楊國紅，余芳芳，蔡偉，牛秀瓏，張芯，趙季紅，李玉明，陳少伯△

隨著人們生活水平的提高及生活方式的變化，高血壓的患病率持續(xù)增高。2012—2015年中國高血壓調查發(fā)現(xiàn)，我國成人高血壓患病人數(shù)為2.45億，患病率高達27.9%，由此造成的心血管疾病的負擔也與日俱增［1］。防治高血壓及相關的靶器官損傷，進而控制心血管疾病的發(fā)展，已刻不容緩。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）在質量分數(shù)為8%的NaCl飲食下干預12周可引起收縮壓的顯著增高和心肌淋巴管的增生，而通過過表達血管內皮生長因子（VEGF）-C促使淋巴管過度增生，可使收縮壓及左心室重塑得到改善［2-3］。另有報道，外周血中有一部分組成性表達血管內皮生長因子受體（VEGFR）-3的幼稚單核細胞，在特定的條件下可進入外周組織分化為淋巴管內皮細胞，促進淋巴管的生成［4-6］?？煞裢ㄟ^調節(jié)VEGFR-3+單核細胞來改善高血壓及左心室重塑，目前尚少見相關報道。本研究利用流式細胞儀分選VEGFR-3+單核細胞，對高血壓小鼠進行干預，觀察VEGFR-3+單核細胞對高鹽誘導的高血壓及左心室重塑的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級6周齡雄性C57BL/6小鼠100只［動物生產許可證號：SCXK（京）2014-0013］及不同質量分數(shù)NaCl飼料均購自天津市奧臣實驗動物銷售有限公司；山羊抗小鼠VEGFR-3-Flt-4抗體購自R&D Systems公司；大鼠抗小鼠Ly6G-PerCP/Cy5.5、大鼠抗小鼠CD11b-PE抗體、大鼠抗小鼠F4/80-PE-Cy5抗體均購自Biolegend公司；TRIzol購自TAKARA公司；Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit、SYBR Green實時定量PCR試劑購自Roche公司，所用引物購自北京六合華大基因科技有限公司；N-硝基-L-精氨酸甲酯（Nω-Nitro-L-arginine Methyl Ester，L-NAME）、麥胚凝集素（wheat germ agglutinin，WGA）均購自Sigma公司；4’，6-diamidino-2-phenylindole，dihydrochloride（DAPI）購自Roche公司；Masson染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；小鼠尾壓CODATM監(jiān)測系統(tǒng)購自美國Kent Scientific公司；熒光定量PCR（qPCR）儀（ABI 7300）購自美國Applied Biosystems公司；FC 500流式細胞儀購自美國Beckman Coulter公司；FACSAria流式細胞分選系統(tǒng)購自美國BD公司；Vevo 2100超聲影像系統(tǒng)購自加拿大Visual Sonic公司；E600POL偏振光顯微鏡和ECLIPSE 80i熒光顯微鏡均購自日本Nikon公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組與喂養(yǎng)方法 C57BL/6小鼠經適應性喂養(yǎng)1周后，以隨機數(shù)字表法分為正常鹽（0.5%NaCl）飲食組（NS組，n=10）、高鹽（8%NaCl）飲食組（HS組，n=10），HS+LNAME組（HS+L組，n=50）及HS+L-NAME+外周血VEGFR-3+單核細胞（PBVM）干預組（HS+L+PBVM組，n=30）。所有實驗小鼠均飼養(yǎng)于清潔級實驗室，飼養(yǎng)條件：室溫20~24℃，相對濕度55%~65%，氨濃度＜20 mg/L，自由飲水，給光7：00—19：00。分別在干預前、8周、12周利用小鼠尾壓監(jiān)測系統(tǒng)動態(tài)測量小鼠收縮壓。

1.2.2 PBVM的制備與干預 在高鹽飲食干預9~12周時利用FACSAria流式細胞分選系統(tǒng)采集HS+L組小鼠PBVM，具體方法如下：經下頜下靜脈采集C57BL/6小鼠外周血1 mL加入EDTA抗凝的EP管中混勻。依次加入抗小鼠Ly6GPerCP-Cy5.5、CD11b-PE及VEGFR-3-Flt-4抗體與抗凝血混勻并避光孵育15 min，之后加入10 mL紅細胞裂解液避光孵育10 min，350×g離心5 min棄上清液后加入1 mL細胞染色緩沖液重懸細胞，再次以350×g離心5 min，隨后以1.5 mL細胞染色緩沖液重懸細胞，上機分選。分選所得PBVM經尾靜脈注射對HS+L+PBVM組小鼠進行干預，從高鹽飲食干預第9周開始，每周干預1次，每次5×105個PBVM，共4次。

