劉雙雙，梁淼，謝雅婷，馮亮，楊艷，余愛(ài)農(nóng)*

(1.湖北民族大學(xué) 生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 恩施 445000；2.湖北民族大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 恩施 445000)

毛葉木姜子(LitseamollisHemsl.)又稱山胡椒、木姜子、大木姜，為樟科(Lauraceae)木姜子屬，在我國(guó)主要分布于廣東、湖北、四川等地，是我國(guó)特有的香料植物資源之一[1]。在中國(guó)西南部，毛葉木姜子的嫩果可以用醬油、醋、胡椒、大蒜和姜腌制成開(kāi)胃涼菜或者提取其揮發(fā)油作為食物的調(diào)味料[2]，也可以作為天然殺菌料復(fù)合于食品調(diào)味料中，達(dá)到殺菌防腐、協(xié)調(diào)風(fēng)味的多重效果，具有抗菌、鎮(zhèn)咳、祛痰作用[3]。

作為一種香辛料，其香氣對(duì)于產(chǎn)品加工至關(guān)重要。毛葉木姜子嫩果所呈現(xiàn)的香氣會(huì)顯著影響消費(fèi)者對(duì)其的接受程度，提取方法的不同會(huì)導(dǎo)致不同香氣成分的呈現(xiàn)與分布。目前，香氣成分的主要萃取方法有水蒸氣蒸餾法、溶劑輔助風(fēng)味蒸發(fā)法和頂空固相微萃取法。陳漢平等[4]首次采用精密分餾結(jié)合硅膠柱層析和氣相層析從成熟毛葉木姜子果實(shí)精油中分離出21種揮發(fā)性成分；瞿萬(wàn)云等[5]采用正交實(shí)驗(yàn)法探究了超臨界CO2萃取毛葉木姜子果實(shí)揮發(fā)油的最佳提取條件；林翠梧等[6]、Huang等[7]通過(guò)水蒸氣蒸餾法從毛葉木姜子葉和枝的揮發(fā)油中分別鑒定出41種和39種揮發(fā)性成分。但是，作為我國(guó)西南地區(qū)普遍食用的開(kāi)胃涼菜——毛葉木姜子嫩果的香氣成分的研究還未見(jiàn)報(bào)道。

本文采用SDE和HS-SPME兩種方法提取毛葉木姜子嫩果中的揮發(fā)性物質(zhì)，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)香氣風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，比較兩種萃取方法所提取的毛葉木姜子嫩果香氣成分的差異和萃取特點(diǎn)，為進(jìn)一步研究毛葉木姜子特征風(fēng)味組分提供了理論依據(jù)，同時(shí)研究毛葉木姜子中風(fēng)味化合物的組成，加快毛葉木姜子相關(guān)產(chǎn)品的工業(yè)化進(jìn)程。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

毛葉木姜子嫩果于2019年5月采集于湖北恩施龍洞河(海拔550 m)，經(jīng)湖北民族大學(xué)林學(xué)園藝學(xué)院易詠梅教授鑒定為樟科毛葉木姜子。

氯化鈉、二氯甲烷：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；1-辛醇(≥98%)：美國(guó)Supelco公司、C7～C30 正構(gòu)烷烴：美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器和設(shè)備

JYZ-E16 榨汁機(jī)、高速破壁調(diào)理機(jī) 九陽(yáng)股份有限公司；同時(shí)蒸餾萃取裝置 上海方畦儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；Avanti J-30Ⅰ冷凍高速離心機(jī) 美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司；6890N/5975MSD氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)安捷倫公司；固相微萃取頭(50/30 μm DVB/CAR/PDMS) 美國(guó)Supelco公司；SHZ-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 臨海市譚氏真空設(shè)備有限公司；Concept多功能樣品前處理系統(tǒng) 德國(guó)PAS 公司；數(shù)顯磁力攪拌恒溫電熱套 天津賽得利斯實(shí)驗(yàn)分析儀器制造廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 同時(shí)蒸餾萃取

取50.0 g樣品加入200 mL蒸餾水于破壁機(jī)中破壁5 min后置于500 mL圓底磨口燒瓶中，并加入磁力攪拌子，置于裝置樣品端；另取一支干凈的250 mL圓底磨口燒瓶，加入60 mL二氯甲烷，接于裝置溶劑端。將裝置通入冷凝水(4 ℃)，加熱蒸餾萃取，樣品端控制樣品處于微沸狀態(tài)；溶劑端設(shè)定溫度為50 ℃，蒸餾萃取3 h，冷卻，取二氯甲烷萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮去二氯甲烷，得到萃取物約1.0 mL。

