陶寧，王華

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一種具有高度自我更新能力、多向分化潛能和低免疫原性的異質(zhì)細(xì)胞群，其來(lái)源廣泛，可從骨髓、臍帶、胎盤、脂肪、牙髓等多種組織中獲得[1]。MSCs 可以在不同誘導(dǎo)條件下分化為多種組織和細(xì)胞，并分泌多種生物活性物質(zhì)，其良好的免疫調(diào)節(jié)與組織修復(fù)功能為再生醫(yī)學(xué)提供了新的策略及思路。

在細(xì)胞治療過(guò)程中需要大量的 MSCs，這就需要對(duì)組織分離得到的 MSCs 進(jìn)行體外擴(kuò)增。在臨床級(jí)的細(xì)胞制備過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的 MSCs 增殖能力有限，隨著傳代次數(shù)的增加，還可能引發(fā)由細(xì)胞衰老導(dǎo)致的功能障礙，這極大地限制了 MSCs 的臨床應(yīng)用。并且供體的身體狀況、年齡和基因組成等因素也會(huì)影響 MSCs 的生物學(xué)功能和最終的治療效果，這其中的差異可能是 MSCs 發(fā)生了衰老所致[2]。

衰老的 MSCs 表現(xiàn)為增殖和分化能力降低，蛋白質(zhì)表達(dá)和表觀遺傳改變。越來(lái)越多的證據(jù)表明，衰老細(xì)胞可以促進(jìn)多種與年齡相關(guān)疾病的發(fā)生，從而影響機(jī)體健康，縮短壽命[3]。本文主要從 MSCs 衰老的分類、表型改變、誘導(dǎo)機(jī)制及相關(guān)解決策略等四方面進(jìn)行綜述，以期為干預(yù) MSCs細(xì)胞衰老提供參考。

1 MSCs 細(xì)胞衰老的分類

細(xì)胞衰老是指當(dāng)細(xì)胞受到外源性和內(nèi)源性刺激后，處于穩(wěn)定的細(xì)胞周期阻滯的狀態(tài)，這種狀態(tài)的維持與大分子的改變和促炎因子的分泌有關(guān)[4]。根據(jù)觸發(fā)機(jī)制的不同，MSCs細(xì)胞衰老大致分為以下四種類型。

1.1 復(fù)制性衰老

當(dāng)細(xì)胞經(jīng)歷復(fù)制周期后，端粒的長(zhǎng)度就會(huì)縮短，當(dāng)縮短到一定限度時(shí)，就會(huì)發(fā)生衰老，這種因?yàn)榧?xì)胞過(guò)度增殖所觸發(fā)的衰老稱為復(fù)制性衰老，是較為常見的體外細(xì)胞衰老類型，它與其他幾類細(xì)胞衰老密切相關(guān)[5]。MSCs 的復(fù)制性衰老是一個(gè)持續(xù)過(guò)程，在這個(gè)過(guò)程中，細(xì)胞衰老的相關(guān)指標(biāo)會(huì)發(fā)生動(dòng)態(tài)變化，細(xì)胞的表型、分化潛能和基因表達(dá)譜等也會(huì)發(fā)生相應(yīng)改變，這些改變都為尋找抗 MSCs 衰老治療的靶點(diǎn)提供參考依據(jù)[6]。

1.2 致癌基因誘導(dǎo)衰老

致癌基因的激活也會(huì)誘導(dǎo) MSCs 衰老，如細(xì)胞周期蛋白 E、快速加速纖維肉瘤激酶（rapidly accelerated fibrosarcoma ， RAF ）、 有絲分裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和鼠肉瘤病毒癌基因同源物 B1（v-raf murine viral oncogene homolog B1，BRAF）等的激活和（或）過(guò)表達(dá)都會(huì)觸發(fā) MSCs 的衰老[5]。致癌基因的激活可能作為一種遺傳應(yīng)激，導(dǎo)致培養(yǎng)的細(xì)胞發(fā)生不可逆的生長(zhǎng)停滯，這個(gè)過(guò)程通常伴隨著細(xì)胞核結(jié)構(gòu)的整體變化，特別是衰老相關(guān)易染色質(zhì)灶（senescence-associated heterochromatic foci，SAHF）的形成。在人類衰老的細(xì)胞中通常會(huì)出現(xiàn)聚集的 DNA/染色質(zhì)核區(qū)域，這些異染色質(zhì)區(qū)域可能會(huì)抑制促增殖基因的表達(dá)，從而進(jìn)一步加劇細(xì)胞衰老[7]。