1.2.3 小鼠心肌組織PBVM的鑒定 于PBVM注射后第1周的第1、2、3、5、7天分別處死部分HS+L+PBVM及HS+L組小鼠（每組每次4只）取心肌組織制備單個核細胞懸液，利用流式細胞術對單個核細胞懸液中VEGFR-3+巨噬細胞進行鑒定。小鼠心肌剪碎后，冷PBS清洗3次，將含組織塊的PBS懸液置于Medmachine（Dako，Denmark）中制備單個核細胞。隨后用300目濾器過濾，250×g離心5 min，沉淀物以PBS重懸。制備的單個核細胞中依次加入抗小鼠F4/80-PE-Cy5及VEGFR-3-Flt-4抗體，混勻并避光孵育15 min，棄上清后加入500μL細胞染色緩沖液重懸細胞，上機檢測，設門方法見圖1。應用Flow Jo 7.6.1軟件對流式數(shù)據(jù)進行分析［7］。

1.2.4 qPCR 12周高鹽飲食干預結束后處死各組小鼠，取左心室心肌組織，以TRIzol法提取細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA后，以qPCR檢測心肌組織張力應答增強子結合蛋白（TonEBP）以及淋巴管內皮細胞標志物同源盒轉錄因子（Prox）-1、淋巴管透明質酸受體（LYVE）-1、足蛋白（Podoplanin）、VEGF-C mRNA表達水平。PCR反應體系20μL：cDNA模板1μL，上、下游引物各0.5μL，2×SYBR Green Master 10μL，MilliQ超純水8μL。PCR反應條件：50℃2 min；95℃10 min；95℃15 s，60℃1 min，30個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達水平：ΔΔCt=實驗組（Ct目的基因-Ct內參基因）-對照組（Ct目的基因-Ct內參基因）。所用引物序列見表1。

Fig.1 The gating method for flow cytometry analysis of F4/80+/VEGFR-3+macrophages圖1 F4/80+/VEGFR-3+巨噬細胞流式細胞術分析的設門方法

Tab.1 The primer sequence of qPCR表1 qPCR引物序列

1.2.5 小鼠心臟超聲參數(shù)測定 在高鹽干預12周末進行小鼠心臟超聲參數(shù)的測定。在麻醉狀態(tài)（2.5%異氟烷）下進行超聲數(shù)據(jù)的采集，測定的參數(shù)包括：左心室舒張末期內徑（LVEDD）、左心室收縮末期內徑（LVESD）、左心室舒張末期容積（LVEDV）、左心室收縮末期容積（LVESV）和左心室后壁厚度（LVPWT），計算左心室縮短分數(shù)（LVFS）和左心室射血分 數(shù)（LVEF），LVFS=（LVEDD-LVESD）/LVEDD，LVEF=（LVEDV-LVESV）/LVEDV［7］。

1.2.6 小鼠心肌組織病理學分析 取小鼠左心室橫截面心肌組織，經石蠟包埋后，制備5μm厚的切片進行病理染色分析。Masson染色后的切片在顯微鏡下獲取圖像，利用Image Pro Plus 5.0軟件計算膠原容積分數(shù)（CVF）；WGA染色后的切片在熒光顯微鏡下獲取圖像，利用Image Pro Plus 5.0分析軟件計算心肌細胞橫截面積（CSA），每張切片選取10個視野，所得平均值進行統(tǒng)計分析。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 18.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，連續(xù)型變量以表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠收縮壓比較 高鹽干預12周時，HS組、HS+L組及HS+L+PBVM組收縮壓水平高于NS組，而HS+L+PBVM組收縮壓水平較HS+L組顯著減低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

Tab.2 The comparison of systolic blood pressure of mice between different groups表2 各組小鼠收縮壓的比較（n=8，mmHg，

Tab.2 The comparison of systolic blood pressure of mice between different groups表2 各組小鼠收縮壓的比較（n=8，mmHg，

＊＊P＜0.01；a與NS組比較，b與HS組比較，c與HS+L組比較，P＜0.05。1 mmHg=0.133 kPa。

組別NS組HS組HS+L組HS+L+PBVM組F基線113.13±4.82 114.25±4.17 112.25±4.23 113.63±3.11 0.335 8周115.13±5.69 134.63±4.57a 137.13±6.24a 138.00±13.71a 13.380＊＊12周113.25±4.33 136.63±13.05a 152.88±19.36ab 138.50±7.07ac 12.850＊＊

2.2 小鼠心肌組織中F4/80+/VEGFR-3+巨噬細胞的分析結果 小鼠心肌組織中VEGFR-3+巨噬細胞流式細胞術分析結果顯示，注射PBVM后，HS+L+PBVM組的F4/80+/VEGFR-3+巨噬細胞比例顯著高于HS+L組；HS+L+PBVM組F4/80+VEGFR-3+細胞在第3天達峰值，隨后逐漸減低，見表3。

