茍紀(jì)權(quán)，蘇麗文，程志魁，黃小春，吳雯婷，呂海旋，劉政國(guó)

（廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，南寧 530001）

0 引言

冬瓜(Benincasa hispida)原產(chǎn)于中國(guó)的南部和東南亞、印度等地區(qū)，在亞洲的熱帶、亞熱帶及溫帶地區(qū)都有分布[1]。作為國(guó)內(nèi)重要的蔬菜種類，冬瓜能夠調(diào)節(jié)蔬菜淡季、保證蔬菜周年供應(yīng)。果肉顏色是消費(fèi)者選擇的一個(gè)重要性狀，也是育種的一個(gè)關(guān)鍵性狀[2]。果蔬的綠色主要來(lái)源于葉綠素[3]，冬瓜果肉顏色一般為白色，綠色果肉是冬瓜中的稀有資源，果肉中葉綠素含量越多，果肉綠色越深。黃瓜綠色果肉的形成可能是由于果實(shí)發(fā)育過(guò)程中葉綠素的積累，葉綠素含量較高的黃瓜通常來(lái)自高緯度地區(qū)，合理的解釋是，高緯度地區(qū)的光照時(shí)間較長(zhǎng)，可以維持較長(zhǎng)的光合作用并改善葉綠素合成[4]。在甜瓜中，葉綠素和類胡蘿卜素的積累使甜瓜具有白色、綠色、橙色的果肉[5]。Galpaz等[6]通過(guò)QTL分析確定了一個(gè)候選白肉基因(CmPPR1)，該基因是決定甜瓜果肉顏色的2個(gè)主要基因座之一，CMPPR1編碼五三肽蛋白(PPR)家族的一員，參與質(zhì)體中RNA的加工，類胡蘿卜素和葉綠素色素在質(zhì)體中積累。

葉綠素含量是未成熟果實(shí)的一個(gè)重要特征，影響成熟果實(shí)的營(yíng)養(yǎng)成分和風(fēng)味[4]。肉質(zhì)果實(shí)的光合作用占水果總碳水化合物的20%[7-8]。未成熟果實(shí)的葉綠體發(fā)育和葉綠素含量的增加提高了它們的光合作用能力，導(dǎo)致淀粉的積累更大[9-11]。此外，未成熟水果的淀粉含量與成熟水果中的糖含量呈正相關(guān)，通過(guò)影響營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和風(fēng)味直接影響水果質(zhì)量[12]。因此，葉綠體發(fā)育和未成熟果實(shí)的碳水化合物狀態(tài)會(huì)影響成熟果實(shí)的組成和質(zhì)量。此外，葉綠素及其各種衍生物在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中具有悠久的使用歷史[13]，具有抗膽固醇、預(yù)防便秘等功效[3]。研究表明葉綠素銅鈉(SCC)具有愈合傷口[14]、抗炎特性[15-16]等功效，高葉綠素飲食與降低人類結(jié)腸癌的風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)[17]。

目前，關(guān)于葉綠素含量的遺傳規(guī)律已在黃瓜、苦瓜、白菜等作物中報(bào)道。孫小鐳等[18]探究黃瓜果皮中的葉綠素遺傳規(guī)律，表明黃瓜果皮中的葉綠素含量的主基因中加性效應(yīng)明顯，多基因顯性效應(yīng)明顯。在烤煙[19]、苦瓜葉片[20]、不結(jié)球白菜[21]葉綠素含量遺傳分析中發(fā)現(xiàn)，性狀是由1對(duì)加性-顯性主基因+加性-顯性-上位性多基因調(diào)控，表現(xiàn)出較高的主基因遺傳率，同時(shí)也受到環(huán)境的影響，因此，在育種過(guò)程中需要考慮環(huán)境影響因素。在番茄[22]、玉米[23]、水稻[24]中也同樣進(jìn)行了葉綠素含量的主基因和多基因的作用效應(yīng)探究，而目前在冬瓜果肉葉綠素含量的遺傳研究方面還未見(jiàn)報(bào)道[24]。

筆者利用果肉顏色差異明顯的2個(gè)冬瓜自交系雜交得到F1，F(xiàn)1自交得到F2，分析冬瓜果肉中葉綠素的主基因和多基因的遺傳效應(yīng)，以期揭示葉綠素含量在冬瓜果肉中的遺傳機(jī)制，探究其在遺傳規(guī)律中主基因和多基因的遺傳效應(yīng)，為冬瓜果肉顏色的基因定位和品種改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院劉政國(guó)課題組保存的LT-1和LT-2為親本（圖1），LT-1為母本(P1)，LT-2為父本(P2)雜交得到了F1世代群體，F(xiàn)1自交得到F2世代群體。LT-1的果肉為白色，LT-2的果肉為綠色。

圖1 親本LT-1、LT-2

1.2 田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2020年8月種植母本LT-1、父本LT-2、F1各12株，F(xiàn)2群體200株，四代群體種植于露天大田，田間根據(jù)冬瓜生長(zhǎng)期規(guī)律管理，搭架栽培，前期及時(shí)去側(cè)蔓，保留主蔓，保證水肥充足，每株保留3個(gè)冬瓜果實(shí)，作為3次重復(fù)。