1.3 壓力誘導(dǎo)衰老

在活性氧簇（reactive oxidative species，ROS）、電離輻射、滲透應(yīng)激、機(jī)械應(yīng)激、缺氧和熱休克等壓力的刺激下，細(xì)胞也會(huì)發(fā)生衰老，此類衰老稱為壓力誘導(dǎo)衰老，它的許多細(xì)胞和分子特征都與發(fā)生復(fù)制衰老的細(xì)胞相似[8]。當(dāng) MSCs受到 ROS 刺激時(shí)，會(huì)觸發(fā)腫瘤蛋白 p53/細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑 1A（p21）通路和 p38 MAPK 通路的激活，從而引發(fā)不可逆的細(xì)胞周期阻滯[9]。因此，調(diào)節(jié) ROS 的含量可以直接緩解骨髓來(lái)源 MSCs 的細(xì)胞衰老。

1.4 發(fā)育性衰老

并非所有衰老對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的影響都是消極的。在非病理狀態(tài)下，機(jī)體也可以通過(guò)多種途徑或多功能基因的調(diào)控而觸發(fā)細(xì)胞衰老，這被稱為發(fā)育性衰老，是細(xì)胞的正常發(fā)育過(guò)程[10]。其中，胰島素樣信號(hào)通路、雷帕霉素靶蛋白和Sirtuins/NAD+三條信號(hào)通路在 MSCs 的發(fā)育性衰老過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[11]。值得注意的是，這三條通路均與細(xì)胞新陳代謝的調(diào)控有關(guān)，但其發(fā)揮作用的具體機(jī)制尚在研究之中。

2 衰老 MSCs 表型的改變

衰老的細(xì)胞會(huì)發(fā)生一系列的特征性改變，如：細(xì)胞形態(tài)的改變、增殖能力的降低、衰老相關(guān) β-半乳糖苷酶（senescence-associated β-D-galactosidase，SA-β-Gal）活性的增強(qiáng)和衰老相關(guān)分泌表型（senescence-associated secretory phenotype，SASP）表達(dá)的升高等。

2.1 細(xì)胞形態(tài)改變，增殖能力降低

早期傳代的 MSCs 體積小，呈成纖維細(xì)胞樣紡錘體形態(tài)，但在長(zhǎng)期培養(yǎng)中會(huì)逐漸變得肥大、扁平，并產(chǎn)生更多的偽足和肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維。此外，由于 p53/p21-細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑 2A（p16）/腫瘤抑制因子 RB 轉(zhuǎn)錄輔阻遏因子 1（RB transcriptional corepressor 1，Rb）這兩條信號(hào)通路激活，導(dǎo)致 MSCs 細(xì)胞周期阻滯，具體表現(xiàn)為細(xì)胞有絲分裂活性降低，集落形成單位不斷減少[12]。因此，細(xì)胞增殖能力的降低，p53、p21、p16 和 Rb 基因的高表達(dá)都成為鑒定細(xì)胞衰老的有力依據(jù)。

2.2 SA-β-Gal 活性增強(qiáng)

雖然衰老細(xì)胞經(jīng)歷了不可逆的生長(zhǎng)阻滯，但仍保持一定的代謝活性，顯示出特征性的基因表達(dá)變化，通常表現(xiàn)為SA-β-Gal 活性增強(qiáng)，DDR 蛋白表達(dá)的改變，SAHFs 的特征性擴(kuò)大和持續(xù)的 DNA 損傷灶（persistent DNA damage nuclear foci，PDDF）[7,13]。其中，β-Gal 是一種溶酶體酶，在 pH 6.0 時(shí)具有催化 β-半乳糖苷的活性。SA-β-Gal 反映了溶酶體的功能障礙，它是廣泛使用的細(xì)胞衰老標(biāo)志物，也是目前鑒定細(xì)胞衰老最常用的方法之一。在衰老過(guò)程中，由于溶酶體活性增加和胞漿 pH 值改變，SA-β-Gal 陽(yáng)性的MSCs 百分比明顯增加[7,14-15]。但是由于衰老表型的復(fù)雜性，目前仍沒(méi)有任何指標(biāo)能夠單獨(dú)鑒定 MSCs 的衰老。

