張赟，李珂，補王珍

缺血缺氧性腦損傷（hypoxia-ischemia brain damage，HIBD）是新生兒殘疾和死亡的主要原因之一，可造成癲癇、智力低下、腦癱、視覺運動或感知功能障礙等［1］。因此，迫切需要探索更好的治療措施以最大程度地減少新生兒腦部損傷。小膠質(zhì)細胞在大腦缺血時會立即被激活，促進神經(jīng)炎癥的發(fā)生［2］。小膠質(zhì)細胞能夠極化為經(jīng)典（M1）和替代（M2）表型，M1型可釋放白細胞介素（IL）-1β等促炎因子并加劇腦損傷，而M2型小膠質(zhì)細胞可釋放IL-10等抗炎因子和轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）等生長因子，保護神經(jīng)［3］。因此，有效抑制小膠質(zhì)細胞的過度活化并在一定程度上促進其由M1型向M2型轉(zhuǎn)換可能對治療新生兒HIBD具有重要作用［3］。針灸可改善腦損傷，而電針是電刺激與傳統(tǒng)針灸的結(jié)合，能夠有效抑制腦損傷大鼠小膠質(zhì)細胞由M1型向M2型轉(zhuǎn)換，起到神經(jīng)保護作用［4］。核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）/血紅素加氧酶1（heme oxygenase 1，HO-1）是重要的抗氧化信號通路，激活該通路可有效改善HIBD大鼠腦損傷［5］。另外，激活Nrf2/HO-1通路還能抑制腦缺血再灌注小鼠小膠質(zhì)細胞的激活，從而降低炎癥反應(yīng)［6］。目前，鮮見有關(guān)電針對HIBD中小膠質(zhì)細胞活化以及Nrf2/HO-1通路的影響研究。本研究旨在通過探究電針調(diào)控Nrf2/HO-1通路對HIBD大鼠小膠質(zhì)細胞活化的影響，為HIBD治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料 SPF級7日齡SD大鼠40只，體質(zhì)量10~12 g，購自揚州大學(xué)，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（蘇）2017-0007，于通風(fēng)良好且室溫（24±3）℃的環(huán)境中飼養(yǎng)7 d（光照12 h/d）。針灸針（河南澤垣醫(yī)療器械銷售有限公司，貨號：HT0067）；BCA試劑盒（無錫云萃生物科技有限公司，貨號：YRX301804R）；Nrf2抑制劑全反式維甲酸（南京北魚生物科技有限公司，貨號：BYDR-C17608000）；兔抗離子鈣結(jié)合銜接分子1（ionized calcium binding adapter molecule 1，IBA1）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、β-actin、HO-1、Nrf2抗體、HRP-IgG抗體（貨號：ab5076、ab15323、ab8227、ab13243、ab62352、ab6721）購自英國Abcam公司；兔抗精氨酸酶（Arginase）抗體（貨號：93668）購自Cell Signaling Technology公司；兔抗CD68抗體（上海恒斐生物公司，貨號：bs-0649R-2）；IL-10、IL-1β試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，貨號：CSB-E04595r、CSB-E08055r）；活性氧（ROS）檢測試劑盒（翌圣生物，貨號：50101ES01）；丙二醛（MDA）試劑盒（武漢益普生物公司，貨號：YX-E20805）；凝膠成像儀（上海百賽生物技術(shù)股份有限公司）；酶標(biāo)儀（上海研卉生物科技有限公司）。

