趙飛,姚忠軍,曹洪,朱必濤,張彌
(1.湖北醫(yī)藥學院附屬太和醫(yī)院 骨2科,湖北 十堰 442000;2.湖北醫(yī)藥學院附屬人民醫(yī)院創(chuàng)傷骨科,湖北 十堰 442000;3.湖北醫(yī)藥學院附屬太和醫(yī)院 皮膚科,湖北 十堰 442000)
坐骨神經(jīng)慢性卡壓損傷是臨床上較常見的周圍神經(jīng)損傷,易致組織破壞和痛覺過敏[1-2]。研究發(fā)現(xiàn),雪旺細胞是周圍神經(jīng)系統(tǒng)中特有的膠質細胞,在周圍神經(jīng)損傷后促進神經(jīng)自發(fā)再生[3-5]。神經(jīng)營養(yǎng)因子可促進神經(jīng)再生,但該因子在臨床應用上受到限制[6]。因此,迫切需要尋找新的方法保護雪旺細胞并提高其增殖、遷移等功能,促進神經(jīng)再生,對治療坐骨神經(jīng)慢性卡壓損傷等周圍神經(jīng)損傷具有重要意義。miRNA 是一類小的內(nèi)源性非編碼RNA,在周圍神經(jīng)損傷后表達失調,并影響雪旺細胞表型[7-8]。有研究顯示,miR-155 在坐骨神經(jīng)慢性卡壓損傷大鼠中高表達,抑制其表達可緩解神經(jīng)損傷引起的痛感和炎癥反應[9-10]。然而,miR-155 在雪旺細胞中的功能與機制尚不明確。生物信息學在線工具starBase 預測發(fā)現(xiàn)核因子E2 相關因子2(Nrf2)可能是miR-155 的下游靶標,Nrf2 與細胞的增殖、遷移密切相關。神經(jīng)生長因子(Ngf)、層粘連蛋白(Laminin)是介導細胞增殖和遷移的關鍵成分,但miR-155 是否靶向Nrf2 調控Ngf 和Laminin 表達,介導雪旺細胞增殖、遷移仍不清楚。故本研究以體外培養(yǎng)的雪旺細胞作為研究對象,進一步探討miR-155 對雪旺細胞增殖、遷移的調控作用與潛在機制。
大鼠雪旺細胞(RSC96,中國科學院細胞庫),DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibco 公司),RNA 提取試劑盒、實時熒光定量聚合酶鏈反應(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)試 劑盒、逆轉錄試劑盒(北京全式金生物工程技術研究有限公司),CCK-8 試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司),miR-155 mimics、miR-155 inhibitor、小干擾RNA Nrf2 [si-Nrf2、si-Nrf2(1)、si-Nrf2(2)](蘇州吉諾瑞生物科技有限公司),Lipofectamine 3000 細胞轉染試劑(美國Invitrogen 公司),蛋白酶抑制劑混合液、RIPA 細胞裂解液(湖南艾佳生物科技股份有限公司),ECL 發(fā)光試劑盒(江蘇凱基生物技術股份有限公司),兔抗Nrf2 抗體(1∶1000,武漢博士德生物工程有限公司),TransZolTMUP 試劑(北京全式金生物技術股份有限公司),PVDF 膜(美國Millipore 公司),pmirGLO 載體(上海生工生物工程股份有限公司),倒置相差顯微鏡(日本Olympus 公司)。
1.2.1 細胞培養(yǎng)與分組 將大鼠雪旺細胞RSC96置于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng),在條件為37℃、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2 天換液1 次。細胞達到80%融合,傳代培養(yǎng)。為驗證miR-155 過表達/抑制質粒轉染效果,探究miR-155 對雪旺細胞增殖、遷移的影響,將細胞分為inhibitor NC組(細胞轉染inhibitor NC 質粒)、miR-155 inhibitor 組(細胞轉染miR-155 inhibitor 質粒)、miR-NC 組(細胞轉染miR-NC 質粒)、miR-155 mimics 組(細胞轉染miR-155 mimics 質粒)。為了驗證Nrf2 沉默效果,將細胞分為si-NC 組(細胞轉染si-NC 質粒)、si-Nrf2(1)組[細胞轉染si-Nrf2(1)質粒]、si-Nrf2(2)組[細胞轉染si-Nrf2(2)質粒]。