王耀東 ，李燦 ，楊勇 ，孫啟慧 ，容蓉 （.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，濟(jì)南 50355；.山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，濟(jì)南 50355）

麻黃細(xì)辛附子湯（Mahuang xixin fuzi decoction，MXF）始見于東漢張仲景的《傷寒論》，組方嚴(yán)謹(jǐn)、短小精練，是治療少陰陽(yáng)虛兼外感病證的經(jīng)典方劑[1]，在臨床應(yīng)用廣泛?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，MXF對(duì)感染普通流感的小鼠和腎陽(yáng)虛外感證模型小鼠均具有良好的藥效作用[2-3]。隨著中藥在全球的廣泛應(yīng)用，有關(guān)中藥不良反應(yīng)的報(bào)道越來越多。研究指出，MXF組方中麻黃、細(xì)辛、附子3味藥均為有毒中藥[4]。麻黃中含有多種苯丙胺類生物堿，其藥理、毒理作用與冰毒類毒品較為相似，服用過量會(huì)導(dǎo)致中樞神經(jīng)興奮、血壓升高、紫紺等毒副作用[5]。細(xì)辛中的揮發(fā)性成分易引起呼吸毒性，大劑量服用會(huì)引起肝腎毒性，甚至可導(dǎo)致嚴(yán)重的腎衰竭[6]。附子作為有毒中藥，其毒/效成分均為雙酯型生物堿[7]。目前對(duì)于MXF復(fù)方及單味藥的毒性作用研究較多，但其主要作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

代謝組學(xué)能夠通過多個(gè)學(xué)科技術(shù)的交叉互助，明確不同代謝模式下代謝物的變化，綜合評(píng)價(jià)給藥前后生物體液中小分子代謝物輪廓的改變，評(píng)價(jià)或預(yù)測(cè)藥物療效和毒性[8]。其中，糞便代謝物作為腸道菌和宿主共代謝的產(chǎn)物，檢測(cè)糞便中的代謝產(chǎn)物，能夠提供豐富的代謝組學(xué)信息，反映宿主機(jī)體以及腸道菌的狀態(tài)[9]。本研究選擇具有“效-毒二重性”的MXF為研究對(duì)象，以糞便代謝組學(xué)方法為研究手段，采用超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用（UHPLC-QE/MS）技術(shù)研究低、中、高劑量MXF灌胃正常小鼠后，小鼠糞便中內(nèi)源性代謝物的變化，以期從微觀角度闡釋MXF對(duì)小鼠的毒性作用機(jī)制，為MXF的臨床安全和規(guī)范化用藥提供依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器有Ultimate 3000-Q-Exactive型超高效液相-四極桿-傅里葉變換質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司），DW-HL668型超低溫冰箱（中科美菱低溫科技股份有限公司），DXL-XS型小鼠代謝籠（蘇州市馮氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)備有限公司），NJ 08818型渦旋儀（美國(guó)SI公司），ZIL-2型小鼠自主活動(dòng)儀（上海欣曼科教設(shè)備有限公司），01193-YP601N型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司），LabMaster-CaloSys型動(dòng)物代謝測(cè)量分析系統(tǒng)（德國(guó)TSE公司）。

1.2 主要藥品與試劑

麻黃、細(xì)辛飲片（批號(hào)分別為401003136P、401002360P）均購(gòu)自北京同仁堂（亳州）飲片責(zé)任有限公司，炒附片（批號(hào)191201）購(gòu)自四川江油中壩附子科技發(fā)展有限公司，以上飲片經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院李峰教授鑒定均為真品。L-2-氯苯丙氨酸購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；乙腈、甲酸為色譜純，水為蒸餾水。

1.3 動(dòng)物

48只SPF級(jí)雄性BABL/C小鼠，體質(zhì)量為（20±2）g，由濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（魯）2021-1007，動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK（魯）20170022。本實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)為SDUTCM2021030320。

2 方法

2.1 MXF的制備

參照文獻(xiàn)[10]的煎煮方法進(jìn)行制備：取麻黃15 g（去節(jié)），加蒸餾水1 000 mL浸泡30 min，大火煮沸至一定量后除去泡沫，加入細(xì)辛15 g和炒附片7.5 g，小火使其稍微沸騰至300 mL。藥液冷凍干燥后加入蒸餾水，用50 mL容量瓶定容，獲得質(zhì)量濃度為0.75 g/mL的濃縮藥液（以生藥量計(jì)，下同）。