1.2 分組與HIBD模型構(gòu)建 采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)組、模型組、電針組、電針+全反式維甲酸組［7］，10只/組。除假手術(shù)組外其余組大鼠均進行HIBD模型建立：乙醚麻醉大鼠后將其固定并暴露頸部，于頸部切開0.5 cm長切口，分離皮膚并暴露左側(cè)頸總動脈及迷走神經(jīng)，剝離迷走神經(jīng)，對頸總動脈進行結(jié)扎后縫合，將大鼠放回母鼠籠中1 h后將其放入含8%氧氣+92%氮氣的密閉缺氧箱中2 h即造模結(jié)束，繼續(xù)母鼠喂養(yǎng)［8］。造模結(jié)束后，Longa評分為2～3分即為造模成功［9］。假手術(shù)組大鼠僅暴露左側(cè)頸總動脈及迷走神經(jīng)，不進行結(jié)扎及缺氧處理；造模結(jié)束次日取電針組、電針+全反式維甲酸組大鼠，用無菌針灸針在百會穴向前平刺2 mm，連接電極一端，于右耳根部連接電極另一端形成回路，接G6805電極儀（疏密波、電流1 mA、頻率1～20 Hz），右耳微顫則為針刺有效（30 min/次，1次/d）［10］；電針處理后，電針+全反式維甲酸組大鼠腹腔注射7 mg/kg全反式維甲酸，共3 d（1次/d），其余組大鼠注射等量生理鹽水。

1.3 大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分 在造模結(jié)束及實驗結(jié)束后均通過Longa評分進行神經(jīng)行為學(xué)評估：未出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損體征（0分）；對側(cè)前爪不能伸展（1分）；偏癱并于偏癱側(cè)轉(zhuǎn)圈（2分）；于行走時向偏癱一側(cè)跌倒（3分）；無法行走、意識昏迷（4分）［9］。1.4 大鼠行為學(xué)觀察

1.4.1 曠場實驗 神經(jīng)行為學(xué)評估結(jié)束后，通過Smart系統(tǒng)記錄100 cm×100 cm的觀察箱中大鼠的站立次數(shù)及5 min運動的路程，評估其自主活動能力；每換一只大鼠，均使用75%乙醇擦去殘留氣味以避免對后續(xù)實驗的干擾。

1.4.2 水迷宮實驗 將水池（直徑150 cm，水深25 cm）劃分為均等的4個象限，將黑色圓形平臺（高22 cm，直徑12 cm）放置在距第一象限池壁35 cm處，距水面約3 cm，大鼠從第三象限入水，引至平臺停留20 s，推入水中再次尋找平臺，訓(xùn)練5 d（4次/d），于第6天移去平臺，計算機攝像系統(tǒng)觀察大鼠運動軌跡并記錄從入水至平臺的時間（記為逃避潛伏期）及穿越平臺次數(shù)，評估大鼠認知功能。

1.5 TUNEL法檢測大鼠神經(jīng)細胞凋亡情況 每組隨機抽取5只大鼠，處死并取其腦組織于多聚甲醛中固定，制作4μm常規(guī)石蠟切片，一部分使用蛋白酶K孵育（8 min）后加入平衡緩沖液處理（10 min），再添加rTdT緩沖液（50μL）避光孵育1 h，DAPI染核，封片，熒光倒置顯微鏡觀察、拍照，觀察缺血部位大腦皮質(zhì)凋亡（陽性）細胞表達，Image J軟件統(tǒng)計陽性細胞數(shù)；另一部分用于免疫組化實驗。

1.6 免疫組化法檢測大鼠腦組織中Iba1表達 將1.5所得石蠟切片室溫復(fù)溫15 min后烘烤30 min，脫蠟水化后孵育山羊血清20 min，孵育Iba1一抗（1∶500）過夜，添加生物素標(biāo)記的二抗（1∶500）孵育20 min，磷酸鹽緩沖液清洗、DAB顯色、封片后Image Pro Plus 6.0觀察并計數(shù)Iba1陽性表達細胞，實驗重復(fù)5次取平均值。

1.7 試劑盒檢測大鼠腦組織中IL-10、IL-1β、ROS、MDA水平 取其余大鼠腦組織于冰上勻漿，12 500 r/min離心25 min取上清液，一部分按照試劑盒說明書，測定IL-10、IL-1β、ROS、MDA水平，實驗重復(fù)5次取平均值。另一部分行Western blot實驗。