為證實靶向Nrf2 可實現(xiàn)miR-155 對細胞增殖、遷移的影響和Nrf2、Ngf、Laminin mRNA 相對表達量的調控作用,擬抑制miR-155 表達的同時選取Nrf2 沉默效果較好的質粒(si-Nrf2)轉染細胞行挽救實驗,探討miR-155 的作用是否會部分逆轉,將細胞分為miR-155 inhibitor+si-NC組(細胞轉染miR-155 inhibitor 和si-NC 質粒)、miR-155 inhibitor+si-Nrf2 組(細胞轉染miR-155 inhibitor和si-Nrf2 質粒)。探究miR-155 對細胞增殖、遷移的作用以及miR-155 靶向Nrf2,要想證實miR-155 是通過調控Nrf2 發(fā)揮其作用,需要做挽救實驗。
1.2.2 細胞轉染 取對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的雪旺細胞,按照2.5×105個/孔的密度接種于6 孔板中,培養(yǎng)24 h。細胞達到60%~80%融合后,換成無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。根據(jù)Lipofectamine 3000 轉染試劑說明書要求,取2 μL Lipofectamine 3000 加入198 μL無血清培養(yǎng)基,混勻,靜置5 min 獲得Lipofectamine 3000 稀釋液。將miR-155 mimics(50 nmoL)、miR-155 inhibitor(50 nmoL)、si-Nrf2(1)(100 nmoL)和si-Nrf2(2)(100 nmoL)及陰性對照質粒(miR-NC、inhibitor NC、si-NC)分別加入200 μL 無血清培養(yǎng)基中,混勻,獲得質粒稀釋液。然后,將上述兩種稀釋液混合,靜置15 min 后取100 μL 加入到含1 mL 無血清培養(yǎng)基的細胞中,混勻,于培養(yǎng)箱中孵育6 h,更換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 用于后續(xù)實驗。
1.2.3 CCK-8 法檢測細胞增殖 取對數(shù)生長期的細胞,以3 000 個/孔的密度接種至96 孔板中,inhibitor NC 組、miR-155 inhibitor 組、miR-NC 組、miR-155 mimics 組均轉染相應質粒,細胞培養(yǎng)24 h、48 h、72 h;inhibitor NC 組、miR-155 inhibitor 組、miR-155 inhib‐itor+si-NC 組、miR-155 inhibitor+si-Nrf2 組轉染相 應質粒,均培養(yǎng)48 h。然后每孔加入10 μL CCK-8 溶液,孵育2 h,測定450 nm 波長吸光度值。每組設置3 個復孔,實驗重復3 次,取平均值。
1.2.4 Transwell實驗檢測細胞遷移 Transwell 小室下室加入600 μL 含10%血清的培養(yǎng)基,取相應處理組細胞懸液150 μL 加入Transwell 小室中,3×104個細胞/孔,37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。然后取出Transwell 小室,棄掉每孔中的培養(yǎng)液、用無鈣的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)清洗2 遍,4%多聚甲醛固定30 min。用0.1%結晶紫染色20 min 后,使用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細胞。使用PBS 洗滌3 遍,于顯微鏡(×100)下拍照,并用Image J 軟件分析。
