楊金華，趙天增，張嶺

（南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第一附屬醫(yī)院 普胸外科，河南 南陽 473058）

食管癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，全球每年新發(fā)60.4 萬例，死亡54.4 萬例[1]。食管癌的病理類型包括鱗癌、腺癌等，其中食管鱗癌是最主要的病理類型，占所有類型的90%以上。目前根治性切除為食管癌的治愈性治療手段，但部分患者治療后仍會(huì)發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致患者死亡[2]。因此，尋找能夠預(yù)測(cè)食管癌患者根治術(shù)后預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物具有重要臨床價(jià)值。microRNA（miRNA）是單鏈非編碼RNA，能夠通過結(jié)合靶基因mRNA，調(diào)控下游基因的表達(dá)，與人類感染、炎癥及腫瘤等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3]。microRNA-27a（miR-27a）編碼基因位于19p13.12。近年來研究發(fā)現(xiàn)，miR-27a 在Wilms瘤[4]、非小細(xì)胞肺癌[5]等惡性腫瘤組織中的表達(dá)異常上調(diào)或下調(diào)，其通過影響下游癌基因，如前列腺、乳腺過表達(dá)因子1 的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤增殖、遷移及侵襲等，導(dǎo)致腫瘤惡性進(jìn)展。microRNA-203a-3p（miR-203a-3p）編碼基因位于14q32.33。近年來研究發(fā)現(xiàn)，miR-203a-3p 能夠調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子Slug 的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，參與促進(jìn)乳腺癌[6]，胰腺癌[7]等惡性腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致患者預(yù)后不良。目前食管癌患者術(shù)前血清miR-27a、miR-203a-3p 表達(dá)及與術(shù)后預(yù)后的關(guān)系報(bào)道較少?；诖?，本研究通過檢測(cè)食管癌根治性切除術(shù)患者術(shù)前血清miR-27a、miR-203a-3p 的表達(dá)，探討其對(duì)預(yù)后的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016 年3 月—2017 年3 月南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第一附屬醫(yī)院行食管癌根治術(shù)治療的123 例食管癌患者作為研究組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①接受食管癌根治術(shù)，術(shù)后經(jīng)病理組織學(xué)檢查診斷為食管鱗癌；②初次診治，既往無放化療史；③臨床資料和隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤；②合并嚴(yán)重心肺功能障礙；③合并精神障礙性疾病或妊娠哺乳期婦女。其中，男性85例，女性38例；年齡41～66歲，平均（55.39±6.27）歲；TNM 分期：Ⅰ、Ⅱ期69 例，Ⅲ期54 例；腫瘤分化程度：高中分化75 例，低分化48 例；腫瘤位置：上胸段29 例，中胸段55 例，下胸段39 例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移42 例，無淋巴結(jié)81 例。另取同期本院健康體檢人群64 例作為對(duì)照組。其中，男性50 例，女性14 例；年齡43～64 歲，平均（54.26±5.98）歲。兩組一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過，患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑

ABI7500 型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRTPCR）儀（美國(guó)ABI 公司），TRIzol 試劑盒（美國(guó)賽默飛公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（M-MLV）、qRT-PCR 試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司。

1.3 qRT-PCR 檢測(cè)血清miR-27a、miR-203a-3p的表達(dá)

留取研究組入院次日和對(duì)照組查體時(shí)空腹靜脈血約5 mL，3 000 r/min 離心10 min，取上層血清，置入-80℃冰箱冷凍保存。采用TRIzol 試劑盒提取血清總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸90 s，共計(jì)40個(gè)循環(huán)?？偡磻?yīng)體系10 μL：cDNA 1μL，正反向引物各1 μL，SYBR green Master Mix 5 μL，ddH2O 2 μL。引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)合成。miR-27a 正向引物：5'-AT GGTTCGTGGGTTCACA-3'，反向引物：5'-GTGGCTA AGTTCCGACG-3'，長(zhǎng)度分別為18 bp 和17 bp；miR-203a-3p 正向引物：5'-ATCATCCCTGCATCCACT-3'，反向引物：5'-ATCCACGACGGACACATT-3'，長(zhǎng)度均為18 bp。以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算血清miR-27a、miR-203a-3p 相對(duì)表達(dá)量。

1.4 隨訪

所有患者連續(xù)隨訪5 年，第1 年每3 個(gè)月隨訪1 次，第2 年每半年隨訪1 次，第3～5 年每年隨訪1 次。以門診或電話方式隨訪，截止日期為2022 年4 月1 日。隨訪終點(diǎn)為患者死亡或隨訪時(shí)間結(jié)束。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較用t檢驗(yàn)或方差分析；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)；Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，比較用Log rank χ2檢驗(yàn)；影響因素的分析用單因素或多因素Cox 回歸模型；P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清miR-27a、miR-203a-3p 相對(duì)表達(dá)量比較

