馬 卉，畢曉東

南陽市第一人民醫(yī)院 皮膚科, 河南 南陽 473001

尋常型銀屑病是一種慢性炎性皮膚病，主要表現(xiàn)為皮膚出現(xiàn)紅斑、鱗屑，雖不會(huì)威脅患者生命，但病程較長，且反復(fù)發(fā)作，對患者身心健康及生活質(zhì)量都會(huì)產(chǎn)生一定影響[1]。目前認(rèn)為，銀屑病的發(fā)生與感染、自身免疫、遺傳等因素密切相關(guān)[2]。且有研究發(fā)現(xiàn)，多種細(xì)胞因子都參與銀屑病的發(fā)生與發(fā)展[3]。CXC趨化因子配體8(CXC chemokine ligand 8，CXCL8)是一種促炎反應(yīng)細(xì)胞因子，能夠促進(jìn)炎性反應(yīng)發(fā)生，在多種炎性反應(yīng)性疾病中發(fā)揮著重要作用[4]。miR-150是一種小分子RNA，其異常表達(dá)與細(xì)胞分化、增殖與凋亡過程密切相關(guān)[5]。多種研究表明，miR-150的異常表達(dá)可導(dǎo)致心血管疾病及癌等疾病的發(fā)生，但在尋常型銀屑病中的表達(dá)情況研究較少。因此，本研究將探討CXCL8、miR-150在銀屑病患者皮損組織及正常組織中的表達(dá)情況，并分析CXCL8、miR-150表達(dá)水平與病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例：選取2020年1月至2021年5月在南陽市第一人民醫(yī)院接受治療的80例尋常型銀屑病患者皮損組織作為研究對象，并選其皮損旁正常組織作為對照，男48例，女32例，病程0.5～13年，平均(7.1±2.4)年，年齡22～68歲，平均(38.5±7.3)歲。根據(jù)銀屑病皮損面積與嚴(yán)重程度指數(shù)(psoriasis lesion area and severity index，PASI)評分對患者病情進(jìn)行評定，輕度：PASI總分≤15分，中度：15分

1.1.2 試劑：RNA提取試劑盒(簡石生物技術(shù)有限公司)，免疫組化試劑盒和DAB顯色試劑盒(上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司)，基因組擴(kuò)增試劑盒(江西江藍(lán)純生物試劑有限公司)，CXCL8一抗(北京索來寶生物科技有限公司)，生物素標(biāo)記的二抗(北京普博斯生物科技有限公司)，引物(上海生工生物工程有限公司合成)。CXCL8以GAPDH作為內(nèi)參，CXCL8上游引物：5′-GTTGTAGCGTAGCTAGATGC-3′，下游引物：5′-TTCTCGTGTGCAGTATCTACG-3′，GAPDH上游引物：5′-GCACGCGTCACGGCTGAC AAC-3′，下游引物：5′-TGGTGCAGACGCTAGTGGA-3′；miR-150以U6作為內(nèi)參，miR-150上游引物：5′-TCTCGCAACCGTTCTACCAGTC-3′，下游引物：5′-CAGTGCCTCTCGTCGAGT-3′，U6上游引物：5′-GTG CTCGATTCGGCACGACAT-3′，下游引物：5′-GTTTA AGCAGTTGGCAAGCTA-3′。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR)檢測CXCL8 mRNA、miR-150表達(dá)水平：取出組織進(jìn)行總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄，采用羅氏LightCycler 480Ⅱ擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序設(shè)置為95℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本重復(fù)3次，取平均值，采用2-△△Ct方法定量分析CXCL8 mRNA和miR-150表達(dá)水平。

1.2.2 免疫組化法檢測CXCL8蛋白表達(dá)：組織經(jīng)10%甲醛固定、DAB染色、蘇木精復(fù)染等步驟后封片。在光學(xué)顯微鏡觀察，記錄陽性細(xì)胞，并以染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞比例進(jìn)行評分，以評估CXCL8蛋白表達(dá)。

結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)為：CXCL8蛋白陽性表達(dá)為細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒，1)根據(jù)陽性細(xì)胞著色百分比進(jìn)行評分。陽性細(xì)胞占比0～5%記0分；陽性細(xì)胞占比6%～25%記1分；陽性細(xì)胞占比26%～50%記2分；陽性細(xì)胞占比51%～75%記3分；陽性細(xì)胞占比>75%記4分。2)根據(jù)陽性細(xì)胞顯色強(qiáng)度進(jìn)行評分。0分為無著色；1分為淡黃色染色；2分為棕黃色染色；3分為棕褐色染色?？傇u分為兩項(xiàng)評分結(jié)果的乘積，總分<4分為低表達(dá)，總分≥4分為高表達(dá)。

1.2.3 Western blot檢測CXCL8蛋白表達(dá)：將組織剪成小碎片，轉(zhuǎn)到新的預(yù)冷的離心管中加入配置好的冷Lysis Buffer，放入玻璃勻漿器中，在4 ℃14 000 r/min離心15min，得到蛋白提取物，定量后進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，將分離出的蛋白樣品轉(zhuǎn)至PVDF膜上。室溫下采用5%脫脂牛奶封閉1 h，然后加入CXCL8一抗，4 ℃過夜孵育24 h，再加入相應(yīng)二抗，室溫下孵育1 h，以GAPDH作為內(nèi)參，使用DAB顯色試劑盒和ImageJ軟件分析其蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CXCL8 mRNA、miR-150在組織中的表達(dá)水平