1.3.2 頂空固相微萃取

取100.0 g毛葉木姜子果實(shí)樣品解凍至室溫后立即榨汁過(guò)篩(200目)后取10.0 mL于萃取瓶中，加入2.0 g NaCl和磁力攪拌子，于50 ℃下平衡30 min，萃取36 min，解吸2 min。

1.3.3 GC-MS 分析

采用DB-5MS毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度 250 ℃；起始柱溫 40 ℃，保持 4 min；以 5 ℃/min 升溫至 260 ℃；以 15 ℃/min 升溫至 280 ℃，保持 1 min；載氣(He)流速 1 mL/min；HS-SPME不分流進(jìn)樣，SDE分流進(jìn)樣，分流比 50∶1。MS：離子源溫度 250 ℃；電子轟擊(EI)模式；電子能量 70 eV；質(zhì)量掃描范圍 40～550 u；掃描方式為全掃描；調(diào)諧文件為標(biāo)準(zhǔn)調(diào)諧。

1.3.4 定性定量分析

1.3.4.1 定性分析

用3種方法對(duì)毛葉木姜子嫩果香氣成分進(jìn)行定性分析，首先，根據(jù) NIST 08 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)譜圖進(jìn)行初步檢索及質(zhì)譜分析；其次，根據(jù)測(cè)定的保留指數(shù)(RI)，與文獻(xiàn)報(bào)道的保留指數(shù)進(jìn)行比對(duì)輔助定性；最后，用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)輔助定性。保留指數(shù)以 C7～C30 正構(gòu)烷烴混合物單獨(dú)進(jìn)樣，其前處理及 GC-MS 分析方法與樣品處理一致。

1.3.4.2 定量分析

對(duì)毛葉木姜子揮發(fā)性成分分離鑒定時(shí)采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量，內(nèi)標(biāo)物為1-辛醇標(biāo)準(zhǔn)品的乙醇溶液(1.570 7 g/L)。根據(jù)1-辛醇的質(zhì)量濃度和各樣品中1-辛醇峰面積的比值進(jìn)行比較。根據(jù)公式(1)計(jì)算出揮發(fā)性成分的量，每個(gè)樣品重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，取平均值。

(1)

式中：xi為組分含量，μg/L；ms為內(nèi)標(biāo)化合物質(zhì)量濃度，μg/L；Ai為化合物的峰面積；As為內(nèi)標(biāo)物峰面積；fi為待測(cè)組分(i)對(duì)內(nèi)標(biāo)物(s)的質(zhì)量校正因子，令其為1。

1.3.5 香氣活度值(OAV)的計(jì)算

根據(jù)毛葉木姜子香氣成分的含量，以及各化合物在水中的氣味閾值來(lái)計(jì)算OAV值。

(2)

式中：ρ為該化合物的質(zhì)量濃度，μg/L；OT為該化合物在水中的氣味閾值，μg/L。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛葉木姜子中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)GC-MS分析結(jié)果

采用GC-MS法檢測(cè)毛葉木姜子嫩果樣品中的揮發(fā)性風(fēng)味成分，采用HS-SPME法和SDE法提取毛葉木姜子中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的GC-MS總離子流色譜圖，見(jiàn)圖1；經(jīng)MS/RI定量，香氣成分及其含量見(jiàn)表1。

圖1 SDE及HS-SPME法提取毛葉木姜子嫩果中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的GC-MS總離子流色譜圖Fig.1 GC-MS total ion current chromatograms of volatile flavor substances extracted from ILMF by SDE and HS-SPME

由圖1可知，SDE法與HS-SPME法提取的毛葉木姜子嫩果揮發(fā)性成分有一定的差異，兩種提取方法均可提取到含量較高的α-檸檬醛、β-檸檬醛，但保留時(shí)間在10～15 min之間含量最高的化合物分別為樅油烯和桉葉醇。HS-SPME在保留時(shí)間10～20 min之間提取到的化合物數(shù)量較多且含量高，由表1可知多為單萜類化合物；而SDE法的提取物中檢測(cè)到的分子量比較大的化合物在HS-SPME提取法中未檢測(cè)到。

表1 SDE與HS-SPME法提取毛葉木姜子嫩果中的香氣化合物Table 1 Aroma compounds extracted from ILMF by SDE and HS-SPME

續(xù) 表

續(xù) 表

續(xù) 表

續(xù) 表

結(jié)合表1中數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò) GC-MS 分析，SDE法和HS-SPME法提取共檢出毛葉木姜子鍵合態(tài)揮發(fā)性成分88種，包括醇類3種，萜烯類40種，含氧萜類32種，酯類4種和其他類9種，其中SDE法檢測(cè)到50種揮發(fā)性化合物，HS-SPME法檢測(cè)到71種化合物，兩種提取方法共同檢測(cè)到的化合物有33種。