2.3 各組小鼠淋巴管內皮細胞相關標志物及TonEBP的mRNA表達水平的比較 HS組、HS+L組及HS+L+PBVM組TonEBP、VEGF-C、Prox-1、Podoplanin及LYVE-1的mRNA表達水平高于NS組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；同時，HS+L+PBVM組VEGF-C、Prox-1、Podoplanin及LYVE-1的mRNA表達水平高于HS+L組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表4。

2.4 各組小鼠心臟超聲結果比較 與NS組比較，HS組、HS+L組及HS+L+PBVM組LVEDD顯著增加，LVEF及LVFS顯著減低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），出現(xiàn)不同程度的左心室肥厚及心臟收縮功能減低。HS+L+PBVM組LVEDD、LVPWT低于HS+L組，LVFS、LVEF高于HS+L組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2、表5。

Tab.3 The comparison of the ratio of F4/80+/VEGFR-3+macrophages in myocardial tissue of mice between the two groups表3 2組小鼠心肌組織中F4/80+/VEGFR-3+巨噬細胞比例的比較 （n=4，%）

Tab.3 The comparison of the ratio of F4/80+/VEGFR-3+macrophages in myocardial tissue of mice between the two groups表3 2組小鼠心肌組織中F4/80+/VEGFR-3+巨噬細胞比例的比較 （n=4，%）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別HS+L組HS+L+PBVM組t第1天14.62±0.28 17.58±1.96 2.990＊第2天14.92±0.39 24.67±0.74 23.310＊＊第3天14.96±0.31 27.83±0.98 25.040＊＊第5天15.07±0.23 24.76±3.46 5.589＊＊第7天14.89±0.86 17.26±1.35 2.961＊

Tab.4 The comparison of mRNA expression levels of phenotype markers of lymphatic endothelial cells and TonEBP between the four groups of mice表4 各組小鼠淋巴管內皮細胞表型標志物及TonEBP的mRNA表達水平比較 （n=3，）

Tab.4 The comparison of mRNA expression levels of phenotype markers of lymphatic endothelial cells and TonEBP between the four groups of mice表4 各組小鼠淋巴管內皮細胞表型標志物及TonEBP的mRNA表達水平比較 （n=3，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與NS組比較，b與HS組比較，c與HS+L組比較，P＜0.05。

組別NS組HS組HS+L組HS+L+PBVM組F TonEBP 1.00±0.00 2.17±0.27a 2.87±0.82a 2.35±0.72a 5.906＊VEGF-C 1.00±0.00 1.88±0.41a 1.80±0.40a 3.16±0.55abc 15.260＊＊Prox-1 1.00±0.00 2.77±0.48a 2.56±0.45a 3.73±0.34abc 28.360＊＊Podoplanin 1.00±0.00 2.33±0.64a 2.41±0.49a 3.95±0.46abc 20.400＊＊LYVE-1 1.00±0.00 2.69±0.49a 2.88±0.55a 4.38±1.03abc 14.330＊＊

Fig.2 The representative images of M-mode ultrasound of mice in each group圖2 各組小鼠心臟M型超聲代表性圖片

Tab.5 The comparison results of ultrasound indexes of mice between each group表5 各組小鼠心臟超聲指標的比較結果（n=5

Tab.5 The comparison results of ultrasound indexes of mice between each group表5 各組小鼠心臟超聲指標的比較結果（n=5

＊＊P＜0.01；a與NS組比較，b與HS組比較，c與HS+L組比較，P＜0.05。

組別NS組HS組HS+L組HS+L+PBVM組F LVEDD（mm）2.68±0.45 3.50±0.52a 4.03±0.15ab 3.25±0.06ac 12.540＊＊LVEF 0.65±0.03 0.48±0.04a 0.41±0.07ab 0.56±0.05abc 21.740＊＊LVFS 0.33±0.03 0.24±0.05a 0.19±0.02ab 0.27±0.03ac 17.120＊＊LVPWT（mm）0.76±0.11 0.88±0.06a 0.98±0.11a 0.75±0.08c 6.460＊＊

2.5 各組小鼠左心室心肌組織病理結果比較 與NS組比較，HS組、HS+L組及HS+L+PBVM組CSA及CVF顯著增加，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），左心室心肌細胞均有不同程度肥大，心肌間質纖維化程度增加。HS+L+PBVM組心肌CSA及CVF低于HS+L組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖3、表6。

