孫 婷，王 震，黃素霞，崔明珠，楊 揚(yáng)

1)駐馬店市中心醫(yī)院麻醉科 河南駐馬店 463000 2)河南省人民醫(yī)院麻醉與圍術(shù)期醫(yī)學(xué)科 鄭州 450003

肝癌是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率與病死率逐年上升，手術(shù)、放療等是臨床治療的主要方式，但其發(fā)病隱匿、復(fù)發(fā)率高且不良反應(yīng)較多[1]。研究[2-3]表明酰胺類局部麻醉藥物對腫瘤細(xì)胞生長及轉(zhuǎn)移具有重要影響。布比卡因?qū)儆邗０奉惥植柯樽硭幬?，研究[4]表明布比卡因可抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。miR-143-3p可通過靶向調(diào)控FGF1表達(dá)而抑制肝癌細(xì)胞增殖及侵襲[5]。研究[6]表明miR-143-3p可通過靶向調(diào)控FZD4從而參與結(jié)直腸癌發(fā)生及發(fā)展過程。本研究旨在分析布比卡因是否可通過調(diào)控miR-143-3p而調(diào)控肝癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑布比卡因購自北京百奧萊博科技有限公司；人肝癌細(xì)胞Hep3B購自上海弘順生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄、熒光定量PCR試劑購自北京天根生化科技有限公司；Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；Trizol試劑購自美國Thermo Fisher公司；miR-陰性對照(NC)、miR-143-3p mimic、抗miR-NC、抗miR-143-3p購自廣州銳博生物公司；MTT試劑、Transwell小室、Matrigel基質(zhì)膠購自北京索萊寶公司；兔抗人CyclinD1、MMP-2、MMP-9抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組①Hep3B細(xì)胞接種于6孔板，加入100、200、400 μmol/L布比卡因培養(yǎng)24 h[7]，同時將正常培養(yǎng)的Hep3B細(xì)胞作為空白對照組。②將miR-NC、miR-143-3p mimic轉(zhuǎn)染Hep3B細(xì)胞，分別記為miR-NC組、miR-143-3p組。③將抗miR-NC、抗miR-143-3p轉(zhuǎn)染Hep3B細(xì)胞，加入400 μmol/L布比卡因培養(yǎng)24 h，分別記為抗miR-NC+400 μmol/L布比卡因組、抗miR-143-3p+400 μmol/L布比卡因組。各組3個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 細(xì)胞增殖能力的MTT法檢測各組Hep3B細(xì)胞接種于96孔板，加20 μL MTT溶液，培養(yǎng)4 h棄上清，加150 μL DMSO，應(yīng)用酶標(biāo)儀于490 nm處檢測吸光度(A)值。

1.4 細(xì)胞周期的檢測取各組Hep3B細(xì)胞(2×105個/mL)，10 000 r/min離心5 min，用預(yù)冷PBS洗滌，加入500 μL預(yù)冷PBS重懸細(xì)胞，加入預(yù)冷體積分?jǐn)?shù)70%乙醇，4 ℃冰箱內(nèi)孵育24 h，加入50 μL RNaseA，于37 ℃水浴30 min，加入450 μL PI染色液染色30 min，應(yīng)用Calibur流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

1.5 細(xì)胞遷移與侵襲能力的檢測遷移實(shí)驗(yàn)：各組Hep3B細(xì)胞接種于Transwell上室，下室加600 μL含血清的培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后多聚甲醛固定細(xì)胞20 min，結(jié)晶紫染色15 min，顯微鏡下統(tǒng)計(jì)各組遷移細(xì)胞數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)：Matrigel基質(zhì)膠稀釋液加入上室(50 μL/孔)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.6 miR-143-3p的 qRT-PCR檢測用Trizol試劑提取各組Hep3B細(xì)胞總RNA。反轉(zhuǎn)錄體系：5×gDNA Buffer 2 μL，10×King RT Buffer 2 μL，F(xiàn)astKing RT Enzyme Mix 1 μL，F(xiàn)Q-RT Primer Mix 2 μL，RNA 2 μg，ddH2O補(bǔ)足體系至20 μL。反應(yīng)條件：42 ℃ 15 min，95 ℃ 3 min。反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行PCR，反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 2.5 μL，MgSO42.5 μL，dNTP 2.5 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA 2 μL，ddH2O補(bǔ)足體系至25 μL；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性60 s，95 ℃變性60 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共36次循環(huán)。miR-143-3p上游引物5’-GGGCGCCGACATTCAA-3’，下游引物5’-ACTGCAGTGTCTTCTCCCTTCAA-3’； 內(nèi)參U6上游引物5’-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’，下游引物5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’。采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-143-3p相對表達(dá)量。