2.2 動(dòng)物分組及給藥

48只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為空白組和MXF低、中、高劑量組（給藥劑量分別為11.262、33.786、45.050 g/kg，分別為10、30、40倍人體臨床劑量），每組12只。小鼠按照20 mL/kg灌胃，空白組小鼠灌胃等體積生理鹽水，其余各組分別灌胃相應(yīng)藥物，每日1次，連續(xù)灌胃7 d。收集小鼠末次灌胃后12 h的糞便樣品，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 毒性作用指標(biāo)測(cè)定

實(shí)驗(yàn)期間每天測(cè)量小鼠體質(zhì)量、肛溫，并觀察小鼠生存情況。末次灌胃后，處死小鼠，取各組小鼠心、肝、脾、肺等臟器，計(jì)算臟器指數(shù)（臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量/體質(zhì)量×100）。測(cè)定各組小鼠血清中的心肌功能指標(biāo)：肌酸激酶（creatine kinase，CK）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzyme，CK-MB）、CK-MB/CK比值、α-羥丁酸脫氫酶（α-hydroxybutyrate dehydrogenase，α-HBDH）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）；肝功能指標(biāo)：丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、AST/ALT比值和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）；腎功能指標(biāo)：尿素、肌酐、胱抑素C（cystatin C，CYS-C）等。

2.4 小鼠糞便代謝組學(xué)研究

2.4.1 溶液的制備 （1）內(nèi)標(biāo)溶液：精密稱取L-2-氯苯丙氨酸3.20 mg，加甲醇定容至10 mL，得到320 μg/mL的母液。吸取母液100 μL，加甲醇定容至10 mL，得到質(zhì)量濃度為3.20 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。（2）供試品溶液：稱取200 mg糞便樣本，加入600 μL甲醇和20 μL內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋10 min混合，以12 000 r/min離心20 min，吸取300 μL上清液；重復(fù)上述操作1次，合并上清液，作為供試品溶液。（3）質(zhì)量控制（QC）樣本溶液：從空白組和MXF低、中、高劑量組每個(gè)糞便樣本中稱取相同質(zhì)量的糞便樣品，置于同一容器中，混合均勻，按照“2.4.1（2）”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備QC樣本溶液。

2.4.2 色譜條件與質(zhì)譜條件 （1）色譜條件：色譜柱為HALO-C18（2.1 mm×100 mm，2.7 μm），以0.05%甲酸溶液為流動(dòng)相A、0.05%甲酸乙腈溶液為流動(dòng)相B進(jìn)行梯度洗脫（0～5 min，5%B→10%B；5～15 min，10%B→40%B；15～25 min，40%B→98%B；25～26 min，98%B→100%B；26～28 min，100%B；28～29 min，100%B→5%B；29～32 min，5%B），柱溫為30 °C，進(jìn)樣量為5 μL，流速為0.3 mL/min。（2）質(zhì)譜條件：采用正、負(fù)離子掃描模式進(jìn)行檢測(cè)。離子源為電噴霧電離源（ESI），毛細(xì)管電壓為3.5 kV，毛細(xì)管溫度為350 ℃，鞘氣為45 arb，輔助氣為10 arb，源內(nèi)溫度為350 ℃，質(zhì)譜采集范圍為m/z 50～1 500，分辨率為70 000。

2.4.3 樣本檢測(cè) 為保障樣本數(shù)據(jù)采集的重現(xiàn)性與質(zhì)譜儀器的穩(wěn)定性，在檢測(cè)序列中每6個(gè)樣本添加1個(gè)QC樣本。將正、負(fù)離子模式下采集的所有樣本數(shù)據(jù)連同QC樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA），判斷儀器的穩(wěn)定性。

2.5 數(shù)據(jù)處理

2.5.1 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 毒性作用指標(biāo)采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，數(shù)據(jù)以±s表示。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。采用GraphPad Prism 9.0軟件進(jìn)行小鼠生存率分析。

