凌珊珊，王平峰，黃曉宇，黃 炎，屈元元，葉 剛，楊福興

（1.中國(guó)大熊貓保護(hù)研究中心，四川 都江堰 611830；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，四川 成都 611130）

細(xì)胞色素氧化酶（COX）位于線粒體內(nèi)膜，是呼吸鏈中唯一能夠?qū)⒀踹€原成水的復(fù)合物，在能量產(chǎn)生過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［1］。它由13 個(gè)結(jié)構(gòu)亞基組成，COX I-III 由線粒體基因編碼，形成細(xì)胞色素C氧化酶的催化核心［2］，其余10個(gè)亞基由核基因編碼，參與調(diào)節(jié)酶的活性［3］。細(xì)胞色素氧化酶亞基I 由COX I 編碼，是COX 亞基中最大、最保守的亞基，COX I 與CuB、血紅素α3以及血紅素α結(jié)合［4］。COX I 基因突變將影響COX I 多肽的翻譯和呼吸鏈復(fù)合體IV 的組裝，進(jìn)而導(dǎo)致COX 缺失，臨床表現(xiàn)出肌病、腦病、失明、聽(tīng)力喪失和周?chē)窠?jīng)病變等［5］。COX I 基因除參與線粒體能量代謝外，還可作為條形碼基因用于研究物種進(jìn)化及生物學(xué)分類(lèi)［6］。

大熊貓作為我國(guó)特有的珍稀動(dòng)物，被列為國(guó)家一級(jí)保護(hù)野生動(dòng)物。迄今為止，關(guān)于大熊貓COX I蛋白序列和結(jié)構(gòu)的研究鮮有報(bào)道。本研究利用基因克隆技術(shù)獲取了COX I 基因序列，構(gòu)建了大熊貓與其他動(dòng)物的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并對(duì)大熊貓COX I 核酸序列、編碼蛋白的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)等進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。

1 材料與方法

1.1 材料 血樣：大熊貓血樣采集自四川臥龍中國(guó)大熊貓保護(hù)中心，所采集的血樣加入適量Trizol 后凍存于液氮中。試劑：Trelief 5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，PCR Mix，pGL3-protomer 載體及TreliefTMSoSoo Cloning Kit（北京擎科新業(yè)生物）；RNA 抽提試劑Trizol 試劑（賽默飛世爾）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（南京諾維贊）；LB 肉湯培養(yǎng)基（海博生物）；切膠回收試劑盒（QIAuick生物）。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)GenBank 公布的大熊貓COX I 基因序列，采用Snapgene 軟件設(shè)計(jì)了一對(duì)同源臂引物。引物序列為：

HR-COX I-F：GCGTGCTAGCCCGGGCTCGA GATGTTCATTAACCGATGACT；HR-COX I-R：AATTGAGATGCAGATCGCTGATCTCGAGTTATT TCAGTATGACGTGGG。引物由北京擎科生物公司合成。

1.2.2 RNA 的提取與反轉(zhuǎn)錄 根據(jù)RNA 提取和反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，提取大熊貓血液總RNA；隨后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后將生成的cDNA保存于-20 ℃冰箱。

1.2.3 PCR擴(kuò)增 將保存的cDNA作為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后，PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并在電泳結(jié)束后拍照。

1.2.4 克隆與測(cè)序 PCR 產(chǎn)物純化后與載體連接，然后轉(zhuǎn)化，產(chǎn)物于37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜；將單個(gè)菌落擴(kuò)菌后的菌液為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再送樣測(cè)序。

1.2.5 大熊貓COX I蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測(cè) 使用ExPASy-ProtParam Tool 對(duì)大熊 貓COX I 蛋白 的分子式、等電點(diǎn)等理化性質(zhì)進(jìn)行分析，應(yīng)用Proscale工具進(jìn)行親水性和疏水性預(yù)測(cè)。

