王道輝，劉擁軍，劉廣洋

腦卒中是全球第二大死亡原因，成人致死率和致殘率極高[1]。其中，缺血性腦卒中（ischemic stroke，IS）占比高達85%[2]。據統(tǒng)計，世界上每年約有 1500 萬人發(fā)生缺血性腦卒中，其中 500 萬人死亡，500 萬人致長期殘疾[3]，嚴重威脅人類健康，給家庭生活帶來巨大負擔。缺血性腦卒中損傷區(qū)域從壞死區(qū)“核心”到圍繞核心的“半暗帶”[4]，嚴重影響神經功能和行為表現[5]。目前，腦血管栓塞是缺血性腦卒中的主要誘因，表現為暫時性的腦組織缺血，導致氧氣和營養(yǎng)物質輸送不足，引發(fā)腦組織損傷。并且，腦血流再灌注還會造成不可逆的二次損傷。因此，缺血性腦卒中仍是世界上有待解決的重大醫(yī)學難題?；诎l(fā)病機制，目前常用治療手段為溶栓治療，如重組組織型纖維蛋白溶酶原激活劑（recombinant tissue plasminogen activator，rt-PA）和血管內再灌注。但是，溶栓治療具有嚴格的治療時間窗——僅4.5 h，只有極少數患者能夠在發(fā)病后及時使用藥物，完成干預治療。并且，rt-PA 的副作用存在腦出血和加重腦卒中損傷的可能性[6]。因此，新的有效治療藥物和策略一直備受世界關注。

間充質干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）可從多種來源的組織分離得到，包括骨髓（bone marrow，BM）、脂肪細胞（adipose，AD）和臍帶血（umbilical cord blood，UC）等。近期一項研究表明，BM-MSC 傾向于腦和脊髓損傷治療，AD-MSC 傾向于卵巢損傷治療和皮膚再生，UC-MSC 傾向于肺部疾病和急性呼吸窘迫綜合征治療[7]。MSC 的多元分化特性也是科學研究的重點內容，可分化為成骨細胞、成軟骨細胞和脂肪細胞等。并且，MSC 也具有分化為神經元細胞的潛能[8]。目前，移植 MSC 已成為缺血性疾病一種新的治療手段，主要包括腦卒中、冠狀動脈疾病和外周動脈疾病等。多項研究表明，MSC 出色的神經保護作用是治療缺血性腦卒中的重要原因[9-10]。最近一項研究，大鼠發(fā)生缺血性腦卒中，靜脈注射的 BM-MSC 可遷移至大腦缺血邊界區(qū)（半暗帶），分化為神經元和星形膠質細胞，減小梗死面積并恢復神經功能[11]。缺血半暗帶存在大量處于休眠或半休眠狀態(tài)的神經元，因此，如何挽救半暗帶細胞及其機制已經成為缺血性腦卒中臨床治療的關鍵和熱點。本文就 MSC 治療缺血性腦卒中的機制研究進展進行綜述，以期為基礎研究和臨床工作提供參考和指導。

1 MSC 治療缺血性腦卒中的作用及機制

目前的研究報道表示，MSC 主要通過旁分泌作用、免疫調節(jié)作用和抗細胞凋亡作用促進神經組織損傷修復，恢復神經功能，減少腦梗死面積，促進神經和血管生成等，從而發(fā)揮治療缺血性腦卒中的作用。

1.1 MSC 的旁分泌作用

干細胞研究初期，人們將 MSC 這種恢復性功能歸因于干細胞的分化與再生，替代損傷細胞。例如，當用于治療中樞神經系統(tǒng)疾病時，MSC 可增殖成神經元和膠質細胞，取代壞死細胞，發(fā)揮神經保護作用[12]。隨著研究的不斷深入，以及 MSC 難以穿透血腦屏障的特性，更多的研究傾向于認為 MSC 的旁分泌因子，包括外泌體和胞外囊泡，是發(fā)揮治療作用的主要因素[11,13]。

在腦卒中損傷區(qū)域，MSC 可誘導多種生長因子表達，包括腦源性神經營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、基質細胞源性因子 1（stromal cell-derived factor-1，SDF-1）、堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、神經膠質細胞源性神經營養(yǎng)因子和肝細胞生長因子等，通過減少腦梗死面積和恢復神經功能改善腦卒中損傷。