1.3 葉綠素含量測(cè)定

選取母本(P1)8株、父本(P2)7株、F1群體7株、F2群體194株，在每一植株選取3個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育正常的嫩瓜（15天），即為3次重復(fù)；然后在冬瓜的果實(shí)果肉中間部位選取3塊冬瓜果肉測(cè)定果肉中葉綠素含量。

參照李合生[25]的葉綠素含量的測(cè)量方法，利用乙醇萃取法，稱取1 g果肉漿液，加入10 mL乙醇溶液，在波長(zhǎng)為665、649 nm下測(cè)定溶液的吸光度值。

1.4 遺傳模型分析

運(yùn)用主基因+多基因混合遺傳分析[26]方法，計(jì)算出每一遺傳模型的各參數(shù)值，根據(jù)最優(yōu)模型的選擇原則選出最優(yōu)模型，并對(duì)最優(yōu)模型的參數(shù)進(jìn)行分析[27]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2019和SPSS 18軟件對(duì)冬瓜4個(gè)世代群體的果肉葉綠素含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，繪制頻次分布圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 四世代群體的葉綠素含量統(tǒng)計(jì)及F2代群體頻次分布

由圖2可以看出，親本P1和P2葉綠素含量差異顯著，低葉綠素含量的親本P1的果肉顏色呈現(xiàn)白色，高葉綠素含量的親本P2的果肉顏色呈現(xiàn)綠色，再一次證明葉綠素是綠色果肉形成的重要因素。對(duì)4個(gè)世代群體葉綠素含量的統(tǒng)計(jì)分析見(jiàn)表1。F1世代葉綠素含量在高值親本和低值親本葉綠素含量之間，但未達(dá)到兩親本的平均值，說(shuō)明高值葉綠素對(duì)低值葉綠素表現(xiàn)出了不完全顯性。F2群體葉綠素含量分離范圍為0.55～7.45 μg/g，分離范圍較大且各植株間的差異呈極顯著差異，說(shuō)明群體的分離程度大，從F2群體的葉綠素含量頻次分布圖（圖3）可以看出，葉綠素含量主要集中在0.8 μg/g附近，集中分布在P1的葉綠素含量值附近，并向兩側(cè)逐漸減少。此外葉綠素含量在F2分離世代中表現(xiàn)為雙峰偏正態(tài)分布，說(shuō)明該性狀屬于數(shù)量性狀，可對(duì)其主基因和多基因的遺傳規(guī)律進(jìn)行探究和分析。

圖2 親本與雜交一代的冬瓜果肉葉綠素含量統(tǒng)計(jì)

表1 4個(gè)世代群體冬瓜果肉葉綠素含量的基本參數(shù)

圖3 F2代冬瓜果肉葉綠素含量的頻次分布

2.2 各遺傳模型參數(shù)計(jì)算和分析

運(yùn)用主基因+多基因的混合分離分析方法，分析在冬瓜果肉中葉綠素含量，分析得出每一遺傳模型的極大對(duì)數(shù)似然值和AIC值（見(jiàn)表2）。其中對(duì)各遺傳模型的AIC值進(jìn)行分析，得到3組AIC值最小遺傳模型作為候選模型。冬瓜果肉葉綠素最小的3個(gè)AIC值分別為691.691、688.09、692.566，其對(duì)應(yīng)的遺傳模型分別為MX2-AD-AD、MX2-ADI-AD、MX2-EAD-AD，選擇這3個(gè)遺傳模型作為候選最適模型。進(jìn)一步對(duì)這3個(gè)候選最適模型做適合性檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。MX2-ADIAD模型達(dá)顯著差異水平的統(tǒng)計(jì)量最多，為2項(xiàng)，而MX2-AD-AD、MX2-EAD-AD模型為0項(xiàng)。根據(jù)AIC值最小結(jié)合顯著差異水平的統(tǒng)計(jì)量少，從而選擇MX2-AD-AD作為冬瓜果肉中葉綠素含量的最優(yōu)模型，即表現(xiàn)由2對(duì)加性—顯性—上位性主基因+加性顯性多基因遺傳模型控制。

表2 遺傳模型的參數(shù)統(tǒng)計(jì)

表3 MX2-AD-AD、MX2-ADI-AD、MX2-EAD-AD模型的適合性檢驗(yàn)

2.3 最優(yōu)模型MX2-AD-AD遺傳參數(shù)估計(jì)

由表4可得，一階遺傳參數(shù)中，第1對(duì)主基因的加性效用為-1.477，第2對(duì)主基因的加性效用為-0.835，且這2對(duì)主基因的加性效應(yīng)值都為負(fù)值，起到了減效作用，同時(shí)第1對(duì)主基因的加性效應(yīng)絕對(duì)值大于第2對(duì)主基因加性效應(yīng)的絕對(duì)值，表明在加性效應(yīng)中，第1對(duì)主基因占主導(dǎo)地位。經(jīng)計(jì)算2對(duì)主基因的顯性度ha/da、hb/db分別為0.99、0.856，顯性度均小于1，但2對(duì)主基因的顯性度接近1，說(shuō)明2對(duì)主基因在控制冬瓜果肉葉綠素遺傳中的加性效應(yīng)和顯性效應(yīng)同樣占重要地位，均為負(fù)值，起減效作用。多基因的加性效應(yīng)[d]為-0.514，加性效應(yīng)值都為負(fù)值，起到了減效作用，顯性效應(yīng)[h]為0.722，多基因顯性度[d]/[h]絕對(duì)值小于1，說(shuō)明多基因主要以加性效應(yīng)為主。

