高飛，胡澤斌，于婷，董喆，黃杰

NIFDC-PT-319 血清中睪酮測定能力驗證計劃是國家藥品監(jiān)督管理局項目，依據 ISO/IEC 17043:2010《合格評定能力驗證的通用要求》運作，該計劃由中國食品藥品檢定研究院負責組織及實施。

睪酮的分子式組成為 C19H28O2，是由 19 個碳原子構成的類固醇類荷爾蒙，分子量為 288.4。在人體循環(huán)系統(tǒng)中，大約 97% 的睪酮結合在人血漿蛋白中。其中，血液中的睪酮有 60% 與性激素結合球蛋白相結合，38% 與白蛋白相結合，2% 為游離狀態(tài)[1]。睪酮的水平對于人類胚胎發(fā)育、男性性腺的發(fā)育[2]、骨髓的造血功能及骨密度[3]等起到重要作用。在臨床中，血清中睪酮的測定主要被用于女性內分泌失調[4-5]或者男性性功能障礙的輔助診斷[6]，其檢測的方法包括參考方法（如同位素稀釋質譜法）和常規(guī)測定方法（如化學發(fā)光法）。

目前，我國已有多個睪酮檢測試劑盒獲得了國家藥品監(jiān)督管理局的上市批準并應用于臨床檢驗。同時，基于體外診斷試劑注冊檢驗、國家監(jiān)督抽驗等檢驗的發(fā)展，國內多個醫(yī)療器械檢驗機構也已開展睪酮檢測的項目。因此，中國食品藥品檢定研究院組織實施了血清中睪酮測定能力驗證計劃。通過本計劃，可客觀評價相關實驗室睪酮檢測的能力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來源 本次能力驗證樣本有 3 份，為中國食品藥品檢定研究院研制，均為通過收集外觀清澈透明，無溶血、黃疸、乳糜的臨床血清，混合后分裝得到。其中 1 份真正的能力驗證樣本的濃度為 3.67 ng/ml，并采用參考方法定值，并經過均勻性和穩(wěn)定性分析，另外 2 份樣本為干擾樣本，濃度分別為 0.22 ng/ml 和 1.79 ng/ml。

1.1.2 試劑與儀器 睪酮測定試劑盒分別為吉林迪瑞醫(yī)療科技股份有限公司、四川邁克生物股份有限公司和深圳市亞輝龍生物科技股份有限公司產品；睪酮質控品來自美國國家標準與技術研究所；睪酮校準品為廣州市達瑞生物技術股份有限公司產品。

化學發(fā)光測試儀為深圳市亞輝龍生物科技股份有限公司產品；超高效液相色譜串聯質譜系統(tǒng)為美國 Waters 公司產品；全自動化學發(fā)光免疫分析儀為吉林迪瑞醫(yī)療科技股份有限公司和四川邁克生物股份有限公司產品；ADVIA?Centaur XPT 全自動化學發(fā)光免疫分析儀為德國 Siemens公司產品。

1.2 方法

1.2.1 參加者報名 全國范圍內的相關實驗室通過登錄能力驗證服務平臺進行自愿報名（平臺網址為：http://223.71.250.33/Login.aspx）。共有 6 家實驗室報名參加本能力驗證項目，來自全國 4 個省（自治區(qū)）、直轄市的醫(yī)療器械檢驗所/食品藥品檢驗機構和企業(yè)實驗室，詳見表1。其中檢驗機構 1 家（占 16.7%）；企業(yè)實驗室 5 家（占 83.3%）。6 家實驗室中 5 家采用商品化試劑盒，檢測方法為化學發(fā)光法，1 家為實驗室自建高效液相色譜串聯質譜法。參加實驗室所分配的樣本編號和濃度信息見表2。

表1 實驗室分布情況

表2 參加考核實驗室分配樣本編號及濃度（ng/ml）信息

1.2.2 檢測步驟 參加者收到樣品后需按照以下步驟進行檢測：①實驗前取出樣品，恢復至室溫（20 ～ 25 ℃）后充分混勻待測；②檢測方法可采用參考方法或商品化試劑盒；③檢測儀器應在儀器校準合格有效期內；④試劑配套的校準品和質控品應檢測通過；⑤每份能力驗證樣本應重復測定不少于 5 次并計算均值（保留 2 位小數）、測定值的變異系數（CV，%）及相對偏差（真正樣本的實測值與標示值比值）。

1.2.3 結果反饋 實驗室收到樣品后的 14 個工作日完成實驗并在平臺上提交結果報告。同時將以下報送材料郵寄至聯系人，并務必向聯系人提交完整的電子版報送材料。報送材料包括：①結果報告單（加蓋公章）；②原始試驗記錄（必須含試劑盒、校準品、檢測儀器等關鍵信息以及檢測人員/負責人聯系方式）；③原始數據匯總表；④原始數據打印結果或截屏或復印件等（務必在結果數據旁用簽字筆標注清楚結果所對應的樣本信息）；⑤如采用商品化試劑盒，需提供試劑盒說明書，及試劑盒批號和有效期等信息。