研究表明，相比于 MSC，外泌體具有更高的穿透血腦屏障的能力，達到梗死區(qū)域發(fā)揮治療作用[14]。大鼠腦卒中24 h 后，靜脈注射 MSC 外泌體，顯著改善神經功能、增強神經突重塑、神經再生和血管再生[15]。并且，MSC 外泌體可通過介導 miR-133b 轉移至星形膠質細胞和神經元細胞，調控基因表達，有助于腦卒中后的神經突重塑和神經功能恢復[16]。此外，使用 MSC 胞外囊泡進行短期治療，也能達到與MSC 組類似的改善腦卒中治療效果[17]。即使是19 ～ 20月齡的老年大鼠，MSC 胞外囊泡也可促進大腦中動脈栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）后的神經功能恢復和梗死區(qū)域重塑[18]。以上研究結果均表明，MSC旁分泌因子對缺血性腦卒中具有較好的治療效果。

下面對 MSC 旁分泌因子進行分類表述。

1.1.1 BDNF 神經營養(yǎng)因子在缺血性腦損傷的修復中具有重要作用，以 BDNF 尤為突出。這是一種促進神經細胞增殖和存活的重要神經營養(yǎng)因子，尤其是海馬區(qū)域，是重要的腦卒中調控因子[19]。動物實驗證明，通過顱內注射 BDNF可有效減少腦梗死面積。并且，MSC 轉染 BDNF 后治療MCAO 大鼠，可增加腦中的 BDNF 水平，減少病變面積，改善認知功能和行為能力[20]。然而，新生大鼠 MCAO 后，與 MSC 治療組相比，過表達 BDNF 的 MSC 治療組效果稍有提升，但并無顯著性差異[21]，可能是由于新生大鼠大腦處于活躍期，內源性修復是 MSC 的主要治療機制。但是，這并不能證明 BDNF 減輕缺血性腦卒中的效果不明顯。進一步的研究證明，新生小鼠缺氧缺糖誘發(fā)腦卒中，采用低溫治療手段，可誘導 BDNF 通過 p75 神經營養(yǎng)因子受體和酪氨酸激酶受體 B，激活絲裂原活化蛋白激酶，發(fā)揮神經源性作用，修復腦卒中損傷[22]。由此可見，BDNF 在發(fā)揮神經修復方面具有重要作用。

1.1.2 VEGF 研究人員發(fā)現，缺血半暗帶微血管密度較高的患者生存時間較長，提示血管生成在腦卒中患者預后中的重要地位[23]。初步研究發(fā)現，MSC 胞外囊泡增加了內皮細胞的遷移，顯著激活信號轉導和轉錄激活因子 3，抑制自噬和促進血管生成，減輕腦卒中損傷[24]。在血管生成方面，VEGF 既是主要血管重塑調控因子，也是 MSC 重要旁分泌因子。研究表明，MSC 可增加內源性 VEGF 水平，加速血管生成，增強血管穩(wěn)定性，增加腦缺血邊界區(qū)血管總表面積[25-26]。進一步研究表明，MSC 不僅促進腦組織內皮細胞分泌 VEGF，促進血管再生和支持缺血后神經再生，還能激活 Notch 信號通路促進缺血性腦卒中后血管生成[27]，并激活 Akt/ERK 信號軸發(fā)揮抗凋亡作用[28]。聯(lián)合型實驗發(fā)現，使用缺血性心臟提取物與 MSC 共培養(yǎng)，提取物中IL-22 的上調促進 MSC 分泌 VEGF 和人惡性腦腫瘤缺失蛋白 1，并向內皮細胞傳遞，增強遷移和增殖活性，促進血管生成，修復腦卒中損傷[29]。除 VEGF 外，MSC 分泌的基質金屬蛋白酶 2 也在調控腦卒中后的血管生成中發(fā)揮重要作用，與 VEGF 協(xié)同改善腦卒中[30]。以上研究表明，VEGF 介導血管生成在腦卒中修復中的不可或缺性。