表4 最佳模型的遺傳參數(shù)

從二階遺傳參數(shù)中得出，葉綠素含量的主基因遺傳率較高，為82.1%，多基因遺傳率為0%，說(shuō)明冬瓜果肉中的葉綠素含量受主基因的影響較大，同時(shí)也受到環(huán)境的影響，因此在選擇育種中應(yīng)選擇高世代，注意在種植過(guò)程中對(duì)環(huán)境的調(diào)控，保證育種目的的實(shí)現(xiàn)。

3 結(jié)論與討論

當(dāng)前主基因+多基因的分析方法已經(jīng)應(yīng)用于冬瓜的種子、果形、枯萎病的遺傳規(guī)律研究中。冬瓜的種子千粒重主基因和多基因的加性效應(yīng)占主導(dǎo)地位，因此在對(duì)種子千粒重進(jìn)行選擇育種時(shí)，需注重加性效應(yīng)的利用[28]。在冬瓜枯萎病中同樣是以隱性多基因的加性效應(yīng)為主導(dǎo)地位，表型中感病對(duì)抗病為部分顯性，且起減效作用[29]，在冬瓜果形指數(shù)、橫徑、縱徑之間的相關(guān)性顯著，且都以主基因遺傳為主，育種過(guò)程中可在早世代進(jìn)行選擇[30]。另外，該主基因加多基因遺傳分析方法也成功運(yùn)用于其他作物的性狀遺傳分析上，如煙草的株高[31]和青枯病抗性[32]、小麥穗部性狀[33]、辣椒果皮顏色[34]。因此利用該分析方法可對(duì)作物數(shù)量性狀進(jìn)行遺傳分析，為選擇育種提供理論借鑒。

目前，關(guān)于冬瓜綠色果肉的遺傳研究還未見(jiàn)報(bào)道。本研究利用綠色果肉和白色果肉純和自交系構(gòu)建了P1、P2、F1、F24代遺傳群體，探究葉綠素的遺傳規(guī)律，發(fā)現(xiàn)F2群體葉綠素含量的分布符合雙峰偏正態(tài)分布，符合數(shù)量性狀的特征，存在明顯的主基因遺傳。本研究結(jié)果表明，冬瓜果肉葉綠素含量受2對(duì)加性—顯性—上位性主基因+加性顯性多基因遺傳模型控制，此結(jié)果與玉米葉片葉綠素含量相同[35]，與此類似的是在黃瓜嫩果果皮葉綠素含量[36]和水稻苗期葉綠素含量[37]，都是受到2對(duì)主基因和多基因共同控制。

本研究結(jié)果表明，在瓜果肉葉綠素含量的遺傳中，其主基因的加性效應(yīng)表現(xiàn)明顯，F(xiàn)2世代的主基因遺傳率高達(dá)82.0696%，說(shuō)明該性狀的遺傳變異受到主基因的控制較大，在選育過(guò)程中應(yīng)在早世代中選擇育種，同時(shí)注意環(huán)境的影響。翟英等[38]以綠色和紫色番茄植株為親本，構(gòu)建了6個(gè)遺傳群體，即P1、P2、F1、BC1、BC2和F2，通過(guò)數(shù)量性狀的多代聯(lián)合分析研究果實(shí)顏色和色素含量的遺傳規(guī)律，其中葉綠素的遺傳模型為MX1-AD-ADI，F(xiàn)2的主基因遺傳率為59%，多基因的遺傳率均為0%，與本研究的冬瓜果肉葉綠素的遺傳特點(diǎn)相似，而與此相反的是，在黃瓜幼苗葉片光照不足的情況下，其葉片中葉綠素含量中的微效多基因起到主導(dǎo)作用，環(huán)境的影響不可忽略，因此不適宜進(jìn)行早代選擇[39]。本研究首次利用果肉葉綠素含量具有明顯差異的高代純合自交系構(gòu)建了4個(gè)世代分離群體，進(jìn)行了主基因＋多基因遺傳分析，研究結(jié)果為冬瓜綠色果肉的選育提供了一定的參考。但本研究只在一種環(huán)境下對(duì)一個(gè)群體進(jìn)行了研究，具有一定的局限性，在今后的研究中應(yīng)采用多環(huán)境多群體聯(lián)合分析，以獲得更準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。此外，在遺傳分析的基礎(chǔ)上利用下一代測(cè)序技術(shù)，對(duì)控制冬瓜綠色果肉顏色基因進(jìn)行精細(xì)定位，開(kāi)發(fā)與其緊密連鎖的分子標(biāo)記。