2.5.2 糞便代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理方法 糞便代謝組學(xué)原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后首先采用R語(yǔ)言軟件進(jìn)行色譜峰識(shí)別、對(duì)齊等處理，參數(shù)設(shè)定使用默認(rèn)數(shù)值，并采用修正80%規(guī)則去除缺失值，得到一個(gè)保留時(shí)間、m/z和峰強(qiáng)度的三維數(shù)據(jù)矩陣；將得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的降維和標(biāo)準(zhǔn)化處理，采用無(wú)監(jiān)督的PCA和有監(jiān)督的正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以投影變量重要性（variable importance for the projection，VIP）值＞1、方差分析中P＜0.05、倍數(shù)變化（fold change，F(xiàn)C）＞1為條件，篩選得到潛在生物標(biāo)志物。

2.5.3 生物標(biāo)志物鑒定及代謝通路分析 將“2.5.2”項(xiàng)下獲得的潛在生物標(biāo)志物的保留時(shí)間、精確m/z以及同位素比例等信息輸入在線數(shù)據(jù)庫(kù)METLIN（https：//metlin.scripps.edu）、HMDB（https：//hmdb.ca）進(jìn)行標(biāo)志物的檢索和鑒定，使用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//kegg.jp）進(jìn)行代謝通路分析。

3 結(jié)果

3.1 小鼠體質(zhì)量、肛溫和生存率的測(cè)定結(jié)果

灌胃7 d內(nèi)，空白組小鼠體質(zhì)量持續(xù)增長(zhǎng)，肛溫維持在36～39 ℃范圍內(nèi)，相對(duì)穩(wěn)定。與空白組相比，MXF低劑量組小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；MXF中劑量組小鼠第3～5天、MXF高劑量組小鼠第2～7天體質(zhì)量顯著低于空白組（P＜0.05）。與空白組相比，各給藥組小鼠的肛溫差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。給藥第2天，MXF中、高劑量組有小鼠死亡，生存率分別為58.33%、50.00%，后續(xù)指標(biāo)檢測(cè)按代謝組學(xué)樣本數(shù)量的最低要求進(jìn)行，每組6只。結(jié)果見圖1和圖2。

圖1 各組小鼠體質(zhì)量和肛溫變化圖

圖2 各組小鼠生存率變化圖

3.2 小鼠臟器指數(shù)的檢測(cè)結(jié)果

與空白組相比，各給藥組小鼠的心指數(shù)、肝指數(shù)、腎指數(shù)、精囊腺指數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；各給藥組小鼠的脾指數(shù)、肺指數(shù)、腎上腺指數(shù)均顯著升高，胸腺指數(shù)顯著降低（P＜0.05）；MXF低、高劑量組小鼠的睪丸指數(shù)均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見表1。

表1 各組小鼠臟器指數(shù)的檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝6）

表1 各組小鼠臟器指數(shù)的檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝6）

a：與空白組相比，P＜0.05

組別空白組MXF低劑量組MXF中劑量組MXF高劑量組精囊腺指數(shù)0.36±0.10 0.45±0.16 0.41±0.21 0.45±0.15心指數(shù)0.56±0.10 0.59±0.10 0.54±0.05 0.52±0.00脾指數(shù)0.39±0.04 0.43±0.06a 0.46±0.07a 0.47±0.17a肝指數(shù)5.71±0.49 5.53±0.41 5.55±0.47 5.31±0.38肺指數(shù)0.63±0.07 0.78±0.11a 0.60±0.25a 0.69±0.12a腎指數(shù)1.58±0.19 1.62±0.25 1.57±0.09 1.61±0.19睪丸指數(shù)0.70±0.07 0.80±0.10a 0.69±0.15 0.72±0.04a胸腺指數(shù)0.31±0.03 0.19±0.05a 0.18±0.04a 0.16±0.00a腎上腺指數(shù)0.01±0.01 0.04±0.02a 0.02±0.00a 0.03±0.00a

3.3 血清生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

與空白組相比，各給藥組小鼠的心肌功能指標(biāo)CK水平顯著升高（P＜0.05），MXF低劑量組的CK-MB/CK比值顯著降低（P＜0.05）；MXF中劑量組的心肌功能指標(biāo)α-HBDH、LDH水平均顯著升高（P＜0.05），肝功能指標(biāo)ALP水平顯著降低（P＜0.05）；MXF中、高劑量組的腎功能指標(biāo)尿素水平顯著升高（P＜0.05），CYS-C水平顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見表2～表4。