1.8 Western blot檢測CD68、iNOS和Arginase及Nrf2/HO-1通路中相關(guān)蛋白表達 取1.7所得腦組織，BCA法檢測勻漿上清液中蛋白濃度，取蛋白樣品30μg進行SDS-PAGE后轉(zhuǎn)膜、5%牛血清白蛋白封閉1 h，加入一抗（兔抗CD68、iNOS、Arginase、β-actin、Nrf2、HO-1抗體，均1∶500）孵育過夜，TBST洗滌后山羊抗兔二抗（1∶1 000）孵育1 h，ECL顯影、蛋白凝膠成像儀觀察，Image J分析條帶灰度值，計算CD68、iNOS、Arginase、Nrf2、HO-1水平。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism 7統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料用表示，多組間比較用單因素方差分析，組間多重比較用SNK-q法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組實驗結(jié)束后神經(jīng)行為學(xué)評分比較 假手術(shù)組、模型組、電針組、電針+全反式維甲酸組的神經(jīng)行為學(xué)評分（單位：分）分別為0.00±0.00、2.16±0.22、0.69±0.12、1.64±0.25，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（n=10，F(xiàn)=297.020，P＜0.01）。

2.2 各組曠場實驗和水迷宮實驗結(jié)果比較 與假手術(shù)組比較，其他各組大鼠運動路程、站立次數(shù)及穿越平臺次數(shù)減少，逃避潛伏期增加（P＜0.05）；模型組、電針+全反式維甲酸組及電針組運動路程、站立次數(shù)及穿越平臺次數(shù)依次增加，逃避潛伏期依次減少（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of the results of open field test and the water maze test between the four groups表1 各組曠場實驗和水迷宮實驗結(jié)果比較（n=10，）

Tab.1 Comparison of the results of open field test and the water maze test between the four groups表1 各組曠場實驗和水迷宮實驗結(jié)果比較（n=10，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與假手術(shù)組比較，b與模型組比較，c與電針組比較，P＜0.05；表2~4同。

組別假手術(shù)組模型組電針組電針+全反式維甲酸組F曠場實驗運動路程（cm）2 253.30±230.41 852.17±118.80a 1 695.16±161.30ab 1 233.46±127.14abc 133.590＊＊站立次數(shù)（次）70.16±6.03 42.57±3.22a 61.07±4.04ab 48.20±3.26abc 84.406＊＊組別假手術(shù)組模型組電針組電針+全反式維甲酸組F水迷宮實驗穿越平臺次數(shù)（次）8.93±1.02 2.04±0.50a 6.25±0.71ab 4.37±0.60abc 158.019＊＊逃避潛伏期（s）14.10±1.12 27.96±2.17a 18.40±1.22ab 22.70±1.46abc 146.818＊＊

2.3 各組大腦皮質(zhì)神經(jīng)細胞凋亡、小膠質(zhì)細胞數(shù)量及小膠質(zhì)細胞形態(tài)比較 與假手術(shù)組比較，其他各組大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細胞凋亡率、Iba1陽性細胞數(shù)增加（P＜0.05）；電針組、電針+全反式維甲酸組、模型組神經(jīng)細胞凋亡率、Iba1陽性細胞數(shù)依次增加（P＜0.05），見表2、圖1。假手術(shù)組存在極少量小膠質(zhì)細胞，胞體瘦長，存在分支狀細長突起，均處于未活化狀態(tài)；模型組大鼠小膠質(zhì)細胞突起增粗、胞體增大、數(shù)量增加、處于活化狀態(tài)；與模型組比較，電針組小膠質(zhì)細胞數(shù)量減少，突起變細；與電針組比較，電針+全反式維甲酸組小膠質(zhì)細胞活化數(shù)量增加，見圖2。

2.4 各組大鼠腦組織炎性因子及ROS、MDA水平比較 與假手術(shù)組比較，其他各組大鼠腦組織中IL-10水平降低，ROS熒光強度、MDA水平增加（P＜0.05），模型組和電針+全反式維甲酸組IL-1β水平增加（P＜0.05）；電針組、電針+全反式維甲酸組、模型組IL-1β水平、ROS熒光強度、MDA水平依次增加，IL-10水平依次降低（P＜0.05），見表3。

