隋怡，滕明剛，饒浠銳，楊麗，楊武德，柴慧芳

（貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025）

刺梨（Rosa roxburghii Tratt.）為薔薇科薔薇屬多年生落葉灌木繅絲花的果實，別名茨梨、文先果、送春歸[1]，味甘、酸澀，性平，歸脾、胃經(jīng)，主要產(chǎn)于貴州西部地區(qū)。刺梨含有多種活性成分，包括多糖類、有機酸類、黃酮類、三萜類化合物，因其富含超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和維生素C等抗氧化成分，素有“維C之王”的美譽[1]?，F(xiàn)代研究表明，刺梨具有健胃消食、止瀉、調(diào)節(jié)機體免疫、抗衰老、抗動脈粥樣硬化等作用[2-3]。隨著人們生活水平的提高和生活方式的改變，越來越多的人被肥胖問題困擾[4]。肥胖的并發(fā)癥包括糖尿病、動脈粥樣硬化等，危害人體健康[5]。體質(zhì)量決定于能量的攝取和消耗之間的動態(tài)平衡，當(dāng)機體攝入的能量超過機體消耗的能量，過剩的能量便以脂肪形式儲存于脂肪組織中，形成肥胖[5]。目前降脂的藥物主要有他汀類、貝特類等，但其潛在肝毒性令人擔(dān)憂[6]。因此，尋找一種天然、不良作用小的減肥降脂化合物已經(jīng)成為亟待解決的問題。

前期研究發(fā)現(xiàn)，刺梨果汁有降低小鼠體質(zhì)量的作用。在此基礎(chǔ)上，探究刺梨醇提物對食源性肥胖小鼠的影響，以期尋找到一種天然的減肥降脂化合物，為進一步研究刺梨減肥降脂活性機制奠定基礎(chǔ)，也為開發(fā)刺梨應(yīng)用價值提供參考。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

清潔級昆明種健康成年小鼠（雄性，體質(zhì)量28 g～32 g）：貴州中醫(yī)藥大學(xué)動物研究所，動物許可證號：SCXK（黔）2021-0003。動物飼養(yǎng)環(huán)境通風(fēng)良好，溫度22℃～25℃、相對濕度50%～60%，各組小鼠自由進食飲水。實驗過程遵循貴州中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗倫理，倫理批準(zhǔn)號：20210032。

1.2 主要試劑

刺梨（貴州中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室鑒定為薔薇科多年生落葉灌木繅絲花的果實刺梨）：市售；辛伐他汀片（國藥準(zhǔn)字H20084420）：山東鑫齊藥業(yè)有限公司；高脂飼料（組成：77.5%基礎(chǔ)飼料、2%膽固醇、10%蛋黃粉、10%豬油、0.5%膽酸鹽）：江蘇協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限公司；總膽固醇檢測試劑盒、甘油三酯檢測試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇檢測試劑盒：南京建成生物工程有限公司；瘦素酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；油紅O染色試劑盒：碧云天生物工程有限公司。

1.3 主要實驗儀器

高效液相色譜儀（SR-3000 Solvent Rack）：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；質(zhì)譜儀（QT 0203 G 003）：美國布魯克（中國）有限公司；倒置相差顯微鏡（DIAPHOT 300）、顯微鏡成像系統(tǒng)（DS-Ri2）：日本尼康（中國）有限公司；自動酶標(biāo)讀儀（aynorgy2）：美國百樂（中國）有限公司；離心機（VELOCITY 18R）：生命動力Dynamica（中國）有限公司；石蠟包埋機（EG1150）、切片機（RM2235）：德國徠卡（中國）有限公司。

2 實驗方法

2.1 藥物的配制

取新鮮刺梨果1 kg，將鮮果充分榨汁，棄渣，取刺梨果汁，加70%乙醇低溫（4℃）回流提取，蒸發(fā)濃縮成125 g浸膏。將此浸膏加少量雙蒸水溶解，雙蒸水定容配制成含生藥分別為0.25、0.125、0.062 5 g/mL的刺梨醇提液，每種各200 mL，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

稱取100 mg辛伐他汀片，研缽中加少量雙蒸水研磨溶解，雙蒸水定容至200 mL。配成0.5 mg/mL藥液，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 動物的分組、造模與給藥

清潔級健康成年昆明種小鼠48只，雄性，28 g～32 g。隨機分為正常組（灌胃，生理鹽水）、模型組（灌胃，生理鹽水）、刺梨醇提物高劑量組（灌胃，5 g/kg，含生藥）、刺梨醇提物中劑量組（灌胃，2.5 g/kg，含生藥）、刺梨醇提物低劑量組（灌胃，1.25 g/kg，含生藥）、辛伐他汀組（灌胃，100 mg/kg），每組8只。除正常組進食普通飼料外，其余各組每日自由進食高脂飼料建立食源性肥胖模型。各給藥組以相應(yīng)劑量按0.2 mL/10 g連續(xù)灌胃給藥30 d，每日1次。實驗期間每日稱取小鼠體質(zhì)量、飲食和飲水量并記錄。以模型組小鼠與正常組小鼠相對顯著升高為造模成功標(biāo)志。實驗結(jié)束后，取各組小鼠眼眶血液，離心（2 500 r/min，15 min）取上清液為血清，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ａ⒓刺幩栏鹘M小鼠，取肝臟，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 生化試劑盒檢測食源性肥胖小鼠血清血脂指標(biāo)測定