1.2.6 大熊貓COX I蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 使用ExPASy GOR Ⅳ 4.0 和PredictProtein分析COX I 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，用SWISS-MODEL預(yù)測(cè)COX Ⅰ蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.7 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建 登錄NCBI 下載北極熊、懶熊和眼鏡熊等15個(gè)物種的COX I氨基酸序列，隨后使用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 大熊貓COX I序列分析及理化性質(zhì) 電泳結(jié)果顯示PCR 產(chǎn)物條帶明亮，長(zhǎng)度為1 600 bp 左右（圖1）。測(cè)序結(jié)果使用Snapgene 軟件拼接，結(jié)果顯示大熊貓COX I 基因的長(zhǎng)度為1 545 bp，堿基含量分別為：A 26.86%，C 23.11%，G 17.999%，T 32.04%，GC 含量為41.10%。經(jīng)BLAST 比對(duì)，與已公布的COX Ⅰ基因（GenBank Accession NO：KU955847.1）的同源性為99.81%，共有3 個(gè)堿基存在差異：843 位（A 突變?yōu)镚）、954 位（T 突變?yōu)镃）和1 494 位（C 突變?yōu)門(mén)），但均不影響氨基酸編碼。使用ExPASy-ProtParam Tool 分析其編碼氨基酸序列，得出COX I 基因編碼蛋白由514 個(gè)氨基酸組成，原子總數(shù)為8 027 個(gè)，分子式為C2687H4008N626O671S35，分子質(zhì)量為56 939.27u（56.9ku），半衰期理論值為30 h；負(fù)電荷氨基酸殘基數(shù)為24個(gè)，正電荷氨基酸殘基數(shù)為17個(gè)，等電點(diǎn)為6.22；不穩(wěn)定系數(shù)為29.04，屬于穩(wěn)定蛋白，脂肪指數(shù)為102.65，總平均親水系數(shù)為0.704。

圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.2 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù) 在序列比對(duì)的基礎(chǔ)上，采用MEGA 7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，發(fā)現(xiàn)大熊貓COX Ⅰ氨基酸序列與其他熊科動(dòng)物位于同一進(jìn)化分支上（圖2），其中與懶熊的相似度最高，達(dá)98.6%。

圖2 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.3 親水性和疏水性 如圖3 所示，COX I 蛋白第441 位的絲氨酸殘基的親水性最強(qiáng)（分值為-2.511），第192位的丙氨酸的疏水性最強(qiáng)（分值為3.244）。整體來(lái)看，COX I 蛋白中疏水性氨基酸多于親水性氨基酸，屬于疏水性蛋白質(zhì)。

圖3 大熊貓COX I蛋白親水性和疏水性分析

2.4 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu) 預(yù)測(cè)結(jié)果如圖4所示，大熊貓COX I蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)包括α螺旋、延伸鏈和無(wú)規(guī)則卷曲，其中延伸鏈占37.94%，無(wú)規(guī)則卷曲占42.80%，α螺旋占19.26%。大熊貓COX Ⅰ蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型如圖5所示，預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)中含有α螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲，與二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

圖4 大熊貓COX I蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

圖5 大熊貓COX Ⅰ蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

3 小結(jié)

本試驗(yàn)通過(guò)克隆測(cè)序獲得了大熊貓COX I基因序列，經(jīng)克隆測(cè)序得到的大熊貓COX I 基因核苷酸序列與NCBI 上公布的COX I 基因（GenBank Accession NO：KU955847.1）的同源性為99.81%，共有3 個(gè)堿基存在差異，但均不影響氨基酸編碼。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果顯示大熊貓與懶熊、棕熊、北極熊、眼鏡熊聚類(lèi)成一簇，該結(jié)果與吳夏等［7］對(duì)四川黑熊的研究結(jié)果相似。本研究結(jié)果將為后續(xù)開(kāi)展大熊貓的能量代謝和生物學(xué)進(jìn)化提供參考。