1.1.3 色素上皮衍生因子 色素上皮衍生因子（pigment epithelium-derived factor，PEDF）是 MSC 重要外泌體，目前已有多項在眾多領域的研究報道。在缺血性腦卒中疾病模型中，使用 siRNA 抑制 MSC 表達 PEDF，與 siRNA-NC組相比，MSC 失去了保護氧糖剝奪再灌注處理的 N2a 細胞和 MCAO 大鼠免受高爾基體應激反應的作用[31]。另外，MSC 分泌的 PEDF 可通過促進 PI3K/Akt/mTOR 通路磷酸化，調節(jié)細胞代謝和應激[31-32]。由此可見，PEDF 調控應激是治療缺血性腦卒中的主要作用機制。

1.1.4 SDF-1 除了直接性改善作用，MSC 的促歸巢作用也得到深入研究。一項動物實驗發(fā)現，腦卒中梗死區(qū)域的膠質細胞能夠快速分泌 SDF-1，通過移植轉染過表達 CXCR4（SDF-1 的受體）的 MSC，可顯著增強 MSC 向缺血區(qū)域的遷移程度，增強神經功能修復能力，減小腦梗死面積，縮短治療時間，短期內改善大鼠行為能力[33]。這種現象的出現是因為，SDF-1 與 CXCR4 在調節(jié)腦卒中時發(fā)揮協(xié)同作用，尤其是在缺血半暗帶尤為突出。這類基因修飾 MSC 的方式為治療腦卒中提供新的策略。類似的研究報道，在大鼠發(fā)生 MCAO 后的 1、4 和 7 d 靜脈注射等量 MSC，發(fā)現紋狀體中的 SDF-1 水平隨時間延長而增加，并且 MSC 也隨著時間延長從皮質向紋狀體緩慢遷移[34]。不僅如此，腦卒中大鼠給予 MSC，可誘導內源性分泌的 bFGF 和 SDF-1表達水平均上調，共同發(fā)揮神經營養(yǎng)和保護作用[35-36]。由此可見，SDF-1 不僅對 MSC 的遷移具有重要作用，加速治療效果，而且還能促進 MSC 在病灶區(qū)域發(fā)揮更佳的修復作用。

1.1.5 其他旁分泌因子 評價缺血性腦卒中損傷程度時，腦梗死面積是重要的參考指標。研究發(fā)現，BM-MSC 可顯著提升半暗區(qū) bFGF 的表達水平，減少梗死面積和改善神經功能[26]。并且，bFGF 也具有血管重塑的能力，與 VEGF發(fā)揮協(xié)同作用[37]。音猬因子（sonic hedgehog，SHH）是一種分泌糖蛋白，能夠調節(jié)細胞增殖、遷移和分化。動物實驗表明，注射 MSC 能夠顯著增強小鼠腦卒中后腦部 SHH和 t-PA 蛋白表達，并且，當聯(lián)合使用環(huán)巴胺（平滑受體抑制劑）阻斷 SHH 通路時，出現對立性結論。結果提示，MSC 介導 SHH 通路，刺激 t-PA 表達和活性，發(fā)揮溶栓治療類似效果，恢復腦卒中后神經功能[38]。

除上述內容中提到的 MSC 旁分泌因子之外，仍有其他因子參與 MSC 治療缺血性腦卒中的作用機制，如胰島素樣生長因子 1、表皮生長因子和神經生長因子等，這些因子在抑制神經炎癥、促進神經再生等方面發(fā)揮作用。

1.2 MSC 的免疫調節(jié)作用

缺血性腦卒中發(fā)生時，損傷的腦組織導致的危險相關分子模式可觸發(fā)無菌性炎癥反應，從而快速活化缺血區(qū)與半暗區(qū)的小膠質細胞和星形膠質細胞。小膠質細胞的活化一方面具有清除碎片和分泌抗炎細胞因子能力，支持內源性腦修復[39]；另一方面小膠質細胞和星形膠質細胞的活化分泌大量炎癥因子，引發(fā)免疫過激，易引起神經細胞凋亡。