2.3 SASP 表達(dá)升高

SASP 是一種復(fù)雜的、快速變化的多組分成分，并在一定程度上隨時(shí)間變化[16]。SASP 的一個(gè)顯著特征就是衰老細(xì)胞分泌大量的促炎分子，包括細(xì)胞因子、趨化因子、生物活性脂質(zhì)和損傷相關(guān)分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs）等[17]。越來(lái)越多的證據(jù)表明：細(xì)胞衰老與機(jī)體衰老及年齡相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

臨床級(jí) MSCs 的療效可歸功于有益旁分泌因子的作用。因此，包含這些分泌因子的 MSCs 條件培養(yǎng)基在各種疾病的治療中發(fā)揮有益作用。如：在骨髓來(lái)源的衰老 MSCs中，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、胎盤生長(zhǎng)因子（placental growth factor，PGF）和肝生長(zhǎng)因子（hepatic growth factor，HGF）等促進(jìn)血管生成的因子分泌減少，而血栓反應(yīng)蛋白-1（thrombospondin-1，TBS1）和纖溶酶原激活物抑制劑-1（plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）等抗血管生成因子分泌增加[18]。因此，衰老會(huì)對(duì)血管生成產(chǎn)生負(fù)面影響，并直接影響 MSCs 的治療效果。

3 MSCs 衰老的機(jī)制

正常的體細(xì)胞增殖能力有限，具有有絲分裂能力的細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞衰老來(lái)響應(yīng)多種應(yīng)激原的刺激。這些應(yīng)激原主要包括：端粒功能失調(diào)、DNA 損傷、線粒體功能障礙、細(xì)胞自噬失衡以及表觀遺傳改變等，其中 DNA 損傷反應(yīng)（DNA damage response，DDR）居于核心地位。

3.1 DNA 損傷

DDR 對(duì)于細(xì)胞基因組穩(wěn)定性和組織存活都是至關(guān)重要的。DNA 損傷可通過(guò)改變特定基因的表達(dá)，直接導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙；也可以通過(guò)觸發(fā)細(xì)胞對(duì)損傷的應(yīng)答，間接導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙，從而能夠更廣泛地改變基因表達(dá)[19-20]。由于DNA 復(fù)制錯(cuò)誤以及暴露于內(nèi)源性和外源性誘變劑環(huán)境中，DNA 損傷會(huì)在生物體的整個(gè)生命周期內(nèi)累積。

細(xì)胞在不斷復(fù)制過(guò)程中，端粒會(huì)發(fā)生縮短，這是 MSCs衰老過(guò)程中發(fā)生的內(nèi)源性變化之一。當(dāng)端粒縮短到一定程度時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致 DNA 無(wú)法繼續(xù)復(fù)制，染色體的穩(wěn)定性也無(wú)法保證，從而觸發(fā)由 p53 介導(dǎo)的 DDR，進(jìn)而誘發(fā)衰老應(yīng)答。

此外，氧化應(yīng)激、電離輻射、缺氧和機(jī)械應(yīng)激等其他因素也可能導(dǎo)致細(xì)胞 DNA 損傷，并引起 DNA 雙鏈斷裂（DNA double-strand breaks，DSBs）[6,21]。DSBs 是細(xì)胞衰老有效的激活因子。

當(dāng)細(xì)胞發(fā)生 DNA 損傷時(shí)，會(huì)觸發(fā) DDR 網(wǎng)絡(luò)，從而感知損傷并啟動(dòng)突變修復(fù)[22]。DDR 網(wǎng)絡(luò)首先通過(guò)激活細(xì)胞周期相關(guān)蛋白 p53 的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶 2（cyclin-dependent kinases 2，CDK2）的調(diào)節(jié)基因p21WAF1/Cip1的表達(dá)，從而使細(xì)胞進(jìn)入周期阻滯狀態(tài)[22]。當(dāng)細(xì)胞持續(xù)產(chǎn)生 DNA 損傷應(yīng)答信號(hào)時(shí)，p38MAPK 介導(dǎo)的線粒體功能障礙和 ROS 的產(chǎn)生會(huì)激活 p16INK4A，導(dǎo)致 CDK的抑制和 Rb1 的激活，從而誘導(dǎo)衰老[23]。因此，增強(qiáng) DNA修復(fù)途徑的活性可能有助于緩解 MSCs 的衰老。