研究組血清miR-27a、miR-203a-3p 相對(duì)表達(dá)量分別為（3.09±0.45）、（2.79±0.37），對(duì)照組分別為（0.88±0.16）、（0.78±0.24）。兩組血清miR-27a、miR-203a-3p 相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=38.017 和39.339，均P=0.000），研究組高于對(duì)照組。

2.2 不同臨床病理特征食管癌患者根治術(shù)前血清miR-27a、miR-203a-3p相對(duì)表達(dá)量比較

不同腫瘤分期、分化程度和是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移食管癌患者根治術(shù)前血清miR-27a、miR-203a-3p 相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），腫瘤分期Ⅲ期、分化程度低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移食管癌患者根治術(shù)前血清miR-27a、miR-203a-3p 相對(duì)表達(dá)量高于腫瘤分期Ⅰ、Ⅱ期、分化程度高中分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者。不同年齡、性別及腫瘤位置食管癌患者根治術(shù)前血清miR-27a、miR-203a-3p 相對(duì)表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

表1 不同臨床病理特征食管癌患者根治術(shù)前血清miR-27a、miR-203a-3p相對(duì)表達(dá)量比較

2.3 食管癌患者術(shù)前不同血清miR-27a、miR-203a-3p表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

123 例患者隨訪過程中死亡80 例，以血清miR-27a 相對(duì)表達(dá)量平均值3.09 為界，分為miR-27a 高表達(dá)組（miR-27a ≥ 3.09）和miR-27a 低表達(dá)組（miR-27a <3.09），分別有62 例和61 例。miR-27a 高表達(dá)組患者5 年總生存率為16.13%（10/62），miR-27a 低表達(dá)組為54.10%（33/61），經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=19.496，P=0.000），miR-27a 高表達(dá)組低于miR-27a 低表達(dá)組。以血清miR-203a-3p 相對(duì)表達(dá)量平均值2.79 為界，分為miR-203a-3p 高表達(dá)組（miR-203a-3p ≥ 2.79）和miR-203a-3p 低表達(dá)組（miR-203a-3p <2.79），分別有60 例和63 例。miR-203a-3p 高表達(dá)組患者5 年總生存率為18.33%（11/60），miR-203a-3p 低表達(dá)組為50.79%（32/63），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=14.241，P=0.000），miR-203a-3p高表達(dá)組低于miR-203a-3p 低表達(dá)組。見圖1。

圖1 食管癌患者術(shù)前不同血清miR-27a、miR-203a-3p表達(dá)與預(yù)后的生存曲線

2.4 影響食管癌患者預(yù)后的Cox回歸分析

以年齡（<60 歲=0，≥ 60 歲=1）、性別（女=0，男=1）、腫瘤位置（下胸段=0，上、中胸段=1）、分化程度（高、中分化=0，低分化=1）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（無=0，有=1）、腫瘤分期（Ⅰ、Ⅱ期=0，Ⅲ期=1）、miR-27a（<3.09=0，≥ 3.09=1）、miR-203a-3p（<2.79=0，≥ 2.79=1）為自變量（引入水準(zhǔn)為0.05，剔除水準(zhǔn)為0.10），以是否死亡為因變量（否=0，是=1）。進(jìn)行單因素Cox 回歸分析。結(jié)果顯示：腫瘤分期[=1.730（95% CI：1.434，2.099）]、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[=1.602（95% CI：1.191，2.153）]、miR-27a [=2.041（95% CI：1.813，2.463）]、miR-203a-3p [=2.060（95% CI：1.921，2.279）]是食管癌患者預(yù)后的影響因素（P<0.05）。見表2。

表2 影響食管癌患者預(yù)后的單因素Cox回歸分析參數(shù)