取各組血清，按試劑盒說明書實驗步驟檢測各組小鼠血清總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglycerides，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）的含量。

2.4 油紅O染色觀察食源性肥胖小鼠肝臟脂肪含量

取各組小鼠肝組織，置于4%多聚甲醛中固定24h。酒精梯度脫水后用石蠟包埋，切片。用油紅O染色試劑盒對各組切片進行染色，實驗步驟按試劑盒說明書進行。顯微鏡觀察各組切片肝臟脂肪染色情況并分析。

2.5 ELISA法檢測食源性肥胖小鼠血清瘦素含量

取各組小鼠血清，將樣本稀釋后，按瘦素ELISA試劑盒說明書進行ELISA瘦素（leptin，LEP）檢測。

2.6 數(shù)據(jù)處理

實驗結(jié)果均服從正態(tài)分布，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，P<0.05認為實驗數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 刺梨醇提物對食源性肥胖小鼠體質(zhì)量、飲食、飲水量的影響

為了探究刺梨醇提物對食源性肥胖小鼠體質(zhì)量的影響，對各組小鼠體質(zhì)量進行了記錄，結(jié)果見表1。

表1 刺梨醇提物對食源性肥胖小鼠體質(zhì)量的影響（n=8）Table 1 Effect of Rosa roxburghii Tratt.ethanol extracts on the body weight of food-induced obese mice（n=8）g

實驗結(jié)果顯示，自造模第20天起，模型組小鼠與正常組小鼠相比體質(zhì)量有顯著提升（P<0.05），隨后與正常組體質(zhì)量差距逐漸加大；與模型組相比，自給藥第25天起，刺梨醇提物高、中劑量組小鼠體質(zhì)量有顯著降低（P<0.05）；與模型組相比，辛伐他汀組小鼠體質(zhì)量給藥第30天呈現(xiàn)顯著降低（P<0.05）；刺梨醇提物低劑量組小鼠體質(zhì)量與同時間段模型組相比，有降低趨勢但尚無顯著性差異。

對各組小鼠的每日飲食和飲水量進行檢測，實驗結(jié)果見圖1、圖2。

圖1 刺梨醇提物對食源性肥胖小鼠每日飲食量的影響（n=8）Fig.1 Effect of Rosa roxburghii Tratt.ethanol extracts on the daily food intake of food-induced obese mice（n=8）

圖2 刺梨醇提物對食源性肥胖小鼠每日飲水量的影響（n=8）Fig.2 Effect of Rosa roxburghii Tratt.ethanol extracts on the daily water intake of food-induced obese mice（n=8）

每日各組小鼠飲水量圍繞4 mL上下浮動，無顯著變化；自給藥第20天起，模型組小鼠飲食量與正常組相比顯著升高（P<0.05）；與模型組相比，刺梨高、中、低劑量組小鼠飲食量顯著降低（P<0.05），與正常組小鼠相差不大；辛伐他汀組小鼠飲食量與模型組相比無顯著性差異。

3.2 刺梨醇提物對食源性肥胖小鼠血清血脂指標(biāo)的影響

為探究刺梨醇提物降血脂作用，測定食源性肥胖小鼠血清血脂指標(biāo)，結(jié)果見表2。

表2 刺梨醇提物對食源性肥胖小鼠血清血脂指標(biāo)水平的影響（n=8）Table 2 Effect of Rosa roxburghii Tratt.ethanol extracts on serum lipid indexes of food-induced obese mice（n=8）mmol/L

結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組小鼠血清TC、TG、LDL-C 含量均顯著升高（P<0.05），呈現(xiàn)高血脂狀態(tài)；與模型組相比，刺梨醇提物高、中劑量組和辛伐他汀組小鼠血清TC、TG、LDL-C含量均顯著降低（P<0.05）；刺梨醇提物低劑量組僅血清LDL-C與模型組相比顯著降低（P<0.05），顯示出刺梨醇提物具有顯著降血脂作用，且呈現(xiàn)劑量依賴性。

3.3 刺梨醇提物對食源性肥胖小鼠肝臟組織脂肪含量的影響

刺梨醇提物對食源性肥胖小鼠肝臟組織脂肪含量的影響，見圖3。

圖3 油紅O染色觀察刺梨醇提物對食源性肥胖小鼠肝組織脂肪含量的影響（n=8，×40）Fig.3 Effect of Rosa roxburghii Tratt.ethanol extracts on the hepatic fat content of food-induced obese mice observed by oil red O staining（n=8，×40）

由圖3可以看到，與正常組小鼠相比，模型組小鼠肝臟細胞散在大量脂滴；與模型組相比，刺梨醇提物高、中劑量組和辛伐他汀組肝細胞間散在脂滴顯著降低，刺梨醇提物低劑量組脂滴含量也有所降低。