研究發(fā)現，MSC 對腦卒中后的中樞免疫反應也存在雙向調節(jié)功能：一方面可促使腦組織中的 B 細胞、NK 細胞和 T 細胞數量顯著增加，發(fā)揮免疫促進作用[40]，另一方面，高水平的炎癥因子（閾值濃度約為 400 pg/ml）可激活MSC 免疫抑制功能[41]，從而對淋巴細胞增殖和炎癥因子產生雙重抑制作用，誘導抗炎表型[42]。

研究證實，損傷區(qū)域小膠質細胞是 MSC 發(fā)揮免疫調節(jié)作用的重點靶細胞[43]。實驗證明，腦卒中后移植過表達抗炎細胞因子 IL-13 的 MSC，發(fā)揮免疫調節(jié)作用，有效調控主要聚集于受損區(qū)域皮質與紋狀體的小膠質細胞和巨噬細胞極化，使功能表型由腦損傷的促炎 M1 表型向神經元保護的抗炎 M2 表型轉變，減輕腦卒中炎癥反應，促進組織修復[44-45]。這些研究闡明了 MSC 調控小膠質細胞向抗炎表型轉變的機制。此外，相比于 2D 培養(yǎng)的 MSC，3D 培養(yǎng)的 MSC 降低小膠質細胞對缺血損傷的促炎反應效果更佳，顯著減少腦梗死面積，增加植入缺血組織的 MSC 細胞數量[46]。

進一步研究表明，PI3K/Akt/RhoGTPase 是 MSC 誘導小膠質細胞極化發(fā)揮免疫調節(jié)作用的重要信號通路[45]。并且，抑制 NF-κB 活性、分泌 IL-6 和降低 TNF-α 表達，也是 MSC 的抗炎作用機制的一部分[47]。

近期研究發(fā)現，炎癥在 COVID-19 誘發(fā)腦卒中時發(fā)揮關鍵性作用，通過注射 MSC 外泌體可顯著減輕神經炎癥，促進神經和血管生成，改善腦卒中后功能恢復。因此，移植MSC 外泌體有望成為改善 SARS-CoV-2 介導的炎癥反應和 COVID-19 介導的缺血性疾病的新治療策略[48]。

1.3 MSC 調控細胞凋亡

細胞凋亡是缺血性腦卒中重要的神經元損傷機制，MSC 可抑制神經細胞凋亡，發(fā)揮神經保護的作用。研究發(fā)現，BM-MSC 缺氧預處理再移植治療，可通過抑制caspase-3 激活和增加缺氧誘導因子 1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α）表達，降低缺血再灌注誘發(fā)的自身凋亡程度，顯著提高缺血性腦卒中治療效果[49]。AD-MSC 也具有優(yōu)秀的神經保護作用，移植后產生的外泌體可抑制KDM6B/BMP2/BMF 信號通路，減輕 MCAO 大鼠神經元凋亡[50]。此外，采用 MSC 治療可促使抗凋亡因子 Bcl-2 蛋白表達顯著升高，而與神經元凋亡相關 p53 蛋白表達明顯降低，增加缺血半暗區(qū)神經元密度[51]。不僅如此，MSC 治療還可減輕缺血性腦卒中引起的小膠質細胞焦亡，并且，缺氧預處理的 MSC 對腦出血引起損傷的治療效果更佳，進一步減少細胞焦亡出現[52]。

2 基因修飾 MSC 治療缺血性腦卒中的作用

近些年來，眾多研究團隊借助基因工程和基因編輯技術修飾 MSC，使其能特異性表達或抑制某種基因，發(fā)揮長期而穩(wěn)定的疾病干預治療作用效果。研究表明，注射過表達HIF-1α 的 MSC，可顯著減少 MCAO 大鼠腦梗死面積，改善大鼠運動功能[53]。而通過 siRNA 方法基因沉默CUEDC2 后的 MSC，能夠顯著提高其對缺血性腦卒中誘導的神經元損傷治療效果。進一步實驗發(fā)現，上調神經元谷胱甘肽過氧化物酶 1（glutathione peroxidase，GSH-Px）表達水平，并同時抑制 NF-kB 激活，是 siRNA-CUEDC2-MSC發(fā)揮腦卒中修復作用的機制[54]。

