到檢測程序和采用儀器的影響，因此嚴格的質(zhì)量控制非常重要。

在目前沒有標準化室間質(zhì)控的情況下，SDF檢測實驗室除按照WHO精液標準化程序進行精液收集和處理外，還應(yīng)嚴格規(guī)定檢測精液的冷凍保存方法及時間和相關(guān)檢測設(shè)備的校準。

序號推薦建議證據(jù)等級推薦強度2TUNEL、SCD、SCSA和堿性Comet試驗的檢測結(jié)果之間具有相關(guān)性,可用于臨床檢測SDF。B2

四、SDF檢測的臨床意義

(一)SDF檢測的適應(yīng)證

根據(jù)目前臨床研究證據(jù)，以下情況存在SDF的風(fēng)險較大，推薦進行SDF檢測。

1.不明原因不育：很多研究表明，排除女方因素的不明原因不育男性精液SDF顯著高于正常生育男性[30-33]。在常規(guī)精液指標正常的男性不育患者中，大約5%～20%的患者SDF顯著增高[33-35]。這些研究表明，SDF與不明原因性不育相關(guān)，檢測SDF有助于發(fā)現(xiàn)不明原因性不育男性的可能不育原因。

2.不明原因反復(fù)流產(chǎn)：不明原因反復(fù)流產(chǎn)女性的配偶SDF顯著高于正常對照組[36-39]。一項Meta分析納入了12項前瞻性和2項回顧性研究，研究分別采用SCD、TUNEL、SCSA和Comet試驗檢測SDF，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不明原因反復(fù)流產(chǎn)女性患者的配偶SDF比對照組高11.8%[95%CI(6.64，17.32)；P<0.001]，提示高SDF可能是不明原因流產(chǎn)的原因[40]。另一項Meta分析納入15項前瞻性研究(共579例反復(fù)流產(chǎn)女性的配偶和434例正常生育女性的配偶)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)前者SDF高11.91%[95%CI(4.97，18.86)]，也表明高SDF可能是反復(fù)流產(chǎn)的原因[41]。歐洲人類生殖和胚胎學(xué)協(xié)會(ESHRE)的2018年反復(fù)妊娠丟失指南[42]認為SDF可能是不明原因反復(fù)流產(chǎn)的一個原因，級別證據(jù)中度，可用于不明原因反復(fù)流產(chǎn)的檢測。

3.臨床型精索靜脈曲張：大量研究表明，臨床型精索靜脈曲張患者的SDF顯著升高[12，30，43-50]。一項納入12個研究的Meta分析表明，精索靜脈曲張患者的SDF與對照相比高9.84%[95%CI(9.19，10.49)；P<0.001][46]。研究還表明，精索靜脈結(jié)扎手術(shù)顯著降低了SDF水平[46，51]，而精索靜脈結(jié)扎術(shù)后自然妊娠者的SDF顯著低于未妊娠者[52]。一項文獻復(fù)習(xí)納入21項研究共1 200多例患者，同樣發(fā)現(xiàn)精索靜脈結(jié)扎術(shù)在術(shù)后3～6個月顯著降低了SDF[53]。這些研究表明，臨床型精索靜脈曲張可導(dǎo)致SDF升高，SDF檢測有助于臨床型精索靜脈曲張結(jié)扎手術(shù)的預(yù)后判斷。

4.輔助生殖治療前檢測：近年來，關(guān)于SDF檢測對輔助生殖技術(shù)結(jié)果的預(yù)測作用有大量的研究。有關(guān)SDF對IUI結(jié)局的影響，盡管有不同的研究結(jié)論，但2項Meta分析表明高SDF降低了IUI的臨床妊娠率[54-55]。一項共納入10項研究的Meta分析研究了SDF對IUI結(jié)果的影響，結(jié)果表明高SDF者的臨床妊娠率[RR=0.34，95%CI(0.22，0.52)；P<0.001]和出生率[RR=0.14，95%CI(0.04，0.56)；P<0.001]均顯著下降[54]。另一項Meta分析也表明低SDF者的IUI臨床妊娠率顯著增高[RR=3.3，95%CI(1.16，9.39)][55]。