Tab.2 Comparison of apoptosis rate of neurons and number of microglia in cerebral cortex between the four groups表2 各組大腦皮質(zhì)神經(jīng)細胞凋亡率及小膠質(zhì)細胞數(shù)量比較（n=5）

Tab.2 Comparison of apoptosis rate of neurons and number of microglia in cerebral cortex between the four groups表2 各組大腦皮質(zhì)神經(jīng)細胞凋亡率及小膠質(zhì)細胞數(shù)量比較（n=5）

組別假手術(shù)組模型組電針組電針+全反式維甲酸組F細胞凋亡率（%）7.21±1.18 39.16±2.22a 18.69±1.10ab 23.64±2.25abc 278.843＊＊Iba1陽性細胞數(shù)（個/視野）4.12±1.02 89.87±9.08a 40.64±5.36ab 68.18±6.37abc 179.359＊＊

Fig.1 The effect of electroacupuncture on neuronal apoptosis in rat cerebral cortex(TUNEL,×400)圖1 電針對大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細胞凋亡的影響（TUNEL，×400）

Fig.2 Immunohistochemical staining results of microglia(×400)圖2 小膠質(zhì)細胞免疫組化染色結(jié)果（×400）

Tab.3 Comparison of inflammatory factors,ROS and MDA levels in brain tissue of rats between the four groups表3 各組大鼠腦組織炎性因子及ROS、MDA水平比較 （n=5

Tab.3 Comparison of inflammatory factors,ROS and MDA levels in brain tissue of rats between the four groups表3 各組大鼠腦組織炎性因子及ROS、MDA水平比較 （n=5

組別假手術(shù)組模型組電針組電針+全反式維甲酸組F IL-1β（mg/g）0.015±0.004 0.050±0.007a 0.023±0.005b 0.038±0.005abc 42.261＊＊IL-10（mg/g）0.053±0.004 0.018±0.003a 0.042±0.005ab 0.030±0.004abc 69.167＊＊ROS熒光強度125.59±18.36 284.74±25.87a 180.15±15.36ab 227.15±16.50abc 60.618＊＊MDA（mmol/mg）3.98±0.28 6.67±0.32a 5.01±0.29ab 5.80±0.30abc 73.946＊＊

2.5 各組大鼠腦組織CD68、iNOS、Arginase、Nrf2、HO-1相對表達水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組和電針+全反式維甲酸組大鼠腦組織中CD68、iNOS相對表達水平增加，Arginase、Nrf2及HO-1相對表達水平降低（P＜0.05）；電針組、電針+全反式維甲酸組、模型組CD68、iNOS相對表達水平依次增加，Arginase、Nrf2及HO-1相對表達水平依次降低（P＜0.05），見圖3、表4。

Fig.3 Effects of electroacupuncture on expression levels of CD68,iNOS and Arginase in rat brain tissue圖3 電針對大鼠腦組織CD68、iNOS和Arginase表達的影響

Tab.4 Comparison of the expression levels of CD68,iNOS,Arginase,Nrf2 and HO-1 in brain tissue of rats between the four groups表4 各組大鼠腦組織CD68、iNOS、Arginase、Nrf2、HO-1表達比較 （n=5）

Tab.4 Comparison of the expression levels of CD68,iNOS,Arginase,Nrf2 and HO-1 in brain tissue of rats between the four groups表4 各組大鼠腦組織CD68、iNOS、Arginase、Nrf2、HO-1表達比較 （n=5）

組別假手術(shù)組模型組電針組電針+全反式維甲酸組F CD68 0.80±0.06 1.40±0.21a 0.95±0.09b 1.29±0.21abc 15.896＊＊iNOS 0.58±0.05 1.31±0.22a 0.74±0.11b 1.20±0.20abc 24.134＊＊組別假手術(shù)組模型組電針組電針+全反式維甲酸組F Arginase 1.25±0.21 0.48±0.07a 1.03±0.23b 0.72±0.10abc 20.530＊＊Nrf2 1.38±0.21 0.67±0.09a 1.19±0.18b 0.80±0.10abc 23.185＊＊HO-1 1.49±0.22 0.53±0.08a 1.28±0.21b 0.92±0.11abc 32.054＊＊