3 討論

我國(guó)每年新發(fā)食管癌約24 萬例，達(dá)全球發(fā)病例數(shù)的50%以上[8]。食管癌早期癥狀不明顯，當(dāng)出現(xiàn)吞咽困難等臨床表現(xiàn)時(shí)已處于中晚期，即使行積極根治性手術(shù)等治療后，術(shù)后復(fù)發(fā)率和病死率仍較高[9]。目前臨床上主要依據(jù)腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理學(xué)指標(biāo)評(píng)估食管癌患者的臨床預(yù)后，但由于腫瘤異質(zhì)性，不同患者預(yù)后仍然存在一定差異[10]。因此，尋找評(píng)估食管癌預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物，對(duì)患者的個(gè)體化治療，具有重要臨床意義。

miRNA 是長(zhǎng)度為20～24 個(gè)核苷酸的非編碼RNA，成熟的miRNA 被整合到RNA 誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物中，通過不完全堿基配對(duì)來識(shí)別靶基因mRNA，抑制靶基因mRNA 的翻譯，參與真核生物基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。miR-27a 是近年來發(fā)現(xiàn)的新miRNA，其通過調(diào)控機(jī)體代謝，免疫等功能，與心力衰竭[11]、糖尿病[12]等疾病關(guān)系密切。本研究中食管癌患者血清miR-27a 表達(dá)明顯升高，提示miR-27a 參與食管癌的腫瘤發(fā)生。有研究表明，長(zhǎng)鏈非編碼RNA TUG1 能夠作為分子海綿與miR-27a 相互作用，抑制miR-27a 的表達(dá)，腫瘤發(fā)生時(shí)TUG1 表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致miR-27a 表達(dá)升高，促進(jìn)下游腫瘤壞死因子-α 的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤發(fā)生[13]。此外，腫瘤發(fā)生過程中由于細(xì)胞過度增殖，處于缺氧狀態(tài)，缺氧能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)因子1α 的表達(dá)，促進(jìn)miR-27a 的表達(dá)[14]。本研究中，血清miR-27a 表達(dá)與腫瘤分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，表明miR-27a 參與促進(jìn)食管癌進(jìn)展。有研究表明，miR-27a 可以靶向并負(fù)調(diào)節(jié)膜相關(guān)鳥苷酸激酶2，上調(diào)磷脂酰肌醇2 激酶/Akt 信號(hào)通路，促進(jìn)程序性死亡配體1 的表達(dá)，促進(jìn)免疫逃避，導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展[15]。本研究中，血清miR-27a 高表達(dá)患者生存預(yù)后較差，是影響食管癌患者生存預(yù)后的獨(dú)立因素。提示血清miR-27a 可能作為新的腫瘤標(biāo)志物，有助于判斷患者的臨床預(yù)后。有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織miR-27a 表達(dá)上調(diào)能夠增強(qiáng)mTOR 信號(hào)傳導(dǎo)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞糖酵解，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞化療耐藥性形成，導(dǎo)致患者不良預(yù)后[16]。

miR-203a-3p基因位于14 號(hào)染色體，具有1 個(gè)外顯子，其可通過調(diào)控下游靶基因，如細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子1 的表達(dá)，參與細(xì)胞增殖、分化等過程的調(diào)節(jié)[17]。本研究中，食管癌患者血清miR-203a-3p 表達(dá)明顯上調(diào)，提示miR-203a-3p 參與食管癌的腫瘤發(fā)生。分析其原因可能與環(huán)狀RNA 的表達(dá)調(diào)控有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀RNA 43280 作為腫瘤抑制因子，能夠作為內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)性RNA，抑制miR-203a-3p 的表達(dá)，腫瘤發(fā)生時(shí)環(huán)狀RNA 43280 表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致miR-203a-3p 表達(dá)升高，孕激素和脂聯(lián)素分子受體3 過度激活，促進(jìn)腫瘤增殖[18]。本研究中，血清miR-203a-3p 的表達(dá)與腫瘤分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，表明miR-203a-3p 參與促進(jìn)食管癌的惡性進(jìn)展。既往研究發(fā)現(xiàn)，食管癌腫瘤細(xì)胞ECA109 中miR-203a-3p 表達(dá)顯著升高，并能夠負(fù)調(diào)控C 末端結(jié)合蛋白2 的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，上皮性標(biāo)志E-鈣黏素表達(dá)升高，間質(zhì)性標(biāo)志波形蛋白表達(dá)升高，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[19]。本研究中，血清miR-203a-3p 高表達(dá)是患者不良預(yù)后的獨(dú)立因素。既往研究表明，miR-203a-3p 表達(dá)升高通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑的耐藥性，miR-203a-3p 高表達(dá)患者靶向治療的無進(jìn)展生存期明顯縮短[20]。

綜上所述，食管癌患者根治術(shù)前血清miR-27a、miR-203a-3p 表達(dá)升高，兩者表達(dá)與腫瘤分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，是影響食管癌患者生存預(yù)后的獨(dú)立因素，將來有希望成為評(píng)估食管癌患者術(shù)后預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物。但本研究尚存在一定的不足之處，由于樣本量有限，未能對(duì)食管癌患者進(jìn)行分層分析，并且兩者食管癌中具體作用機(jī)制尚不清楚，需今后進(jìn)行深入研究。