尋常型銀屑病患者皮損組織中CXCL8 mRNA水平高于正常組織(P<0.05)，而miR-150水平低于正常組織(P<0.05)(表1)。

表1 CXCL8 mRNA、miR-150在銀屑病患者皮損組織及正常組織中的表達(dá)水平

2.2 CXCL8蛋白在尋常型銀屑病患者皮損組織中的表達(dá)

尋常型銀屑病患者皮損組織中CXCL8蛋白高表達(dá)率明顯高于正常組織(P<0.05)(表2，圖1)。

表2 CXCL8蛋白在尋常型銀屑病患者皮損組織及正常組織中的表達(dá)

A.CXCL8 protein is highly expressed in normal tissue; B.CXCL8 protein was highly expressed in skin lesions圖1 CXCL8蛋白在尋常型銀屑病患者皮損組織及正常組織中表達(dá)的免疫組化圖Fig 1 Immunohistochemical map of CXCL8 protein expression in skin lesions and normal tissues of patients with psoriasis vulgaris

2.3 Western blot檢測CXCL8蛋白在尋常型銀屑病患者皮損組織中的表達(dá)水平

CXCL8蛋白在尋常型銀屑病患者皮損組織中的表達(dá)明顯高于正常組織(P<0.05)(圖2)。

*P<0.05 compared with normal tissue group圖2 CXCL8蛋白在尋常型銀屑病患者皮損組織及正常組織中表達(dá)的Western blot圖及表達(dá)水平Fig 2 Western blot and expression level of CXCL8 protein in skin lesions and normal tissues of patients with

2.4 miR-150和CXCL8蛋白在不同病情分級銀屑病患者中的表達(dá)水平

miR-150水平隨著病情的加重逐漸降低(P<0.05)，CXCL8蛋白水平隨著病情的加重逐漸升高(P<0.05)(表3)。

表3 miR-150和CXCL8蛋白在不同病情分級銀屑病患者中的表達(dá)水平

2.5 尋常型銀屑病患者miR-150和CXCL8蛋白水平之間的相關(guān)性及二者分別與PASI評分的相關(guān)性

尋常型銀屑病患者miR-150水平與CXCL8蛋白水平及PASI評分之間均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.467、-0.475，P<0.05)，CXCL8蛋白水平與PASI評分之間呈正相關(guān)(r=0.424，P<0.05)(表4)。

表4 尋常型銀屑病患者miR-150和CXCL8蛋白水平之間的相關(guān)性及二者分別與PASI評分的相關(guān)性

3 討論

有研究發(fā)現(xiàn)，尋常型銀屑病的免疫因素主要受T淋巴細(xì)胞影響，T淋巴細(xì)胞活化后會(huì)釋放大量白細(xì)胞介素，從而加重炎性反應(yīng)，使患者皮損狀況更加嚴(yán)重[8]。另有相關(guān)研究表明，CXCL8在肺炎支原體肺炎患兒中呈高表達(dá)，并且CXCL8可趨化炎性細(xì)胞到達(dá)肺組織，加重肺損傷程度[9]。本研究中，尋常型銀屑病患者皮損組織中CXCL8 mRNA及蛋白水平均較正常組織高，且隨著患者病情的加重，CXCL8蛋白表達(dá)水平逐漸升高，提示CXCL8可能參與尋常型銀屑病的發(fā)展，檢測其表達(dá)對評估患者病情進(jìn)展有重要價(jià)值。另有結(jié)果顯示，CXCL8蛋白水平與PASI評分呈正相關(guān)，進(jìn)一步提示CXCL8可能與尋常型銀屑病的病情嚴(yán)重程度存在緊密聯(lián)系。

miR-150位于人類染色體19q13.33，是一種單鏈小分子RNA，能夠調(diào)控靶基因，參與著多種疾病的發(fā)生與發(fā)展。miR-150在結(jié)直腸癌組織中呈低表達(dá)，能夠通過調(diào)控p21、p53等因子的凋亡促進(jìn)蛋白家族的抑制性成員的表達(dá)，從而發(fā)揮其抑癌作用[10]。本研究結(jié)果顯示，尋常型銀屑病患者皮損組織中miR-150水平低于正常組織，且隨著病情的加重，miR-150水平逐漸降低，提示，miR-150水平的高低可反映病情的嚴(yán)重程度。本研究Pearson結(jié)果顯示，尋常型銀屑病患者miR-150水平與CXCL8蛋白水平及PASI評分均呈負(fù)相關(guān)，提示miR-150和CXCL8可能共同參與著尋常型銀屑病的發(fā)生與發(fā)展，有望成為預(yù)測疾病嚴(yán)重程度的有效指標(biāo)。

綜上所述，miR-150在尋常型銀屑病患者中表達(dá)降低，而CXCL8表達(dá)升高，二者與患者病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)，可為尋常型銀屑病的病情進(jìn)展、臨床診斷及治療提供一定的參考價(jià)值。