1.2.5 qRT-PCR 測定mRNA 表達 將按分組處理好的雪旺細胞(1×105個/孔)接種于24 孔板中,培養(yǎng)24 h。細胞轉染處理后加入預冷的PBS 潤洗2 次,吸棄PBS,每孔加入1 mL 的TransZolTMUP 試劑提取總RNA,并以RNA 作為模板使用逆轉錄試劑盒獲得cDNA,反應體系:RNA 1 μL,Oligo(dT)1 μL,Reaction Mix 10 μL,Enzyme Mix 1 μL,RNase-free Water 7 μL,42℃孵育15 min,85℃加熱5 s。然后,以此cDNA 為模板參照引物序列進行qRT-PCR 擴增,擴增體系:Green qPCR Supermix 10 μL,正向引物0.4 μL,反向引物0.4 μL,cDNA 模板1 μL,Nuclease-free Water 8.2 μL;反應體系:94℃預變性30 s,94℃變性5 s,56℃退火15 s,72℃延伸10 s,共40 個循環(huán)。采用2-ΔΔCT法計算目的基因相對表達量,將U6作為miR-155 內(nèi)參,GAPDH作為其他基因內(nèi)參?;蛞镄蛄幸姳?。
表1 引物序列
1.2.6 Western blotting測定蛋白表達 將按分組處理好的雪旺細胞(3×106個/mL)接種于6 孔板中并培養(yǎng)過夜。細胞轉染質粒后,預冷的PBS 洗滌3 次,加入RIPA 裂解液(含蛋白酶抑制劑),提取雪旺細胞總蛋白,測定每組蛋白樣品濃度。取5 μL 蛋白預染Marker 和30 μg 蛋白樣品進行SDS-PAGE 凝膠電泳,轉至PVDF 膜。轉膜后封閉1 h,剪下Marker 目的條帶和內(nèi)參條帶所在區(qū)域的膜。將膜放入相應的一抗稀釋液中4℃孵育過夜,洗膜后再結合二抗1 h。最后,使用ECL 化學發(fā)光液于多功能凝膠成像系統(tǒng)進行曝光成像,其中Actin 作為內(nèi)參。
1.2.7 雙熒光素酶報告實驗測量熒光素酶活性 分別將Nrf2 的3'-UTR 全長和Nrf2 突變體克隆到pmirGLO 載體中,獲得野生型Nrf2 和突變型Nrf2 報告載體。將細胞以1 × 105個/孔的密度接種于24孔板中,并通過lipofectamine 3000 將報告載體和miR-155 mimics、miR-155 inhibitor 或陰性對照miRNC、inhibitor NC 共轉染細胞。轉染48 h 后,收集各組細胞,通過熒光素酶報告實驗測定熒光素酶活性以評估m(xù)iR-155 與Nrf2 的關系。
數(shù)據(jù)分析采用GraphPad Prism 8 和SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差()表示,比較用單因素方差分析或重復測量設計的方差分析,兩兩比較用Tukey post hoc test 法。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。
inhibitor NC 組miR-155 相對表達量為(1.00±0.08)、miR-155 inhibitor 組為(0.29±0.04)、miR-NC組 為(1.00±0.14)、miR-155 mimics 組 為(2.63±0.18),經(jīng)單因素方差分析,差異有統(tǒng)計學意義(F=188.200,P=0.000)。miR-155 inhibitor 組較inhibitor NC 組降低,miR-155 mimics 組較miR-NC 組升高,表明轉染成功。
inhibitor NC 組、miR-155 inhibitor 組、miR-NC組、miR-155 mimics 組0 h、24 h、48 h、72 h 的吸光度值比較,經(jīng)重復測量設計的方差分析,結果顯示:①不同時間點間的細胞增殖有差異(F=554.000,P=0.000);②各組細胞增殖有差異(F=147.500,P=0.000);③細胞增殖的變化趨勢有差異(F=32.100,P=0.000)。見表2 和圖1。
表2 各組不同時間點吸光度值比較()
表2 各組不同時間點吸光度值比較()
圖1 各組不同時間點吸光度值的變化趨勢()
miR-NC 組細胞遷移數(shù)為(278±9)個/視野、miR-155 mimics 組為(523±5)個/視野、inhibitor NC組為(274±21)個/視野、miR-155 inhibitor 組為(153±14)個/視野,經(jīng)單因素方差分析,差異有統(tǒng)計學意義(F=394.300,P=0.000),miR-155 inhibitor 組 較inhibitor NC 組減少,miR-155 mimics 組較miR-NC 組增加。表明miR-155 抑制雪旺細胞遷移。見圖2。
