王冬梅，袁寶軍，高利常，袁偉

結締組織病（connective tissue disease，CTD）是以結締組織和血管慢性炎癥為病理基礎的一組自身免疫性疾病，其并發(fā)癥較多，當CTD患者肺部受累時常表現(xiàn)為間質(zhì)性肺疾?。╥nterstitial lung disease，ILD）［1］。結締組織病相關間質(zhì)性肺疾?。–TD-ILD）起病隱匿，主要依據(jù)臨床表現(xiàn)及肺部高分辨CT（HRCT）診斷，患者就診時多屬中晚期，已錯過了最佳的治療時機，病死率高。因此，尋找早期特異性血清標志物對于早發(fā)現(xiàn)、早診斷和治療CTD-ILD具有重要的臨床意義。甲殼質(zhì)酶蛋白40（chitinase protein 40，YKL-40）是一種分泌型糖蛋白，具有參與炎癥、細胞增殖和組織重塑的多效生物活性，已被證實可用于評估多種自身免疫疾病的活動性與嚴重程度［2-3］。而趨化因子配體18（chemokine ligand 18，CCL18）為CC族趨化因子，在機體免疫應答和炎癥反應中發(fā)揮重要作用［4］。近幾年國內(nèi)外研究報道，YKL-40可能參與肺纖維化過程［5-6］，特發(fā)性肺纖維化患者血清中CCL18水平與肺纖維化程度相關［7］。本研究通過分析CTD-ILD患者血清中YKL-40和CCL18水平變化情況，探討其在CTD-ILD患者診斷及病情嚴重程度評估中的應用價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象 以2018年3月—2019年8月開灤總醫(yī)院住院確診的105例CTD患者為研究對象，其中男21例，女84例，年齡20~79歲，平均（55.21±1.67）歲，病程2個月~21年。其中系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）29例，類風濕性關節(jié)炎（RA）24例，混合性結締組織疾?。∕CTD）20例，系統(tǒng)性硬皮癥（SSc）10例，原發(fā)性干燥綜合征（SS）12例，系統(tǒng)性血管炎（SV）6例，多發(fā)性肌炎/皮肌炎（PM/DM）4例。納入標準：（1）所有患者入院3 d內(nèi)進行肺部HRCT檢查。（2）SLE符合2009年系統(tǒng)性狼瘡國際協(xié)作組（SLICC）修訂的由美國風濕病學會（ACR）提出的診斷標準；RA符合2010年ACR/歐洲抗風濕病聯(lián)盟（EULAR）制定的診斷標準；MCTD符合1987年Gordon Sharp診斷標準；SSc符合2013年ACR/EULAR制定的診斷標準；SS符合2002年原發(fā)性干燥綜合征國際（分類）診斷標準；SV符合1994年Chapel Hill分類診斷標準；PM/DM符合1975年Bohan/Peter提出的診斷標準。（3）符合CTD-ILD診斷標準。確診為CTD，同時符合以下2項或2項以上指征，即出現(xiàn)咳嗽、氣短、胸痛、呼吸困難等典型的呼吸道癥狀，肺功能檢測通氣障礙或彌散性功能不全，HRCT檢查出現(xiàn)1項以上間質(zhì)性肺炎的影像學改變，肺部活檢表現(xiàn)為間質(zhì)性病變，無感染依據(jù)且抗感染治療5~7 d后無效。排除標準：（1）放射性肺炎、過敏性肺炎、藥物性肺炎、特發(fā)性肺纖維化、硅沉著病、石棉沉著病導致的間質(zhì)性肺疾病。（2）合并冠狀動脈血管性疾病以及腎臟透析的患者。（3）存在腦血管、消化、內(nèi)分泌及造血系統(tǒng)等原發(fā)疾病的患者。

根據(jù)患者臨床癥狀及肺部HRCT檢查結果，37例患者出現(xiàn)ILD（CTD-ILD組），其中男8例，女29例，年齡32~75歲，平均（56.51±10.93）歲，病程8個月~20年。另68例未合并ILD的CTD患者（CTD組），同時選擇年齡、性別匹配的35例健康體檢者作為對照組。3組受試對象一般臨床資料比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性，見表1、2。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準（倫理號：2020040），患者均簽署知情同意書。

Tab.1 Analysis of general information in the studied people表1 研究對象的一般資料分析

Tab.2 Comparison of primary disease classification between the CTD-ILD group and the CTD group表2 CTD-ILD組與CTD組原發(fā)病分類比較［例（%）］

1.2 方法

1.2.1 資料收集 詳細記錄研究對象的性別、年齡、病程、是否吸煙、是否使用激素、免疫抑制劑使用情況等臨床資料，并記錄白細胞計數(shù)（WBC）、血紅蛋白（Hb）、血小板（PLT）、血沉（ESR）、C反應蛋白（CRP）、免疫球蛋白（Ig）A、IgG、IgM、補體C3、癌胚抗原（CEA）等實驗室檢查結果及肺部HRCT影像學表現(xiàn)。

