王 卉，蘇 憲，張贏贏，褚戰(zhàn)亞，孫朝暉，張金玲，張倩倩

石家莊市人民醫(yī)院 1.眼科； 2.門診部，河北 石家莊 050030

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)是常見糖尿病并發(fā)癥，導致視力損害，DR發(fā)病的重要原因為視網膜神經細胞不可逆凋亡[1]。研究顯示，氧化應激、炎性反應等多種因素參與了DR病理生理過程，血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)等炎性因子參與血管內皮細胞及周細胞炎性反應和新血管生成，MAPK/NF-κB信號通路為炎性通路，在DR發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[2]。異鼠李素(isorhamnetin,ISO)是從沙棘、銀杏等植物中提取的黃酮類物質，具有抗氧化、抗炎、保護內皮細胞的作用，研究顯示[3]，異鼠李素可通過抑制NF-κB信號通路發(fā)揮抗炎作用，減輕高糖高脂誘導的胰島β細胞損傷。本研究旨在觀察異鼠李素對DR大鼠視網膜病變的影響，從MAPK/NF-κB信號通路探究異鼠李素對DR大鼠視網膜細胞凋亡的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物：SPF級SD雄性大鼠(8～9周齡)，體質量180～220 g[中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所，動物生產許可證號：SCXK(京)2019-0011]，飼養(yǎng)條件：溫度22～25 ℃，濕度45%～55%。

1.1.2 藥物和試劑：異鼠李素(純度≥98%，脈鉑醫(yī)藥科技有限公司)；鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ,Sigma-Aldrich公司)；羥苯磺酸鈣(依比威藥品有限公司)；蘇木精伊紅(HE)染色試劑盒和TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(索萊寶生物科技公司)；TNF-α、IL-1β、IL-6和ELISA檢測試劑盒(Abcam公司)；兔抗鼠VEGF、Bax和caspase-3抗體(碧云天生物科技有限公司)；p-p38 MAPK、p38 MAPK、p-NF-κB p65、NF-κB p65抗體(Cell Signaling Technology公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及處理：大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，腹腔內注射STZ(60 mg/kg)進行造模[4]，每天1次，連續(xù)給藥3 d，對照組(control組)注射等量的檸檬酸緩沖液，給藥3 d后，尾靜脈取血檢測大鼠空腹血糖，此后每周檢測1次，連續(xù)24周空腹血糖>16.7 mmol/L則為造模成功[5]。將大鼠分為對照組(control)、模型組(model)、異鼠李素低(ISO-L)組、高劑量(ISO-H)組(每日分別口服50、150 mg/kg異鼠李素)、陽性藥物(positive drug)組(每日口服150 mg/kg羥苯磺酸鈣)，model組與control組口服等量0.9%氯化鈉溶液，每天1次，連續(xù)給藥14 d。

1.2.2 HE染色檢測視網膜組織：將包埋視網膜的石蠟切成4 μm的切片，經二甲苯和梯度乙醇常規(guī)脫蠟至水，自來水沖洗，經蘇木精初染5 min和伊紅復染4 min，顯微鏡觀察各組大鼠視網膜病理變化。

1.2.3 TUNEL染色檢測視網膜組織細胞凋亡：取各組大鼠視網膜組織石蠟切片，經二甲苯和梯度乙醇常規(guī)脫蠟至水，PBS洗滌2次，用蛋白酶K工作液處理15 min，按照TUNEL試劑盒說明進行染色，顯微鏡觀察細胞凋亡，計算細胞凋亡率。

1.2.4 ELISA法檢測血清炎性因子水平：按照試劑盒說明書，對血清進行稀釋，根據說明操作步驟檢測血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

1.2.5 Western blot法檢測視網膜組織VEGF、Bax、caspase-3、p-p38MAPK、p38MAPK、p-NF-κB p65、NF-κB p65蛋白表達：研磨視網膜組織后加入RIPA裂解液，離心提取總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，調整蛋白濃度，取20 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳并轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入VEGF、Bax、caspase-3、p-p38 MAPK、p38 MAPK、p-NF-κB p65、NF-κB p65一抗稀釋液，孵育過夜，再加入HRP標記的二抗，室溫孵育2 h，ECL化學發(fā)光顯影液顯色。以β-actin為內參，計算VEGF、Bax、caspase-3蛋白相對表達水平，以p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65比值表示p38MAPK、NF-κB p65蛋白磷酸化水平。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 異鼠李素對DR大鼠視網膜組織病理學的影響

Model組大鼠視網膜排列紊亂，分界不清，內、外核層水腫，細胞數量減少，視網膜厚度變薄；ISO-L組、ISO-H組、陽性藥物組大鼠視網膜組織各層界限較清晰，結構稍顯疏松，視網膜厚度較model組增加(圖1)。