除了達到直接治療作用效果，提升 MSC 歸巢能力也是基因修飾的重要目的。以往研究表明，CXCL12/CXCR4是介導 MSC 向損傷部位遷移的主要信號軸[55]。近期研究發(fā)現，梗死區(qū)域 CCR2（CCL2 受體）水平顯著升高，可誘導過表達 CCL2（促炎趨化因子）的 UC-MSC 向大腦受損區(qū)域遷移，增強血管生成和神經生成，減少神經炎癥，顯著改善神經功能和梗死面積[56]。不僅如此，MSC 過表達CCR2 也能達到類似的治療效果[57]。提示 CCL2/CCR2 也是促 MSC 歸巢信號軸。并且，MSC 過表達神經源性轉錄因子神經源因子 1，也可顯著增強 MSC 的歸巢能力，提高 MCAO 大鼠模型的 MSC 移植效率[58]。

基于以上內容不難發(fā)現，無論是靶向性調節(jié)表達，還是促歸巢提高治療效率，基因修飾后的 MSC 具有更多可能性，能夠突破傳統(tǒng)基因修飾的局限，在未來將會有更長遠的發(fā)展。

3 MSC 的給藥途徑

不同給藥途徑也是影響 MSC 治療效果的重要影響因素。血腦屏障是阻礙 MSC 進入腦卒中病灶的主要限制條件。在腦卒中急性期內，雖然靜脈注射 MSC 只有極少量分布于損傷區(qū)域[59]，卻顯著減輕炎癥反應，維持血腦屏障完整性，減輕繼發(fā)性腦損傷[60]。由此可見，高效的給藥方式是精準治療的必要條件。

研究表明，雖然顱內給予 MSC 可靶向聚集到受損大腦，但也更具侵襲性，易造成機械損傷，不利于恢復。而相比于顱內給藥，動脈和靜脈內給藥治療效果更佳[61]。例如，通過動脈注射移植 MSC 可繞過體循環(huán)，經血腦屏障，分布于腦卒中梗死和缺血區(qū)域[62]，但存在發(fā)生細胞栓塞和腦血流減少的風險。相對應的，靜脈注射 MSC 需通過體循環(huán)和肺循環(huán)，最終穿透血腦屏障才能到達梗死區(qū)域，因此有效治療細胞數目更為有限，但仍可促進神經功能恢復，減少梗死面積，安全有效，是最為常用的干細胞移植治療腦卒中的給藥方式[63]。并且，腦卒中增加血腦屏障通透性，即使采用靜脈注射，也能達到較好的 MSC 向腦損傷區(qū)域遷移的歸巢現象。此外，鞘內注射和鼻內給藥也是可選擇的給藥方式。

4 小結與展望

近些年來，從干細胞研究的簡單分化與轉化認知，到目前 MSC 機制多樣化研究的不斷深入與拓展，干細胞研究領域的發(fā)展也變得成熟化與新穎化。但是也不可避免地存在一些問題。首先，MSC 機制研究存在不夠深入的缺陷，無法為精準治療提供較好的研究基礎。并且，基于 MSC 自身的復雜性與多向性特點，機制探索研究的開展也變得更加艱難。其次，探索 MSC 作用機制的方法與措施仍然較為局限，是快速發(fā)展通道上的限制性阻礙，技術革新刻不容緩。最后，MSC 獲取渠道有限，倫理要求高，制備繁瑣，研究開展困難。

目前來看，不僅動物實驗確證了干細胞的治療效果，提出 MSC 治療缺血性腦卒中的可行性，在眾多臨床試驗中，MSC 治療缺血性腦卒中也在穩(wěn)步推進中。截至到最近，美國臨床試驗數據庫中已注冊了近 1400 項 MSC 治療相關疾病的臨床試驗，其中 22 例是 MSC 治療缺血性腦卒中相關研究。完成的臨床試驗證明，MSC 對缺血性腦卒中患者神經功能具有顯著改善作用，并證實其有效性與長期安全性[64-65]。在未來，將會有更多 MSC 醫(yī)學成果完成轉化，投入醫(yī)療行業(yè)，為世界人民的健康與安全保駕護航。