表2 SDE法與HS-SPME法提取毛葉木姜子嫩果中香氣化合物的種類和濃度占比Table 2 Types and concentration percentages of aroma compounds extracted from ILMF by SDE and HS-SPME

由表1和表2可知，經(jīng)SDE提取法提取，產(chǎn)物經(jīng)GC-MS檢測(cè)，共檢測(cè)到醇類1種、萜烯類22種、含氧萜類16種、酯類3種和其他類8種，其中含氧萜類(65.79%)和萜烯類(28.24%)含量較高。含量較高的化合物主要包括樅油烯、石竹烯、芳樟醇、β-檸檬醛、α-檸檬醛、4-羥基龍腦烷等；用HS-SPME法提取時(shí)，共檢測(cè)到醇類2種、萜烯類35種、含氧萜類28種、酯類3種和其他類3種，此種方法提取到的化合物數(shù)量較多，但濃度較高的只有含氧萜類化合物，由萜醇、萜醛、萜酯等組成，占總化合物濃度的93.72%，為毛葉木姜子嫩果提供了許多獨(dú)特的風(fēng)味。其中，含量較高的化合物有桉葉醇、橙花醇、β-檸檬醛、香葉醇、α-檸檬醛等。萜類化合物通過(guò)特定植物組織中的類異戊二烯途徑分泌，是影響水果特性的最重要的芳香化合物[8]。

SDE提取法萜烯類化合物雖然種類較少，但是含量高于HS-SPME提取法的化合物濃度，尤其是樅油烯、α-蒎烯、β-蒎烯。樅油烯多存在于野花椒等香料的精油中，α-蒎烯、β-蒎烯是天然存在的雙環(huán)單萜烯的最重要骨架。SDE法提取的溫度較高，而含氧萜類化合物在高溫下易脫水、重排形成萜烯類化合物，因此存在于大多數(shù)樟科屬植物中的桉葉醇只在提取條件較溫和的HS-SPME法提取中檢出。HS-SPME提取法對(duì)大多數(shù)含氧萜類提取效果較好，尤其是萜醇類化合物；而SDE提取法對(duì)一些高沸點(diǎn)和分子量較大的揮發(fā)性物質(zhì)提取更有優(yōu)勢(shì)，如亞油酸、亞麻酸、棕櫚酸乙酯、9,12-十八酸乙酯等，這類化合物在HS-SPME中下提取均未檢測(cè)到。

毛葉木姜子嫩果香氣成分濃度對(duì)比見(jiàn)圖2。結(jié)果顯示：SDE提取法的萜烯類和酯類化合物雖數(shù)量少但其濃度均高于HS-SPME提取法的化合物濃度；HS-SPME提取法含氧萜類數(shù)量及濃度均高于SDE提取法，主要包括萜醇、萜醛和萜酯等。采用HS-SPME法提取的醇類、萜類、酯類物質(zhì)種類較多，而SDE法對(duì)中低沸點(diǎn)物質(zhì)的提取更有優(yōu)勢(shì)，這可能是由于SDE的高溫長(zhǎng)時(shí)間處理造成部分熱敏性揮發(fā)性物質(zhì)被氧化、分解[9]。

圖2 SDE法與HS-SPME法提取毛葉木姜子嫩果香氣成分濃度對(duì)比Fig.2 Comparison of concentrations of aroma components extracted from ILMF by SDE and HS-SPME

2.2 不同提取方法香氣成分香氣活度分析

為了評(píng)估各種揮發(fā)性化合物對(duì)毛葉木姜子嫩果果實(shí)的香氣貢獻(xiàn)，用化合物濃度的平均值和水中的氣味閾值來(lái)計(jì)算OAV值。當(dāng)OAV值大于1.0時(shí)，揮發(fā)性組分才被認(rèn)為對(duì)香氣有貢獻(xiàn)。兩種萃取方法香氣描述及分類見(jiàn)表3。

表3 SDE與HS-SPME提取的揮發(fā)性成分香氣特征及香氣活度值Table 3 Aroma characteristics and odor activity values of volatile components extracted by SDE and HS-SPME