3.2 線粒體功能障礙

線粒體作為細(xì)胞能量代謝的中心，參與多種細(xì)胞活動(dòng)，如細(xì)胞基質(zhì)的代謝、凋亡和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的啟動(dòng)。發(fā)生復(fù)制性衰老的 MSCs，其線粒體會(huì)變長(zhǎng)，當(dāng)受損嚴(yán)重時(shí)，會(huì)出現(xiàn)破碎的、片狀線粒體，并引發(fā)線粒體功能障礙[5]。線粒體功能障礙則可通過(guò)破壞胞質(zhì)中 NAD+/NADH 的比值、ROS的產(chǎn)生和其他機(jī)制誘導(dǎo)衰老。

其中，ROS 在線粒體中的過(guò)度積累是造成線粒體功能障礙的主要原因，而輻射、紫外線、缺氧和低溫等外部因素都會(huì)促進(jìn) ROS 的產(chǎn)生。ROS 作為一種代謝副產(chǎn)物，可以通過(guò)產(chǎn)生次級(jí)活性代謝產(chǎn)物來(lái)誘導(dǎo)氧化和其他類型的細(xì)胞反應(yīng)。雖然生理水平的 ROS 對(duì)于細(xì)胞的增殖和分化都是必要的，但過(guò)量的 ROS 可以誘導(dǎo) DNA 損傷并加速端?？s短，這兩種損傷均可激活 DDR，從而觸發(fā) MSCs 的衰老[24]。與正常細(xì)胞相比，線粒體功能障礙所致的衰老（mitochondrial dysfunction-associated senescence，MiDAS）MSCs 會(huì)釋放大量 ROS，導(dǎo)致 DDR 的持續(xù)激活，從而在衰老進(jìn)程中形成正反饋[25]。研究表明：色氨酸代謝產(chǎn)物如5-甲氧基色氨酸（5-methoxytryptophan，5-MTP）和褪黑素，可以通過(guò)維持線粒體完整性和功能，減少 ROS 生成，以緩解金屬汞誘導(dǎo)的 MSCs 衰老[26]。

3.3 細(xì)胞自噬失衡

自噬是一種高度保守的生理過(guò)程，在真核細(xì)胞中廣泛存在。它可以調(diào)控分子降解和細(xì)胞器更新，因而在生理和病理?xiàng)l件下對(duì)于維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)都發(fā)揮著關(guān)鍵作用，但是過(guò)度的自噬可能引起細(xì)胞死亡[27]。減少細(xì)胞內(nèi)損傷的積累有助于維持細(xì)胞靜止期和衰老狀態(tài)之間的平衡，細(xì)胞自噬可以通過(guò)降解蛋白質(zhì)和線粒體等受損的細(xì)胞成分，從而減少與細(xì)胞衰老相關(guān)的損傷[28]。衰老的 MSCs 通常表現(xiàn)為自噬減少，這會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞中蛋白酶水平失衡，線粒體活性、氧化應(yīng)激和代謝狀態(tài)的提高，從而進(jìn)一步加劇了細(xì)胞的衰老[22]。自噬作為抗衰老的靶點(diǎn)已被廣泛應(yīng)用，通過(guò)用 AMPK 激活劑阿卡地辛和 Sirtuin 激活劑煙酰胺抑制雷帕霉素靶蛋白 C1（mammalian target of rapamycin C1，mTORC1）可以促進(jìn)自噬，保留 MSCs 的自我更新和分化能力，并減輕與細(xì)胞衰老相關(guān)的變化[29]。

3.4 表觀遺傳的改變

表觀遺傳的變化既是對(duì)細(xì)胞衰老的響應(yīng)，也是影響衰老發(fā)生的重要因素[30]。表觀遺傳的變化是指在 DNA 序列不改變的情況下，基因功能發(fā)生了可遺傳的變化，DNA 甲基化、組蛋白修飾和染色質(zhì)重塑等在此過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[31]。研究表明，來(lái)自老年個(gè)體的 MSCs 表現(xiàn)出異染色質(zhì)相關(guān) H3K9me3 表達(dá)普遍減少以及異染色質(zhì)維持蛋白表達(dá)下調(diào)[32]。在 Werner 早衰綜合征的胚胎干細(xì)胞模型中也出現(xiàn)類似的改變，研究發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增長(zhǎng)，異染色質(zhì)紊亂可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙[32]。目前的研究結(jié)果顯示：表觀遺傳的變化是衰老 MSCs 的普遍特征，但是還需要進(jìn)一步研究來(lái)明確這些變化與 MSCs 衰老的因果關(guān)系。

4 MSCs 衰老的解決策略

目前，對(duì)于細(xì)胞衰老的調(diào)控研究主要集中在利用基因工程、基因編輯和藥理學(xué)等方法調(diào)節(jié)衰老關(guān)鍵信號(hào)分子/通路及相關(guān)細(xì)胞因子等的表達(dá)。