3 討論

高血壓是心血管疾病最重要的危險因素之一［8］。隨著對高血壓發(fā)病機制研究的不斷深入，高鹽飲食與高血壓的關系成為研究的熱點［7，9-10］。長期高鹽飲食不僅可以引起血壓的升高，還可獨立于血壓水平引起靶器官的損傷［11-12］。由于人們高鹽飲食習慣在短時間內難以改變，探索高鹽攝入引起高血壓及靶器官損傷的機制，以延緩高血壓及靶器官的損傷進程尤為重要。

成年個體新生淋巴管的生成機制目前尚不清楚。有研究報道，外周血中有一部分組成性表達VEGFR-3的幼稚單核細胞，在特定條件下可以向2個方向分化，其中一部分在腫瘤壞死因子-α和（或）其他炎性因子的刺激下轉化為能分泌VEGF-C的巨噬細胞，誘導淋巴管內皮細胞的增殖；另一部分可以分化整合到臨近的淋巴管成為新的淋巴管內皮細胞［4-6］。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，長期的高鹽飲食干預在引起SHR大鼠血壓顯著升高的同時，心肌巨噬細胞浸潤程度及淋巴管的密度明顯增加，并伴隨著心肌細胞的肥大及心肌間質的纖維化，而通過調節(jié)巨噬細胞內TonEBP/VEGF-C信號通路引起心肌淋巴管的增生，可使巨噬細胞浸潤程度減輕，并明顯改善左心室重塑［2-3］。本研究發(fā)現(xiàn)，增加VEGFR-3+單核細胞比例可以改善高血壓小鼠收縮壓及左心室重塑，與此同時，心肌組織中淋巴管內皮細胞標志物表達水平也顯著增高，提示VEGFR-3+單核細胞可能通過促進淋巴管的生成進而對血壓及左心室重塑產生影響。

Fig.3 The representative images of WGA staining of left ventricular muscle of mice in each group圖3 各組小鼠左心室肌WGA及Masson染色的代表性圖片

Tab.6 The pathological staining analysis results of mice in each group表6 各組小鼠左室心肌CSA及CVF比較結果（n=4）

Tab.6 The pathological staining analysis results of mice in each group表6 各組小鼠左室心肌CSA及CVF比較結果（n=4）

＊＊P＜0.01；a與NS組比較，b與HS組比較，c與HS+L組比較，P＜0.05。

組別NS組HS組HS+L組HS+L+PBVM組F CSA（μm2）368.00±41.24 436.50±30.26a 592.00±24.12ab 498.00±36.89abc 31.750＊＊CVF（%）2.23±0.31 7.33±1.04a 16.15±2.07ab 10.83±1.27abc 77.560＊＊

關于促進淋巴管的增生可以改善高血壓及左心室重塑的機制，主要考慮以下2個方面：（1）高血壓狀態(tài)下心臟淋巴回流受阻，組織液進入淋巴管以及淋巴液回流到靜脈的過程均被抑制，引起心肌組織的淋巴水腫，淋巴水腫造成心肌間質壓力的增高，而心肌組織水腫液中的蛋白成分也會刺激膠原纖維的合成和沉積，進而導致心肌組織纖維化的加重［13-14］。（2）長期高血壓導致的心臟淋巴管的阻塞會引起心室肌細胞水腫、心肌纖維的變性、Z帶及閏盤的破裂以及線粒體結構的紊亂等結構的改變，這些改變是心室重塑的重要原因［15］。長期的淋巴管阻塞造成的心肌間質水腫可能由于氧供應受限及誘導缺血而引起心功能的異常，最終引起心力衰竭［16］。本研究顯示，通過促進淋巴管的生成，使得心肌間質壓力及水腫程度減輕，可以改善心肌纖維化程度及心臟功能。

本研究也存在不足之處。首先，本研究利用FACSAria流式細胞分選系統(tǒng)分選VEGFR-3+單核細胞，分選過程可能會對細胞產生一定損傷，研究中也發(fā)現(xiàn)分選出來的細胞在培養(yǎng)過程中會有部分死亡，如采用磁珠分選可能會減少細胞損傷，提高實驗效率；其次，本研究干預策略是將VEGFR-3+單核細胞回輸給高血壓小鼠，為了減少對細胞的損傷，利用流式細胞術分析間接證實了VEGFR-3+單核細胞可進入心肌組織，而采用細胞示蹤技術能更直觀地觀察回輸VEGFR-3+單核細胞在體內的活動軌跡；再者，本研究觀察了VEGFR-3+單核細胞對高血壓小鼠血壓及左心室重塑的影響，但并未對其機制進行深入探討，需要進一步研究證實。

總之，本研究以高鹽誘導的高血壓小鼠為研究對象，觀察了VEGFR-3+單核細胞對高血壓性左心室重塑的影響，結果提示通過調節(jié)VEGFR-3+單核細胞可以改善高血壓小鼠收縮壓與左心室重塑，為今后高血壓及靶器官損傷的防治研究提供了參考。