越來越多的研究表明SDF影響IVF和/或ICSI的臨床結(jié)局。一些研究顯示高SDF降低IVF和ICSI的臨床妊娠率和活產(chǎn)率，并增高流產(chǎn)率[56-62]；也有一些研究顯示SDF僅影響IVF[63-67]或ICSI[68-72]的臨床結(jié)局，還有一些研究的結(jié)論是SDF不影響IVF或ICSI的臨床結(jié)局[15，72-76]。近年來有多篇系統(tǒng)回顧和Meta分析探討了SDF對IVF/ICSI的臨床妊娠率、活產(chǎn)率和流產(chǎn)率的影響[27，77-83]。其中，4項Meta分析表明，高SDF顯著降低了IVF的臨床妊娠率[27，78-80]，一項Meta分析發(fā)現(xiàn)高SDF顯著降低了IVF與ICSI的臨床妊娠率[81]。一項Meta分析探究了SDF與活產(chǎn)率的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)高SDF顯著降低了IVF和ICSI的活產(chǎn)率[OR=1.17，95%CI(1.07，1.28)；P=0.000 5][82]。2項Meta分析研究了SDF對IVF/ICSI流產(chǎn)率的影響，發(fā)現(xiàn)高SDF顯著增高了IVF和ICSI的流產(chǎn)率[79-80]。但一項2008年發(fā)表的Meta分析發(fā)現(xiàn)，盡管SDF與IVF和ICSI臨床結(jié)果顯著相關(guān)[OR=1.44，95%CI(1.03，2.03)；P=0.04]，但似然比[LR(+)=1.23，LR(-)=0.81]范圍較小，顯示臨床預(yù)測價值有限[77]；一項2016年發(fā)表的Meta分析納入了30項研究，發(fā)現(xiàn)SDF影響IVF和ICSI的繼續(xù)妊娠率，預(yù)測敏感性為中等～好，但特異度較低，采用TUNEL和Comet試驗檢測的預(yù)測價值要高于SCSA和SCD[83]。

綜上所述，目前的證據(jù)傾向于支持SDF影響IUI、IVF和ICSI治療結(jié)局的結(jié)論。

(二)SDF檢測的診斷閾值

一些研究探討了預(yù)測輔助生殖技術(shù)臨床結(jié)局的SDF預(yù)測值，TUNEL法的閾值為4%～20%，Comet試驗的閾值為44%～56%，SCSA法的閾值為11.3%～30.3%，SCD法的閾值為17%～27.3%[67，74，82-85]。不同SDF檢測方法的閾值不同，但即使同一檢測方法也仍缺乏公認閾值。其原因可能是不同研究針對的檢測人群不同。不同中心應(yīng)針對其采用的SDF檢測方法和研究人群確定診斷閾值[86]。

序號共識建議證據(jù)等級推薦強度3SDF檢測可用于不明原因不育男性,有助于發(fā)現(xiàn)不育原因。C24SDF檢測可用于不明原因反復(fù)流產(chǎn)女性患者的配偶,有助于發(fā)現(xiàn)反復(fù)流產(chǎn)的病因。C25SDF檢測可用于精索靜脈曲張結(jié)扎術(shù)前和術(shù)后檢測,有助于估計手術(shù)預(yù)后。C26SDF可用于輔助生殖技術(shù)前檢測,有助于預(yù)測治療結(jié)果,包括臨床妊娠率、流產(chǎn)率和活產(chǎn)率。B2

五、SDF的臨床處理

(一)改善不良生活方式

大量研究提示肥胖、吸煙、酗酒和高溫等不良生活方式與SDF升高相關(guān)。初步的研究表明，減重可改善精液質(zhì)量和SDF并增加自然妊娠機會[87-89]。但目前尚缺乏足夠的臨床證據(jù)表明改善不良生活方式可改善SDF。盡管目前的臨床研究證據(jù)有限，但考慮到改善不良生活方式的手段簡單方便，其潛在獲益大于危害和實施成本，本共識仍推薦將其作為SDF臨床處理的基礎(chǔ)治療(GPP)。

(二)抗氧化治療

抗氧化劑包括維生素C、維生素E、左旋肉毒堿、輔酶Q10、N-乙酰半胱氨酸、葉酸、鋅、硒、番茄紅素和蝦青素等。不同抗氧化劑的抗氧化作用差別顯著，如體外研究表明蝦青素的抗氧化作用約為維生素E的100倍[90]。

抗氧化劑是目前治療包括SDF等各種精液異常的常用方法[90-91]。一些研究表明抗氧化劑治療顯著降低了SDF[92-97]。2019年的一項Cochrane分析納入了4個樣本量較小的隨機對照研究(RCT)，發(fā)現(xiàn)抗氧化劑治療與安慰劑對比，顯著降低了SDF，分析還發(fā)現(xiàn)不同氧化劑的作用不同[98]。目前大部分研究仍有較大設(shè)計缺陷，缺乏安慰劑對照組和雙盲設(shè)計，研究統(tǒng)計效率較低?？寡趸委熆赡苓m用于精漿高氧化應(yīng)激患者[99]，但尚缺乏臨床證據(jù)。進一步的研究應(yīng)是采用嚴格設(shè)計的RCT，證明單獨或組合使用不同抗氧化劑改善SDF的作用以及對自然妊娠和輔助生殖技術(shù)結(jié)果的影響。

(三)精索靜脈曲張結(jié)扎手術(shù)