表2 各組小鼠心肌功能指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝6）

表2 各組小鼠心肌功能指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝6）

a：與空白組相比，P＜0.05

組別空白組MXF低劑量組MXF中劑量組MXF高劑量組α-HBDH/（U/L）504.83±83.23 469.83±94.77 617.14±17.77a 491.33±51.05 CK/（U/L）101.95±19.21 210.60±92.43a 178.69±67.96a 187.67±88.62a CK-MB/（U/L）28.33±4.42 46.37±7.34 52.34±12.06 47.80±10.11 CK-MB/CK比值0.35±0.11 0.25±0.10a 0.33±0.13 0.29±0.10 LDH/（U/L）131.50±18.70 130.67±23.16 160.57±44.39a 127.00±19.09

表4 各組小鼠腎功能指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝6）

表4 各組小鼠腎功能指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝6）

a：與空白組相比，P＜0.05

組別空白組MXF低劑量組MXF中劑量組MXF高劑量組CYS-C/（μmol/L）0.25±0.04 0.21±0.04 0.19±0.04a 0.20±0.02a尿素/（mmol/L）7.04±0.81 7.16±1.16 8.85±1.53a 10.54±1.47a肌酐/（μmol/L）12.18±0.80 11.67±0.78 12.00±1.15 11.33±1.63

表3 各組小鼠肝功能指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝6）

表3 各組小鼠肝功能指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果（±s，n＝6）

a：與空白組相比，P＜0.05

組別空白組MXF低劑量組MXF中劑量組MXF高劑量組ALT/（U/L）23.33±6.17 30.67±4.62 28.86±5.27 30.33±6.50 AST/（U/L）86.83±9.81 96.17±18.56 97.14±17.31 91.67±25.47 AST/ALT比值3.06±0.62 3.20±0.78 3.40±0.57 3.03±0.57 ALP/（U/L）96.42±11.56 87.42±16.89 83.14±6.59a 84.67±19.22

3.4 糞便代謝組學(xué)結(jié)果

3.4.1 樣本質(zhì)量控制 將正、負(fù)離子模式下采集的所有樣本數(shù)據(jù)連同QC樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA，其中QC樣本聚集良好，說明儀器性能良好、數(shù)據(jù)質(zhì)量可信，結(jié)果見圖3。

圖3 正、負(fù)離子模式各組小鼠糞便QC樣本PCA圖

3.4.2 糞便樣品分析 不同組小鼠糞便樣品代謝組學(xué)的正、負(fù)離子模式下各組樣品的總離子流（TIC）疊加圖見圖4。結(jié)果顯示，各組樣本分離度良好。

圖4 正、負(fù)離子模式各組小鼠糞便樣品TIC疊加圖

3.4.3 數(shù)據(jù)模式識(shí)別分析 數(shù)據(jù)預(yù)處理后，分別進(jìn)行PCA和OPLS-DA，空白組和MXF低、中、高劑量組可在空間上完全分開，結(jié)果見圖5。其中模型X軸累積解釋率（R2X）、模型累積預(yù)測(cè)率（Q2）均大于0.5，說明模型預(yù)測(cè)效果良好。為了防止模型過度擬合，本研究又進(jìn)行了排列檢驗(yàn)各100次，結(jié)果正離子模式下模型Y軸累積解釋率（R2Y）分別為0.834、0.629、0.789，Q2分別為-0.138、-0.131、-0.025；負(fù)離子模式下R2Y分別為0.777、0.653、0.578，Q2分別為-0.262、-0.079 8、-0.102。Q2均為負(fù)值表明模型預(yù)測(cè)能力良好，沒有過度擬合的現(xiàn)象[11]。

圖5 正、負(fù)離子模式各組小鼠糞便樣品OPLS-DA散點(diǎn)圖

3.4.4 潛在生物標(biāo)志物的篩選和鑒定 通過PCA、OPLS-DA、方差分析和FC分析，最終認(rèn)為FC＞1、P＜0.05、VIP值＞1的變量為潛在生物標(biāo)志物。通過標(biāo)志物的保留時(shí)間、精確m/z以及同位素比例等信息，在METLIN、HMDB和KEGG等數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行搜索，結(jié)果正、負(fù)離子模式下分別鑒定出12、7個(gè)潛在生物標(biāo)志物。結(jié)果見表5。

表5 MXF對(duì)正常小鼠毒性相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物鑒定結(jié)果