1.2.2 血清YKL-40和CCL18檢測 所有研究對象均清晨空腹采集靜脈血3 mL，室溫靜置1 h后，3 000 r/min（離心半徑17.5 cm）低溫離心10 min，提取血清放入EP管中后，置-20℃冰箱保存，待統(tǒng)一測定。檢測試劑盒購自美國R&D公司，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）進行檢測。所有試劑使用前均平衡至室溫，測定嚴格按各操作說明書執(zhí)行。所用儀器為瑞士Tecan公司生產(chǎn)的sunrise型號酶標儀，測定結果依據(jù)標準品的濃度及對應的光密度（OD）值繪制標準曲線，得到直線回歸方程，再依據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計算出對應的樣品濃度。

1.2.3 肺部HRCT評分 采用美國GE公司Revolution 256排螺旋CT設備對CTD-ILD患者進行肺部掃描。按Müller評分法［8］進行肺部HRCT評分：選擇主動脈弓、氣管分叉和膈頂上方1 cm共3個層面，按照磨玻璃影改變、網(wǎng)格影改變和蜂窩影的改變程度記分；無改變，0分；病變范圍≤5%，1分；病變范圍6%~24%，2分；病變范圍25%~49%，3分；病變范圍50%~75%，4分；病變范圍＞75%，5分；將3種改變評分累加后計算總分。由放射科2位副主任及以上級別的醫(yī)師進行HRCT評分并取其平均值。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 26.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，2組均數(shù)比較采用t檢驗，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗；偏態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)［M（P25，P75）］表示，2組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗，組間多重比較通過Bonferroni法校正檢驗水準；計數(shù)資料比較采用χ2檢驗；各指標的診斷性能采用受試者工作特征（ROC）曲線分析，危險因素分析采用多因素Logistic回歸，相關性采用Spearman等級相關分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 3組研究對象血清中YKL-40和CCL18水平比較 CTD-ILD組血清中YKL-40和CCL18水平明顯高于CTD組和對照組，CTD組血清中YKL-40水平明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），而CTD組血清中CCL18水平與對照組差異無統(tǒng)計學意義，見表3。

2.2 CTD-ILD組和CTD組實驗室指標比較 CTDILD組血清CEA水平明顯高于CTD組（P＜0.01），其他實驗室指標比較差異均無統(tǒng)計學意義，見表4。

2.3 CTD患者發(fā)生ILD的危險因素分析 以ILD是否發(fā)生作為因變量（發(fā)生ILD=1，未發(fā)生ILD=0），將YKL-40、CCL18、CEA作為自變量，多因素Logistic回歸分析顯示，YKL-40和CCL18升高是CTD患者發(fā)生ILD的獨立危險因素（P＜0.05），見表5。

Tab.3 Comparison of serum YKL-40 and CCL18 levels between the three groups表3 3組研究對象血清中YKL-40和CCL18水平比較［ng/L，M（P25，P75）］

Tab.4 Comparison of clinical laboratory indicators between the CTD-ILD group and the CTD group表4 CTD-ILD組與CTD組實驗室指標比較

Tab.5 Multivariate Logistic regression analysis of ILD in CTD patients表5 CTD患者發(fā)生ILD的多因素Logistic回歸分析

2.4 血清YKL-40、CCL18水平對CTD-ILD的診斷價值 ROC曲線分析結果顯示，血清YKL-40水平對CTD-ILD有診斷價值（P＜0.05），最佳截斷值為4 484.6 ng/L；血清CCL18水平對CTD-ILD診斷價值有限（P＞0.05）；YKL-40聯(lián)合CCL18對CTD-ILD有診斷價值（P＜0.05），且聯(lián)合診斷的敏感度高于YKL-40與CCL18單獨診斷，見圖1、表6。

Fig.1 ROC curve of serum YKL-40 and CCL18 levels in the diagnosis of CTD-ILD圖1 血清YKL-40和CCL18對CTD-ILD診斷價值的ROC曲線

Tab.6 ROC curve analysis results of serum YKL-40 and CCL18 levels in the diagnosis of CTD-ILD表6血清YKL-40和CCL18水平對CTD-ILD診斷價值的ROC曲線分析結果

2.5 血清YKL-40、CCL18水平與肺部影像學改變的相關分析 CTD-ILD患者的肺部HRCT評分平均為（2.68±0.37）分。CTD-ILD患者血清中YKL-40、CCL18水平與肺部HRCT評分均呈正相關（rs分別為0.697、0.472，均P＜0.05）。

3 討論

ILD是一組以肺泡炎癥和間質(zhì)纖維化為基本病變的彌漫性肺疾病，其病因多樣，包括環(huán)境因素、職業(yè)、藥物、免疫反應等。其中CTD是通過自身免疫反應引起ILD的主要病因之一［9］。有學者認為，由于CTD患者免疫系統(tǒng)紊亂導致巨噬細胞和淋巴細胞活化，從而釋放多種細胞因子，造成肺泡上皮細胞和毛細血管內(nèi)皮細胞間基底膜的損傷、異常纖維母細胞增生、炎癥及細胞外基質(zhì)成分的沉積等［10］。目前臨床上對CTD-ILD的診斷主要依靠其臨床特征、肺部HRCT及組織病理學檢查，但這不利于疾病的早期診斷，且費用較高。因此，尋找相對特異和敏感的生物標志物是早期診斷、優(yōu)化治療及改善CTD-ILD患者預后的關鍵。