圖2 miR-155抑制雪旺細胞遷移(×100)
各組Ngf、Laminin mRNA 相對表達量比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),miR-155 inhibitor 組較inhibitor NC 組 高,miR-155 mimics 組 較miR-NC 組低。表明miR-155 抑制Ngf、Laminin mRNA 相對表達。見表3。
表3 各組Ngf、Laminin mRNA相對表達量比較()
表3 各組Ngf、Laminin mRNA相對表達量比較()
各組Nrf2 mRNA、蛋白相對表達量比較,經(jīng)單因素方差分析,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),miR-155 inhibitor 組 較inhibitor NC 組升高,miR-155 mimics 組較miR-NC 組降低。見表4、圖3。
圖3 各組Nrf2蛋白水平比較
表4 各組Nrf2 mRNA、蛋白相對表達量比較()
表4 各組Nrf2 mRNA、蛋白相對表達量比較()
在線生物信息學工具starBase 預測發(fā)現(xiàn),miR-155 與Nrf2 存在潛在結合位點,并構建了突變序列(見圖4)。各組野生型Nrf2 細胞熒光素酶活性比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),miR-155 inhibitor組較inhibitor NC 組升高,miR-155 mimics 組較miRNC 組降低。各組突變型Nrf2 細胞的熒光素酶活性比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結果表明,miR-155 與Nrf2 存在靶向關系。見表5。
表5 各組熒光素酶相對活性比較()
表5 各組熒光素酶相對活性比較()
圖4 miR-155與Nrf2的結合位點的預測結果
沉默效果驗證實驗中si-NC 組Nrf2 mRNA 相對表達量為(1.00±0.07)、si-Nrf2(1)組為(0.46±0.07)、si-Nrf2(2)組為(0.34±0.09),經(jīng)單因素方差分析,差異有統(tǒng)計學意義(F=47.140,P=0.000),si-Nrf2(1)組和si-Nrf2(2)組較si-NC 組降低,且si-Nrf2(2)組效果更好。
挽救實驗中各組Nrf2 mRNA 相對表達量為(1.00±0.14)、miR-155 inhibitor 組為(1.97±0.12)、miR-155 inhibitor+si-NC 組為(1.89±0.10)、miR-155 inhibitor+si-Nrf2 組為(1.23±0.08),經(jīng)單因素方差分析,差異有統(tǒng)計學意義(F=55.410,P=0.000),miR-155 inhibitor 組 較 inhibitor NC 組 高,miR-155 inhibitor+si-Nrf2 組較miR-155 inhibitor+si-NC 組低。表明si-Nrf2 可部分逆轉miR-155 inhibitor 對Nrf2 表達的調控。
挽救實驗中inhibitor NC 組細胞吸光度值為(0.40±0.05)、miR-155 inhibitor 組為(0.80±0.06)、miR-155 inhibitor+si-NC 組為(0.85±0.06)、miR-155 inhibitor+si-Nrf2 組為(0.52±0.06),經(jīng)單因素方差分析,差異有統(tǒng)計學意義(F=44.370,P=0.000),miR-155 inhibitor 組 較 inhibitor NC 組 高,miR-155 inhibitor+si-Nrf2 組較miR-155 inhibitor+si-NC 組低。表明si-Nrf2 可部分逆轉miR-155 inhibitor 對雪旺細胞增殖的調控。