3.4.5 代謝通路關(guān)聯(lián)分析 利用MetaboAnalyst對(duì)19個(gè)潛在生物標(biāo)志物進(jìn)行通路富集分析和通路拓?fù)浞治?，結(jié)果見圖6。圖中圓圈代表了所有匹配的代謝通路，每個(gè)圓圈的顏色和大小分別依據(jù)代謝通路的P值和重要值界定——當(dāng)某一條代謝通路的重要值大于0.05時(shí)，認(rèn)為其為潛在靶標(biāo)代謝通路。結(jié)果，共鑒定出6個(gè)代謝通路。

圖6 MXF對(duì)正常小鼠毒性相關(guān)潛在生物標(biāo)志物的代謝通路圖

4 討論

4.1 MXF對(duì)小鼠毒性作用指標(biāo)的影響

毒性作用指標(biāo)顯示，低、中、高劑量MXF對(duì)正常小鼠的體質(zhì)量均產(chǎn)生一定影響，給藥劑量越大影響越大，隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，中劑量組和高劑量組小鼠均出現(xiàn)個(gè)體死亡情況。MXF低、高劑量組小鼠的睪丸指數(shù)均顯著升高，MXF低、中、高劑量組的脾指數(shù)、肺指數(shù)和腎上腺指數(shù)均顯著升高，胸腺指數(shù)均顯著降低（P＜0.05）；MXF低、中、高劑量組的心肌功能指標(biāo)CK水平顯著上升，MXF低劑量組的CK-MB/CK比值顯著下降（P＜0.05）；MXF中劑量組的心肌功能指標(biāo)α-HBDH、LDH水平均顯著升高，肝功能指標(biāo)ALP水平顯著降低（P＜0.05）；MXF中、高劑量組的腎功能指標(biāo)尿素水平顯著上升，CYS-C水平則顯著下降（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，MXF給藥達(dá)到一定劑量后會(huì)對(duì)小鼠心臟、肝臟、腎臟等產(chǎn)生一定的毒副作用，嚴(yán)重的會(huì)導(dǎo)致小鼠死亡。

4.2 MXF對(duì)小鼠的毒性作用機(jī)制

糞便代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，MXF低、中、高劑量組氨基酸代謝通路中L-丙氨酸、L-脯氨酸、苯丙酮酸、L-蛋氨酸、L-酪氨酸、肌酸、吲哚酚含量均顯著下降。這些氨基酸類物質(zhì)與機(jī)體共生菌關(guān)系密切，是機(jī)體-腸菌的共同代謝產(chǎn)物[12]，在機(jī)體的炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)以及三羧酸循環(huán)過程中發(fā)揮著重要作用[13-14]。在MXF誘導(dǎo)的毒性模型中，小鼠糞便樣本中PC含量顯著下降（表5）。PC是磷脂家族成員，其在腸黏膜上分布最為廣泛。有報(bào)道稱，在炎癥介導(dǎo)的腸黏膜中PC水平顯著下降，增加PC可提高黏膜PC濃度，從而改善腸道炎癥狀態(tài)[15]。脂肪酸類物質(zhì)能夠?yàn)槟c道細(xì)菌的生長(zhǎng)和繁殖提供所需的環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，尤其是丁酸[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，MXF低、中、高劑量組中3-磷酸甘油和甲基戊二酸含量均顯著下降（表5），推測(cè)MXF可能抑制了小鼠腸道菌群活性，使其發(fā)揮糖酵解的功能下降?？梢?，MXF對(duì)正常小鼠的毒性作用機(jī)制可能與降低了正常小鼠糞便中多種氨基酸、PC、3-磷酸甘油和甲基戊二酸等內(nèi)源性代謝物相關(guān)，進(jìn)而造成小鼠腸道菌群紊亂，腸道炎癥反應(yīng)發(fā)生和機(jī)體免疫反應(yīng)失調(diào)。

綜上所述，本研究分別從宏觀毒性作用指標(biāo)和微觀代謝生物標(biāo)志物層面探究了MXF對(duì)小鼠的毒性作用和可能機(jī)制。結(jié)果表明，MXF達(dá)到一定劑量會(huì)對(duì)小鼠的體質(zhì)量、多臟器和血清生化指標(biāo)產(chǎn)生不良影響，從而表現(xiàn)出一定的毒性作用，其作用機(jī)制可能與擾亂機(jī)體的腸道菌群代謝、引起炎癥反應(yīng)和造成免疫失調(diào)有關(guān)。