2.2 異鼠李素對DR大鼠視網膜細胞凋亡的影響

凋亡細胞呈紅色，model組較對照組大鼠視網膜細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與model組比較，ISO-L組、ISO-H組、陽性藥物組大鼠視網膜細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，且ISO-H組大鼠視網膜細胞凋亡率顯著低于ISO-L組(P<0.05)(圖2，3)。

2.3 異鼠李素對DR大鼠血清炎性因子的影響

model組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著高于對照組(P<0.05)；與model組比較，ISO-L組、ISO-H組、陽性藥物組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著降低(P<0.05)(圖4)。

2.4 異鼠李素對DR大鼠視網膜組織VEGF、Bax、caspase-3蛋白表達的影響

與對照組比較，model組大鼠視網膜組織VEGF、Bax、caspase-3蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)；與model組比較，ISO-L組、ISO-H組、陽性藥物組大鼠視網膜組織VEGF、Bax、caspase-3蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)(圖5，6)。

圖1 異鼠李素對大鼠視網膜組織病理學的影響Fig 1 Effect of isorhamnetin on histopathological changes of rat retina

圖2 異鼠李素對DR大鼠視網膜細胞凋亡的影響Fig 2 Effect of isorhamnetin on retinal cell apoptosis in DR rats

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with model group; △P<0.05 compared with ISO-L group圖3 各組大鼠視網膜細胞凋亡率比較Fig 3 Compared of apoptosis rate of retinal cells in each group

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with model group; △P<0.05 compared with ISO-L group圖4 各組大鼠血清炎性因子水平比較Fig 4 Compared of serum inflammatory factor levels in each group

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with model group; △P<0.05 compared with ISO-L group圖5 各組大鼠視網膜組織VEGF、Bax、caspase-3蛋白表達Fig 5 Expression of VEGF, Bax and caspase-3 protein in retina of each group

2.5 異鼠李素對DR大鼠視網膜組織p38 MAPK、NF-κB p65磷酸化蛋白表達的影響

Model組DR大鼠視網膜組織p38 MAPK、NF-κB p65的磷酸化水平較control顯著升高(P<0.05)；與model組比較，ISO-L組、ISO-H組、陽性藥物組大鼠視網膜組織p38 MAPK、NF-κB p65的磷酸化水平顯著降低(P<0.05)(圖6)。

3 討論

DR是糖尿病常見微血管并發(fā)癥，主要損傷視網膜的結構和功能，造成視力損傷甚至失明[6]。研究顯示，DR發(fā)病機制復雜，主要與視網膜微血管病變、炎性反應、氧化應激等有關[7]。DR的損傷程度與VEGF密切相關，VEGF在視網膜新生血管形成中發(fā)揮重要作用[8]。本研究建立DR模型，結果表明DR大鼠中炎性反應及視網膜VEGF和細胞凋亡水平升高，與以往報道[9]類似，提示造模成功。

異鼠李素具有抗炎、抗氧化的作用，具有保護血管內皮細胞等作用。研究顯示[10]，異鼠李素可通過激活PI3K/Akt信號通路，抑制過氧化氫誘導的視網膜色素上皮(RPE)細胞活性氧產生和caspase-3活化，保護人RPE細胞免受氧化應激誘導的細胞死亡。另有研究顯示[11]，異鼠李素可顯著抑制脂多糖誘導的小膠質細胞中TNF-α、IL-1β等炎性因子的釋放，且與抑制NF-κB信號通路、阻斷TLR4通路、減少活性氧產生有關。本研究結果顯示，與model組比較，ISO-L組、ISO-H組大鼠視網膜組織各層界限較清晰，結構稍顯疏松，視網膜厚度增加，視網膜細胞凋亡率、血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平、VEGF、Bax、caspase-3蛋白表達水平顯著降低， 與口服陽性藥物羥苯磺酸鈣的作用類似，表明異鼠李素可改善DR大鼠視網膜組織損傷及細胞凋亡。

p38 MAPK信號通路與機體的氧化應激反應和炎性反應密切相關；NF-κB是p38 MAPK的下游通路分子，p38 MAPK磷酸化后可激活NF-κB通路，并激活VEGF，調節(jié)新血管生成，加重組織損傷；抑制p38 MAPK信號通路，可保護DR大鼠視網膜神經節(jié)細胞損傷[12]。研究顯示，褪黑素可以通過抑制p38/NF-κB通路上調緊密連接蛋白的表達來維持DR中血-視網膜屏障的完整性，從而減少炎性因子的產生[13]。本研究結果表明異鼠李素可能有抑制MAPK/NF-κB信號通路的作用，提示異鼠李素可能通過抑制MAPK/NF-κB信號通路而改善DR大鼠視網膜損傷及細胞凋亡。

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with model group; △P<0.05 compared with ISO-L group圖6 各組大鼠視網膜組織p-p38 MAPK、p38 MAPK、p-NF-κB p65、NF-κB p65蛋白表達Fig 6 The protein expressions of p-p38 MAPK, p38 MAPK, p-NF-κB p65 and NF-κB p65 in retina tissue of each group