3.4 刺梨醇提物對食源性肥胖小鼠血清瘦素含量的影響

觀察到刺梨醇提物能顯著降低食源性肥胖小鼠飲食量，進一步檢測了各組小鼠血清瘦素，結(jié)果見表3。

表3 刺梨醇提物對食源性肥胖小鼠血清瘦素的影響（n=8）Table 3 Effect of Rosa roxburghii Tratt.ethanol extracts on the serum leptin of food-induced obese mice（n=8）

實驗結(jié)果表明，與正常組相比，模型組小鼠血清瘦素含量顯著升高（P<0.05）；與模型組相比，刺梨醇提物高、中劑量組小鼠血清瘦素含量均顯著降低（P<0.05）；而刺梨醇提物低劑量組和辛伐他汀組對小鼠血清瘦素影響與模型組相比無顯著性差異。

4 討論與結(jié)論

古籍中記載刺梨具有健胃消食、止瀉等功效[5]。實驗結(jié)果顯示，用高脂飼料連續(xù)喂養(yǎng)小鼠20 d可造成小鼠食源性肥胖模型。而刺梨醇提物高、中劑量組能顯著降低食源性肥胖小鼠體質(zhì)量，作用效果呈現(xiàn)劑量依賴性，且兩組自給藥25 d起效，起效時間快于辛伐他汀（30 d）。小鼠血清血脂檢測和肝組織脂肪檢測結(jié)果顯示，食源性肥胖小鼠血清TC、TG、LDL-C含量、肝組織脂肪含量與正常組相比顯著升高（P<0.05）；與模型組相比，刺梨醇提物高、中劑量組和辛伐他汀組小鼠血清TC、TG、LDL-C含量和肝組織脂肪含量均顯著降低（P<0.05），顯示出刺梨醇提物對食源性肥胖小鼠具有顯著降血脂、降低肝組織脂肪含量的作用，作用效果呈現(xiàn)劑量依賴性，且與辛伐他汀組相當(dāng)。

大量研究表明[6-8]，瘦素為由脂肪組織分泌的，具有調(diào)節(jié)能量代謝、抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)攝食行為的循環(huán)激素。正常情況下，機體脂肪含量增加會促進瘦素的釋放而發(fā)揮厭食作用；而肥胖人群血中瘦素含量遠高于正常人群，但依舊沒有改善肥胖，瘦素的這種在肥胖人群中效價的降低現(xiàn)象稱之為“瘦素抵抗”[9]。一方面，瘦素主要通過與瘦素受體（leptin receptors，LRs）結(jié)合而發(fā)揮其生理作用[10]。瘦素受體中最重要的為表達于下丘腦的長型瘦素受體，瘦素與LEP結(jié)合后，會激活JAK-STAT信號傳導(dǎo)通路，進一步激活下丘腦弓狀核中的POMC神經(jīng)元（一種抑制食欲神經(jīng)元），而抑制下丘腦弓狀核中的NPY/AgRP神經(jīng)元（一種促食欲神經(jīng)元），從而引發(fā)厭食行為[9]。另一方面，脂肪組織分泌的瘦素同樣可以促進細胞因子信號抑制因子3（suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3）的釋放，其可以抑制JAK-STAT信號傳導(dǎo)通路，進而抑制瘦素的作用，形成“瘦素抵抗”[11]。 另有研究認為[12]，“瘦素抵抗”的原因還可能與瘦素?zé)o法正常透過血腦屏障進而發(fā)揮中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用有關(guān)。減輕“瘦素抵抗”被認為是治療肥胖及肥胖相關(guān)并發(fā)癥的有效途徑。

本研究實驗結(jié)果顯示，自給藥第20天起，與模型組小鼠相比，刺梨醇提物高、中、低劑量組小鼠飲食量顯著降低（P<0.05），且辛伐他汀組小鼠飲食量與模型組相比變化不大。顯示出兩者降低體質(zhì)量和血脂的不同機制。辛伐他汀為膽固醇合成限速酶抑制劑，具有顯著降血脂作用；而刺梨醇提物降低肥胖小鼠體質(zhì)量和血脂的作用似乎與抑制肥胖小鼠攝食量密切相關(guān)。因此考察了各組小鼠血清瘦素的含量，實驗結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組小鼠血清瘦素含量顯著升高（P<0.05），說明模型組小鼠體內(nèi)存在“瘦素抵抗”；與模型組相比，刺梨醇提物高、中劑量組小鼠血清瘦素含量均顯著降低（P<0.05），提示刺梨醇提物能夠?qū)故吃葱苑逝衷斐傻男∈笱迨菟厣叩默F(xiàn)象，降低血清瘦素，這可能與增加瘦素利用率、改善“瘦素抵抗”作用有關(guān)，具體機制有待進一步研究。

研究表明，刺梨醇提物能顯著降低食源性小鼠體質(zhì)量、飲食量、血脂水平、肝臟脂肪含量，且這一作用與降低血清瘦素水平密切相關(guān)，為進一步探究刺梨對瘦素通路的影響奠定基礎(chǔ)。