細(xì)胞基因工程是一種可預(yù)防細(xì)胞衰老的方法。核小體組裝蛋白 1（nucleosome assembly protein 1，NAP1）是一個(gè)高度保守的基因家族，它與真核生物中的核小體裝配、組蛋白修飾、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和細(xì)胞增殖等過(guò)程密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，其家族成員 NAP1L2 表達(dá)水平的升高與骨髓來(lái)源 MSCs的衰老和成骨潛能受損相關(guān)。實(shí)驗(yàn)通過(guò)感染病毒敲低NAP1L2 基因的表達(dá)，結(jié)果顯示 MSCs 的 SA-β-Gal 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少，衰老及炎癥相關(guān)基因表達(dá)水平降低[33]。

基因編輯技術(shù)的應(yīng)用是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，如誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）衍生的MSCs，細(xì)胞在重編程過(guò)程中會(huì)發(fā)生再生。其 DNA 甲基化譜保持供體特異性，而組織特異性及與年齡和衰老相關(guān)的DNA 甲基化譜則在重編程過(guò)程中被清除，從而表現(xiàn)出更好的細(xì)胞活力，使得細(xì)胞可以傳代超過(guò) 40 次而不表現(xiàn)出衰老特征[34-35]。

藥理學(xué)方法也可以作為抑制體外培養(yǎng)中 MSCs 衰老的有效手段。抗壞血酸在許多生物過(guò)程中都扮演輔助因子的角色，它作為一種天然的抗氧化劑，能夠有效清除細(xì)胞中的ROS[36]。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗壞血酸可以通過(guò)激活 Akt/mTOR信號(hào)通路抑制 MSCs 中的 ROS 生成，并減少 D-半乳糖處理的 MSCs 中 SA-β-Gal 陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量和 p16 的表達(dá)，緩解 MSCs 的衰老[37]。

由于衰老誘發(fā)因素的多樣性和復(fù)雜性，以及衰老調(diào)控機(jī)制之間存在錯(cuò)綜復(fù)雜的聯(lián)系，致使 MSCs 衰老現(xiàn)象不能用單一的機(jī)制進(jìn)行闡釋，也無(wú)法通過(guò)單一的方法來(lái)干預(yù)多種類型的細(xì)胞衰老。雖然目前已有的手段對(duì)于體外干預(yù)細(xì)胞衰老顯示出初步成效，但是普遍存在操作技術(shù)復(fù)雜、持久安全性無(wú)法保證的缺點(diǎn)。

5 結(jié)語(yǔ)

細(xì)胞衰老是一種由不同應(yīng)激刺激的異質(zhì)性細(xì)胞狀態(tài)。在體內(nèi)，衰老細(xì)胞的慢性累積會(huì)導(dǎo)致組織功能障礙和各種年齡相關(guān)疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的增加；在體外，衰老細(xì)胞會(huì)對(duì)其細(xì)胞治療的效果產(chǎn)生嚴(yán)重影響，這就需要我們對(duì) MSCs 的衰老進(jìn)行多方面多層次的深入探索。

首先，深入探索 MSCs 衰老的形成機(jī)制。MSCs 衰老的誘發(fā)因素及細(xì)胞表型的改變錯(cuò)綜復(fù)雜，MSCs 衰老分子機(jī)制的闡明有助于進(jìn)一步明確 MSCs 功能障礙的驅(qū)動(dòng)因素和效應(yīng)因素，從而在緩解 MSCs 功能障礙以及提升臨床級(jí)MSCs 療效方面提出可行性方案。

其次，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞早期衰老的標(biāo)志物。目前建立的衰老標(biāo)志物如 p16、p53 和 SA-β-Gal 等均可用于識(shí)別衰老細(xì)胞，但都不能作為鑒定早期細(xì)胞衰老的獨(dú)立指標(biāo)。因此，我們還需要探究與 MSCs 衰老相關(guān)的特異性的新靶點(diǎn)，以更好地鑒定 MSCs 的早期衰老。

最后，提出干預(yù) MSCs 衰老的新策略。目前已有的抗MSCs 衰老手段很多，但是在持久的安全性方面都無(wú)法得到保障，這極大限制了這些干預(yù)手段在臨床上的應(yīng)用。因此，對(duì)干預(yù) MSCs 衰老新策略的探究，仍是未來(lái)研究的發(fā)展方向。