對臨床型精索靜脈曲張不育患者，研究表明不同的精索靜脈曲張結(jié)扎手術(shù)均可降低氧化應(yīng)激水平[100]，顯著降低SDF[101-104]。一項文獻綜述系統(tǒng)回顧了21項前瞻性研究，發(fā)現(xiàn)不同的精索靜脈曲張結(jié)扎手術(shù)顯著降低了SDF，平均降低8%[53]。還有研究發(fā)現(xiàn)精索靜脈曲張結(jié)扎手術(shù)降低SDF并提高了自然和輔助生育的妊娠率[51]。

(四)輔助生殖技術(shù)中處理

1.縮短取精時禁欲時間：禁欲時間與精液常規(guī)指標和SDF相關(guān)，禁欲時間延長雖然提高了精液量和精子總數(shù)，但降低精液精子活率，增加了SDF[105-107]。在輔助生殖技術(shù)中，重復(fù)取精并縮短禁欲時間至1～3 h取精是一個簡單的降低手淫獲取精子SDF的方法[108-110]?？s短禁欲時間是否改善IUI臨床妊娠率的研究有不同的結(jié)論[111-112]，目前也缺乏縮短禁欲時間對IVF和ICSI治療影響的研究。最近的一項研究發(fā)現(xiàn)禁欲1 d的精子雖然SDF開始較低，但在體外培養(yǎng)6 h后SDF顯著增加20～40倍以上[105]。

縮短禁欲時間是否會改善IUI、IVF或ICSI的治療結(jié)局仍需要進一步的研究。

2.減少實驗室精液處理對SDF的影響：精子處理過程會通過增加氧自由基導(dǎo)致SDF升高，包括冷凍精子、過高離心力、過長離心時間和37℃下長時間培養(yǎng)等[113-117]。有研究發(fā)現(xiàn)，37℃下超過2 h培養(yǎng)可導(dǎo)致SDF顯著增加[114,118]。因此，對高SDF的精液處理應(yīng)避免精子冷凍、過高的離心力、過長的離心時間和長時間的37℃下體外培養(yǎng)。

3.精子優(yōu)選方法：上游法或密度梯度離心是實驗室精子處理的常用基本技術(shù)。處理后精子的活力和正常形態(tài)率會顯著提高。大部分文獻報道上游法和密度梯度離心可顯著降低SDF[119-122]。但有研究發(fā)現(xiàn)密度梯度離心并不能改善處理后的精子SDF，甚至在部分精液標本中增高了SDF水平[123]。

近年來，文獻報道了許多新的精子優(yōu)選方法[124-126]。有報道精子微流體分選[127-128]、透明質(zhì)酸結(jié)合試驗[129]、運動精子細胞器形態(tài)學(xué)檢查(motile sperm organelle morphology examination，MSOME)[130-132]和磁性活化細胞分選(magnetic-activated cell sorting，MACS)[132-134]都有助于篩選SDF低的精子。但采用這些優(yōu)選后精子行輔助生殖技術(shù)治療是否改善臨床結(jié)果仍未獲證實。

4.采用睪丸精子行ICSI：研究發(fā)現(xiàn)，睪丸精子的SDF比精液精子低[135]?；谶@一發(fā)現(xiàn)，在一些回顧性研究和小樣本的非隨機前瞻配對研究中，發(fā)現(xiàn)對高SDF反復(fù)精液精子ICSI失敗患者，采用睪丸精子行ICSI治療可獲得更高的臨床妊娠率[136-138]。但對于伴有嚴重少精子癥的高SDF患者，可能會有較大睪丸取精失敗的可能。采用睪丸精子ICSI需要行睪丸取精手術(shù)，可能存在麻醉和手術(shù)并發(fā)癥。睪丸精子還可能具有更高的染色體非整倍體率[139]。此外，睪丸生精細胞凋亡異?？赡苁歉逽DF的原因之一[2]，在這種情況下，睪丸精子SDF可能不會比精液精子低。因此，高SDF患者行睪丸精子ICSI的臨床價值仍需要更多研究證實。

序號共識建議證據(jù)等級推薦強度7改善不良生活方式可作為SDF的基礎(chǔ)治療。GPP8抗氧化治療可能改善SDF。C29在對高SDF精液進行處理時,應(yīng)避免精子冷凍、過高離心力、過長離心時間和長時間的37℃下體外培養(yǎng)。GPP10SDF增高的臨床型精索靜脈曲張不育患者可通過不同的精索靜脈結(jié)扎手術(shù)降低SDF水平。B211對高SDF患者多次采用精液精子行ICSI治療失敗者,可采用睪丸精子行ICSI治療。C2

致謝：中華醫(yī)學(xué)會生殖醫(yī)學(xué)分會第四屆、第五屆委員會生殖男科與精子庫管理學(xué)組委員審閱了本共識。