3 討論

電針是傳統(tǒng)針灸和電刺激的集合，是一種穩(wěn)定且快速的治療方法，已用于缺血性中風(fēng)、抑郁等疾病的治療［11］。然而，目前關(guān)于電針對HIBD中小膠質(zhì)細胞活化的影響及其可能的機制還不甚明了。研究發(fā)現(xiàn)，電針能夠通過激活沉默信號調(diào)節(jié)器1（silence information regulator-1，SIRT1）/叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O亞族1（forkhead box transcription factor O1，F(xiàn)OXO1）信號通路，有效改善腦缺血再灌注損傷鼠血腦屏障、學(xué)習(xí)及記憶障礙，抑制腦梗死［12］。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠運動路程、站立次數(shù)、穿越平臺次數(shù)降低，逃避潛伏期增加；而與模型組比較，電針組大鼠運動路程、站立次數(shù)及穿越平臺次數(shù)增加，逃避潛伏期縮短，表明電針可有效提高HIBD大鼠自主活動及認知能力，改善其認知障礙。Iba1、CD68為小膠質(zhì)細胞及其活化的標(biāo)志物，在其活化時表達顯著增加［13］。本研究結(jié)果顯示，電針能夠有效抑制HIBD大鼠小膠質(zhì)細胞過度活化，并在一定程度上促進其由M1型向M2型轉(zhuǎn)換，由此抑制炎癥反應(yīng)，改善腦損傷。

當(dāng)大腦受到損傷時，由于ROS的大量產(chǎn)生，導(dǎo)致小膠質(zhì)細胞過度活化，釋放大量氧自由基及炎癥介質(zhì)，加重氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，形成惡性循環(huán)，加重腦損傷［14］。因此，有效抑制氧化應(yīng)激可避免小膠質(zhì)細胞的過度活化，減輕腦組織損傷。本研究結(jié)果亦顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織中ROS、MDA水平增加，表明腦組織中存在氧化應(yīng)激損傷；而與模型組比較，電針組上述指標(biāo)水平降低，提示電針可抑制HIBD大鼠腦組織氧化應(yīng)激。Nrf2作為核因子，在正常狀態(tài)下，與Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1（Keap1）相結(jié)合，當(dāng)受到壓力時，會從Keap1中釋放，轉(zhuǎn)移到核內(nèi)激活HO-1表達［15］。Nrf2/HO-1作為一個抗氧化通路，在腦損傷中的保護作用已被證實。有研究發(fā)現(xiàn)，喜樹堿通過激活A(yù)KT/Nrf2/HO-1通路，抑制帕金森病模型小鼠小膠質(zhì)細胞M1極化，改善神經(jīng)炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用［16-17］。電針預(yù)處理可通過激活Keap1/Nrf2通路來改善創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙模型大鼠的焦慮行為并預(yù)防海馬神經(jīng)損傷［18］。本研究結(jié)果亦顯示，與模型組比較，電針組Nrf2及HO-1相對表達水平增加，提示電針可能通過激活HIBD大鼠腦組織中Nrf2/HO-1信號通路來抑制氧化應(yīng)激，降低炎癥反應(yīng)，從而改善腦損傷。在電針處理的基礎(chǔ)上使用Nrf2/HO-1通路抑制劑全反式維甲酸處理大鼠結(jié)果顯示，全反式維甲酸能夠逆轉(zhuǎn)電針對HIBD大鼠小膠質(zhì)細胞活化的抑制作用，加重腦部炎癥損傷及氧化應(yīng)激反應(yīng)，表明電針可能通過促進Nrf2/HO-1通路激活來抑制HIBD大鼠小膠質(zhì)細胞過度活化，并促進小膠質(zhì)細胞由M1型向M2型轉(zhuǎn)換，從而改善腦組織炎癥損傷。

綜上所述，電針可能通過激活Nrf2/HO-1通路抑制HIBD大鼠小膠質(zhì)細胞過度活化，并促進其由M1型向M2型轉(zhuǎn)換，以此抑制炎癥反應(yīng)，改善腦組織炎癥損傷。