挽救實驗中inhibitor NC 組細胞遷移數(shù)量為(262±19)個/視野、miR-155 inhibitor 組為(493±28)個/視野、miR-155 inhibitor+si-NC 組為(487±23)個/視野、miR-155 inhibitor+si-Nrf2 組為(304±37)個/視野,經(jīng)單因素方差分析,差異有統(tǒng)計學意義(F=57.160,P=0.000),miR-155 inhibitor 組較inhibitor NC組增加,miR-155 inhibitor+si-Nrf2 組較miR-155 inhibitor+si-NC 組減少。表明si-Nrf2 可部分逆轉miR-155 inhibitor 對雪旺細胞遷移的調控。
挽救實驗中各組Ngf、Laminin mRNA 相對表達量比較,經(jīng)單因素方差分析,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),miR-155 inhibitor 組較inhibitor NC 組高,miR-155 inhibitor+si-Nrf2 組較miR-155 inhibitor+si-NC 組低。表明si-Nrf2 可部分逆轉miR-155 inhibitor對Ngf、Laminin mRNA 相對表達量的調控。見表6。
表6 挽救實驗中各組Ngf、Laminin mRNA相對表達量比較()
表6 挽救實驗中各組Ngf、Laminin mRNA相對表達量比較()
近年來,miRNAs 的研究引起了人們的關注,旨在為神經(jīng)再生提供更深入的機制研究和可靠的生物靶點。越來越多的研究發(fā)現(xiàn),miRNAs 在神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)再生過程中調節(jié)各種復雜的細胞行為和生物活性[11-12]。有證據(jù)顯示,抑制miR-155 可以減輕糖尿病周圍神經(jīng)病變的坐骨神經(jīng)損傷,突顯了作為神經(jīng)損傷治療靶點的潛力[13]。這也提示,miR-155可能參與了周圍神經(jīng)再生和修復的過程。
雪旺細胞是外周神經(jīng)系統(tǒng)中獨特的膠質細胞,其主要參與建立周圍神經(jīng)再生的有利微環(huán)境。周圍神經(jīng)損傷后,雪旺細胞發(fā)生如去分化、增殖、遷移和髓鞘形成等一系列表型的改變[14-16]。在這些表型中,增殖和遷移能力對雪旺細胞的自發(fā)再生和神經(jīng)損傷部位的修復具有重要意義[17]。雪旺細胞在周圍神經(jīng)損傷后期能沿受損軸突遷移,促進軸突長距離再生[18]。因此,增加雪旺細胞數(shù)量和提升雪旺細胞遷移能力是損傷治療的主要任務。近年來的研究表明,MiR-3099 促進雪旺細胞增殖和遷移[19];miR-148b 通過調控其靶基因的表達影響雪旺細胞的增殖與遷移能力[20]。盡管已有研究初探了miR-155 在神經(jīng)損傷中的作用,但miR-155 是否是雪旺細胞增殖和遷移的關鍵分子尚不清楚。本研究首次證實了miR-155 對雪旺細胞增殖和遷移調控作用,抑制miR-155 的表達可促進雪旺細胞增殖、遷移。
Ngf 是神經(jīng)細胞生長、維持和存活的重要蛋白質,也是神經(jīng)元存活途徑中的關鍵信號分子[21]。層黏連蛋白Laminin 是基底層的重要組成部分,支持細胞的分化、遷移、黏附、表型和存活。實驗發(fā)現(xiàn),雪旺細胞轉染miR-155 inhibitor 后Ngf 和Laminin 表達水平顯著升高,而轉染miR-155 mimics 的細胞Ngf 和Laminin 表達水平顯著降低。這些證據(jù)表明,miR-155 調控雪旺細胞增殖可能是通過影響Ngf 和Laminin 表達介導的。
已有文獻報道,在損傷的周圍神經(jīng)中Nrf2 通路失活,且過表達Nrf2 能夠促進周圍神經(jīng)損傷后雪旺細胞介導的功能修復[22-23]。也有文獻報道,Nrf2 參與調控細胞的增殖和遷移[24]。在本研究中,miR-155過表達明顯抑制Nrf2 的表達,而抑制miR-155 顯著促進Nrf2 的表達,且沉默Nrf2 能部分逆轉miR-155 inhibitor 對雪旺細胞增殖和遷移的調控作用。這些結果提示,miR-155 靶向調控Nrf2 通路的活化,影響雪旺細胞功能。
綜上所述,抑制miR-155 可能通過激活Nrf2 通路,上調Ngf、Laminin 的表達,促進雪旺細胞的增殖和遷移。本研究將有助于加深對非編碼RNA 在周圍神經(jīng)修復和再生中的生物學功能的理解,并為坐骨神經(jīng)慢性卡壓損傷等臨床診斷和治療策略提供科學依據(jù)。