續(xù) 表

由表3可知，兩種提取方法共檢出88種游離態(tài)揮發(fā)性化合物，其中36種具有明確香氣特征，包括1種醇類，10種萜烯類、18種含氧萜類、2種酯類和5種其他類化合物。在SDE提取法下，有24種組分的OAV>1，其中對(duì)毛葉木姜子嫩果香氣貢獻(xiàn)較大的有α-蒎烯、β-水芹烯、β-蒎烯、石竹烯、芳樟醇、香茅醛、(R)-香茅醛、β-檸檬醛、香葉醇、α-檸檬醛、甲基庚酮、亞麻酸等；在HS-SPME提取法下，也有24種組分的OAV>1，其中對(duì)毛葉木姜子嫩果香氣貢獻(xiàn)較大的有α-蒎烯、α-水芹烯、對(duì)甲苯、桉葉醇、芳樟醇、香茅醛、β-檸檬醛、香葉醇、α-檸檬醛和甲基庚酮等。由此可見(jiàn)萜類化合物對(duì)毛葉木姜子香氣起到了主要貢獻(xiàn)作用。兩種提取方法下α-檸檬醛和β-檸檬醛香氣活度值最高，賦予毛葉木姜子嫩果柑橘、檸檬香氣，由于HS-SPME提取法下這兩種化合物濃度均遠(yuǎn)高于SDE法，因此其果香香氣更顯著；其次是芳樟醇，它是一種重要的水果和花卉萜醇類化合物，通常通過(guò)水解、氧化還原反應(yīng)和重排產(chǎn)生，由于其香氣閾值較低，因此對(duì)毛葉木姜子嫩果香氣貢獻(xiàn)較大，使毛葉木姜子嫩果呈現(xiàn)鈴蘭、柑橘和葡萄的香氣[11]；香葉醇賦予其花香和果香。甲基庚酮是番茄紅素、α-金合歡烯、檸檬醛或共軛三醇的氧化副產(chǎn)物或降解產(chǎn)物，呈現(xiàn)果香和青草味[12]。SDE提取法下的α-蒎烯香氣活度值較高，使毛葉木姜子嫩果呈現(xiàn)樟腦味、松樹(shù)味[13]，石竹烯主要存在于胡椒和一些香料中，呈現(xiàn)甜香和木香[14]，由于SDE提取法下的石竹烯含量較高，因此SDE法提取下的毛葉木姜子嫩果的甜香和木香特征比HS-SPME提取法下的更顯著；HS-SPME提取法在毛葉木姜子中檢測(cè)到的桉葉醇使其具有桉樹(shù)的氣味[15]；而對(duì)甲苯則使毛葉木姜子具有辛辣、霉味等令人不愉快的氣味[16]。

化合物的氣味描述取決于氣味濃度，通常也用不同的特征方向來(lái)描述氣味，見(jiàn)圖 3。

圖3 兩種提取方法下香氣特征雷達(dá)圖Fig.3 Aroma characteristic radar diagram under two extraction methods

將化合物分為甜香、花香、木香、果香、草本香和化學(xué)味，得到兩種提取方法下毛葉木姜子芳香化合物的香氣特征。由圖3可知，SDE提取法下的木香、甜香、化學(xué)味更顯著，主要來(lái)自于α-蒎烯、β-蒎烯、石竹烯的貢獻(xiàn)，化學(xué)味主要來(lái)自亞麻酸產(chǎn)生的脂肪味[17]；HS-SPME提取法下果香和花香更顯著，主要來(lái)自芳樟醇、香茅醛、α-檸檬醛、香葉醇、β-檸檬醛的貢獻(xiàn)。相比之下，HS-SPME提取的香氣化合物更貼近毛葉木姜子的原始風(fēng)味。

3 結(jié)論

采用兩種不同的樣品前處理方法對(duì)毛葉木姜子嫩果中游離態(tài)揮發(fā)性化合物進(jìn)行了提取，并結(jié)合GC-MS分析技術(shù)經(jīng)RI/MS定性共得到88種香氣成分。其中SDE法和HS-SPME法分別檢測(cè)到50種和71種化合物，兩種提取方法共同檢測(cè)到的化合物有33種，含量較高的化合物主要有α-檸檬醛、β-檸檬醛、α-蒎烯、β-蒎烯、香葉醇等。SDE法和HS-SPME法提取的香氣成分均以含氧萜類為主，分別占總濃度的65.79%和93.72%。

兩種方法所提取的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)有一定差異，共36種化合物具有明確香氣特征。SDE提取法下對(duì)香氣貢獻(xiàn)較大的化合物有α-蒎烯、β-蒎烯、石竹烯，因此其木香、甜香以及化學(xué)味較顯著；而HS-SPME提取法下的果香和花香更顯著，對(duì)香氣貢獻(xiàn)較大的化合物有芳樟醇、香茅醛、α-檸檬醛、香葉醇以及β-檸檬醛等。

SDE法提取溫度較高，對(duì)分子量較大的化合物提取效果較好，但一些重要的萜類化合物容易轉(zhuǎn)化分解，造成香氣損失，而HS-SPME法提取條件溫和，萜類物質(zhì)不易發(fā)生轉(zhuǎn)化，接近毛葉木姜子的原始風(fēng)味，因此較適用于毛葉木姜子嫩果香氣成分的分析研究。