1.7 CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)的Western blot檢測各組Hep3B細(xì)胞加裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA測蛋白濃度，SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)膜、封閉2 h，加CyclinD1、MMP-2、MMP-9一抗(均1∶800稀釋)與內(nèi)參β-actin抗體(1∶2 000稀釋)，4 ℃孵育過夜，加二抗(1∶3 000稀釋)室溫孵育1 h，滴加ECL，暗室內(nèi)曝光顯影，用Image J軟件檢測各條帶灰度值，結(jié)果取目的蛋白條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0分析數(shù)據(jù)。miR-NC組、miR-143-3p組，抗miR-NC+400 μmol/L 布比卡因組、抗miR-143-3p+400 μmol/L 布比卡因組間各指標(biāo)的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；不同濃度布比卡因組細(xì)胞周期，增殖、遷移、侵襲能力及其相關(guān)蛋白和miR-143-3p相對表達(dá)量的比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度布比卡因組Hep3B細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞周期的比較與空白對照組比較，100 μmol/L布比卡因組、200 μmol/L布比卡因組、400 μmol/L布比卡因組細(xì)胞A值和CyclinD1蛋白表達(dá)水平逐漸降低，G1期細(xì)胞比例逐漸升高，S期細(xì)胞比例逐漸降低，見圖1、表1。

1：空白對照組；2：100 μmol/L 布比卡因組；3：200 μmol/L 布比卡因組；4：400 μmol/L 布比卡因組

2.2 不同濃度布比卡因組Hep3B細(xì)胞遷移、侵襲能力及miR-143-3p表達(dá)的比較與空白對照組比較，100 μmol/L布比卡因組、200 μmol/L布比卡因組、400 μmol/L布比卡因組Hep3B細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)及其相關(guān)蛋白表達(dá)水平逐漸降低，miR-143-3p相對表達(dá)量逐漸升高，見圖2、表2。

1：空白對照組；2：100 μmol/L 布比卡因組；3：200 μmol/L 布比卡因組；4：400 μmol/L 布比卡因組

表1 不同濃度布比卡因組Hep3B細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞周期的比較(n=3)

表2 不同濃度布比卡因組Hep3B細(xì)胞遷移、侵襲能力及miR-143-3p表達(dá)水平的比較(n=3)

2.3 miR-NC和miR-143-3p組Hep3B細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的比較與miR-NC組比較，miR-143-3p組miR-143-3p表達(dá)水平、G1期細(xì)胞比例升高，細(xì)胞A值、遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)及其相關(guān)蛋白表達(dá)水平降低，S期細(xì)胞比例降低，見圖3、表3。

2.4 抗miR-NC+400 μmol/L布比卡因組與抗miR-143-3p+400 μmol/L布比卡因組Hep3B細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的比較與抗miR-NC+400 μmol/L布比卡因組比較，抗miR-143-3p+400 μmol/L布比卡因組miR-143-3p表達(dá)水平、G1期細(xì)胞比例降低，細(xì)胞A值、遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)及其相關(guān)蛋白表達(dá)水平升高，S期細(xì)胞比例升高，見圖4、表4。

1：miR-NC組；2：miR-143-3p組

1：抗miR-NC+400 μmol/L 布比卡因組；2：抗miR-143-3p+400 μmol/L 布比卡因組

表3 miR-NC組和miR-143-3p組Hep3B細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的比較(n=3)

表4 抗miR-NC+400 μmol/L布比卡因組與抗miR-143-3p+ 400 μmol/L布比卡因組Hep3B細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的比較(n=3)

3 討論

布比卡因可促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，并可抑制裸鼠移植瘤生長[8];可抑制膀胱癌細(xì)胞增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡[9]；可通過調(diào)節(jié)circ_0000376/miR-145-5p軸而抑制胃癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移[10]。本研究結(jié)果顯示，布比卡因處理后肝癌細(xì)胞Hep3B增殖能力降低，G1期細(xì)胞比例升高，S期細(xì)胞比例降低，提示布比卡因可抑制肝癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯。CyclinD1可正向調(diào)控細(xì)胞周期從而促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程[11]。本研究結(jié)果顯示，布比卡因可降低CyclinD1蛋白表達(dá)水平，進(jìn)一步證實(shí)布比卡因能夠減弱肝癌細(xì)胞增殖能力。MMP-2、MMP-9可降解細(xì)胞外基質(zhì)而促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)移[12]。本研究結(jié)果顯示，布比卡因可降低肝癌細(xì)胞Hep3B遷移及侵襲能力，并可抑制MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)，提示布比卡因可抑制肝癌細(xì)胞遷移及侵襲。

在膽囊癌[13]、肺癌[14]組織中miR-143-3p表達(dá)下調(diào)，上調(diào)miR-143-3p表達(dá)可抑制癌細(xì)胞遷移及侵襲。本研究結(jié)果顯示，布比卡因可增高肝癌細(xì)胞miR-143-3p的表達(dá)水平，從而抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，抑制miR-143-3p表達(dá)可拮抗布比卡因?qū)Ω伟┘?xì)胞增殖、遷移、侵襲及細(xì)胞周期的影響。以上結(jié)果提示布比卡因可通過促進(jìn)miR-143-3p表達(dá)從而發(fā)揮抗肝癌作用。

綜上所述，布比卡因可抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，miR-143-3p可能作為布比卡因抗肝癌的潛在靶點(diǎn)。但關(guān)于其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。