YKL-40是由活化的巨噬細胞和中性粒細胞等多種細胞分泌的炎性糖蛋白，具有調(diào)節(jié)炎癥的作用，屬于幾丁質(zhì)酶成員，分子質(zhì)量為40 ku，因其N端起始氨基酸為酪氨酸（Y）、賴氨酸（K）和亮氨酸（L），故被稱為YKL-40，可作為急慢性炎癥相關標志物，在氣管重塑和組織纖維化中發(fā)揮重要作用［11］。近年來，YKL-40被認為是診斷ILD和判斷預后的生物標志物，尤其是特發(fā)性肺纖維化和結節(jié)?。?2-13］。有研究發(fā)現(xiàn)，PM/DM-ILD患者血清YKL-40水平顯著高于健康對照，表現(xiàn)為YKL-40在PM/DM-ILD患者聚集的肺泡內(nèi)巨噬細胞和過度增殖的肺泡上皮細胞中表達增強，血清高水平YKL-40是患者不良預后的獨立危險因素［14］。SSc合并ILD患者血清中YKL-40水平也較正常對照組升高［15］。本研究結果顯示，CTD-ILD組血清中YKL-40水平明顯高于CTD組和對照組，提示YKL-40作為結締組織的細胞生長因子與多種自身免疫性疾病的活動性或嚴重程度有關，且其作為機體炎癥反應因子可能參與CTD-ILD患者的肺部炎癥、組織重塑或纖維化過程，與相關研究報道基本一致［16-17］。

CCL18又稱肺活化調(diào)節(jié)趨化因子，屬CC族趨化因子，主要由肺組織中的樹突狀細胞和巨噬細胞表達，由Th2型細胞因子如白細胞介素（IL）-4、IL-10和IL-13等激活，在炎癥刺激時表達明顯升高。CCL18可誘導肺成纖維細胞膠原合成，進而導致肺纖維化和肺功能的下降［18］。Kodera等［19］比較了SSc-ILD患者中血清CCL18水平，發(fā)現(xiàn)SSc-ILD患者血清CCL18水平升高，且與一氧化碳彌散量（DLCO）和用力肺活量（FVC）呈負相關。Hoffmann-Vold等［20］通過一項前瞻性研究發(fā)現(xiàn)，SSc-ILD患者的血清中CCL18血清水平越高，肺纖維化進展越重，可以作為預測SSc-ILD疾病進展的生物標志物。本研究結果顯示，CTD-ILD組血清中CCL18水平明顯高于CTD組和對照組，提示CTD-ILD組患者中肺泡巨噬細胞激活，CCL18產(chǎn)生增加，血清中CCL18明顯升高，可能與患者的肺纖維化重塑有關，與Cai等［21］的研究報道基本一致。此外，本研究結果還顯示，與對照組比較，CTD組患者血清中YKL-40水平明顯增高，而CCL18水平有增高趨勢但不顯著，推測YKL-40和CCL18可能對CTD患者發(fā)生ILD的早期篩查有一定意義。

本研究通過多因素Logistic回歸分析顯示，血清YKL-40和CCL18升高是CTD患者發(fā)生ILD的獨立危險因素；ROC曲線分析結果顯示，血清YKL-40水平對CTD-ILD有診斷價值，而CCL18血清水平對CTD-ILD診斷價值有限，YKL-40聯(lián)合CCL18診斷CTD-ILD的價值高于YKL-40和CCL18單獨診斷。因此，血清YKL-40有望成為診斷CTD-ILD的血清標志物，且YKL-40和CCL18聯(lián)合檢測更有助于CTD-ILD患者的早期診斷。賀新偉等［22］研究發(fā)現(xiàn)，CTD-ILD患者肺泡灌洗液中CCL18水平升高，可能與肺部病變嚴重程度及住院期間預后相關，CCL18是潛在的CTD-ILD疾病嚴重性及預后的標志物。本研究顯示，CTD-ILD患者血清YKL-40、CCL18水平與肺部HRCT評分均呈正相關，提示CTD-ILD患者血清中YKL-40和CCL18水平可能隨著肺部組織病變加重而增加，檢測血清YKL-40和CCL18水平有助于患者的病情評估。

綜上所述，CTD-ILD患者血清中YKL-40和CCL18水平顯著升高，兩者均是CTD患者發(fā)生ILD的獨立危險因素，可作為簡單易行且可重復檢測的血清標志物；兩者聯(lián)合檢測有助于CTD-ILD早期診斷及病情評估。由于本次研究對象均為住院患者，以CTD急性加重與CTD-ILD加重原因入院，YKL-40和CCL18在疾病穩(wěn)定期是否也存在相同變化，還需要今后繼續(xù)探究。