1.2.4 防止串通措施 隨機賦予每個參加實驗室一個代碼，最終的結果報告中均使用該代碼。每個代碼均代表一份隨機組合的樣本。

2 結果

2.1 不同單位對能力驗證樣本的檢測結果

全部實驗室均按要求如期提交了結果報告，有效數據 6份。變異系數及相對偏差的檢測結果見表3、表4 和表5。

2.2 結果分析

1 份真正樣本的血清睪酮標示值為（3.67 ± 0.16）ng/ml（k= 2）。根據判定原則，測定值與標示值的相對偏差應在 ± 30.0% 范圍內，且 3 份樣品的測定結果的 CV 值均應不高于 10.0%，才認為結果滿意。

全部數據中，4 家實驗室的 1 份真正樣本血清睪酮測定值與標示值的相對偏差結果滿足要求，其余 2 家（單位代碼分別為：227 和 435）的相對偏差結果均不在范圍內，如表4 所示。其中，代碼為 227 的實驗室采用的實驗方法為高效液相色譜串聯質譜法，代碼為 435 的實驗室采用的實驗方法為化學發(fā)光法；6 家實驗室測定結果的 CV 均滿足要求，除 1 家實驗室的 3 號樣本 CV 值超過 9.0% 外，其余樣本的 CV 值均小于 5.0%，真正樣本的 CV 值在0.8% ～ 4.0% 之間，表明重復性整體結果滿意（表3）。最終獲得結果滿意的實驗室為 4 家，滿意率為 66.7%，結果不滿意的實驗室為 2 家，不滿意率為 33.3%（表5）。

表3 各參加實驗室血清睪酮測定均值與 CV 值結果匯總

表4 各參加實驗室血清睪酮測定均值與靶值的相對偏差結果匯總

表5 血清中睪酮測定能力驗證結果表

本次能力驗證的目的是考察各參加實驗室對血清中睪酮的檢測能力，通過提交的數據和原始記錄等對結果中存在的部分問題進行如下可能性分析：

⑴未按照作業(yè)指導書進行實驗操作

單位代碼分別為 227 和 435 的兩家實驗室沒有按照《NIFDC-PT-319 血清中睪酮測定能力驗證作業(yè)指導書》進行實驗操作；作業(yè)指導書中明確要求“實驗前將所有樣品恢復至室溫，充分混勻后檢測”，而單位代碼為 435 的實驗室提供的原始數據中并沒有將檢測樣本恢復至室溫這一項進行記錄且最終報送的結果為不滿意。

⑵實驗操作過程是否規(guī)范

單位代碼為 227 的實驗室 3 號樣本的檢測結果分別為 0.319、0.371、0.372、0.410、0.397 ng/ml?？梢郧宄乜吹?，5 次結果間波動比較明顯，導致 CV 超過 9.0%。對于產生這種實驗結果的原因，是儀器參數需優(yōu)化，還是操作人員的操作誤差所致，均需要實驗室去查找原因進行分析。對于可能的原因，實驗室應當及時發(fā)現并排查，以明確是隨機誤差還是系統(tǒng)誤差所導致的 CV 值較大。

⑶未重視標準化研究的重要性

部分實驗室檢測所使用的檢測方法既沒有與國際上已有的血清睪酮同位素稀釋質譜法進行方法學的互換研究，也沒有基于上述測量原理對企業(yè)的樣本進行賦值和溯源；而對于睪酮這類血清含量偏低、基質復雜、干擾物質較多的非肽激素類物質而言，建立一套標準化的基于國際或國內參考測量程序的檢測方法尤為重要。

3 討論

化學發(fā)光免疫分析的方法用于血清中睪酮的測量是目前國內常用的睪酮檢測方法。根據國家臨床檢驗醫(yī)學溯源聯合委員會（JCTLM）列表，目前國際上已有的血清睪酮參考方法主要有 3 種，分別由德國臨床化學會 H1（DGKL）[7]、比利時根特大學[8]和美國疾病控制與預防中心（CDC）[9]建立，檢測原理均為同位素稀釋質譜法。本次能力驗證所采用的真正樣本正是基于此測量原理進行賦值。

在血清睪酮的測定中，如何準確測量復雜基質中的微量物質是難點之一，而國際上所采用的特異性的同位素稀釋質譜法在進一步優(yōu)化反應條件后可達到減少同分子量化合物對分析影響的結果。因此，建議部分實驗室參考國際參考測量程序優(yōu)化各自的檢測方法。

綜上所述，建議各實驗室應重點關注以下方面：①定期確認實驗儀器的參數及性能指標是否滿足不同樣本的檢測需求，定期采用效期內的試劑對儀器進行校準；②采用國際或國家標準物質對各自的試劑盒或自建方法進行準確度的實驗，并進行結果分析；③加強標準化研究，在建立方法時應盡量基于參考測量程序以便使樣本的賦值具有可溯源性；④建議結果不合格的實驗室參加測量審核。