李從欣 ，劉國強 ，劉洋 ，張之晗 ，閻偉 ，梁春慧 （.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院藥劑科，石家莊 05005；.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院臨床營養(yǎng)科，石家莊 0500）

小分子酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors，TKIs）在臨床應(yīng)用廣泛且效果顯著，對提高腫瘤患者存活率、改善其生存質(zhì)量具有重要意義[1]。然而，臨床實踐顯示，部分TKIs具有明顯的心臟毒性，主要表現(xiàn)為QT間期延長、高血壓、心肌肥厚、左室收縮功能障礙等，嚴(yán)重者可引發(fā)心力衰竭，甚至影響腫瘤患者的治療計劃及生存期[1-2]。舒尼替尼是一種多靶點TKIs，研究表明，其可導(dǎo)致28%的患者出現(xiàn)不同程度的心臟收縮功能障礙，其中8%的患者可進展為心力衰竭[3]。動物研究發(fā)現(xiàn)，舒尼替尼可劑量依賴性地降低小鼠心肌細(xì)胞鈣瞬變幅度，抑制心臟肌張力[4]；可通過顯著抑制腺苷一磷酸活化蛋白激酶、磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）、蛋白激酶A和Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱδ等的活性來影響實驗動物的心臟功能[5-7]。目前，舒尼替尼致心臟毒性的確切分子機制尚不明確，且無特異性的防治策略，導(dǎo)致該藥的臨床應(yīng)用受限[7]。

PI3K是一種進化高度保守的激酶家族，其α、β亞型均可參與心肌細(xì)胞Ca2+循環(huán)及興奮收縮偶聯(lián)，敲除PI3K α或β編碼基因可引發(fā)心力衰竭[8]。由于心肌細(xì)胞正常收縮與Ca2+循環(huán)密切相關(guān)，因此本課題組假設(shè)舒尼替尼可通過抑制PI3K活性而引發(fā)Ca2+調(diào)控紊亂，從而導(dǎo)致心臟收縮功能障礙。人源誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞來源的心肌細(xì)胞（human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes，hiPSC-CMs）具有人類心肌細(xì)胞的基本功能及特點（如心肌細(xì)胞的信號調(diào)控、離子通道及通道蛋白轉(zhuǎn)運等），同時能夠?qū)λ幬锘螂娚泶碳ぷ鞒鲂募〖?xì)胞樣反應(yīng)，是目前評價藥物致心肌細(xì)胞電生理功能障礙和開展心血管疾病研究、藥物臨床前毒性監(jiān)測的重要細(xì)胞模型[9]?；诖?，本研究以舒尼替尼誘導(dǎo)hiPSC-CMs建立收縮功能障礙細(xì)胞模型，探討PI3K在此過程中的作用，為TKIs等抗腫瘤藥物的心臟毒性機制研究和藥物臨床前心臟毒性風(fēng)險篩查提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括CardioExcyte 96型非標(biāo)記心臟安全評價系統(tǒng)、NSP-96型電極孔板（德國Nanion Technology公司），TCS SP5-Ⅱ型激光共聚焦顯微鏡系統(tǒng)（德國Leica公司），HF90型CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（上海力申科學(xué)儀器有限公司），NanoDrop 100型微量核酸蛋白檢測儀（美國Genentech公司），TU-1800型分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），DW-86L388L型-80 ℃生物冰箱（青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

hiPSC-CMs完全培養(yǎng)基購自北京賽貝生物技術(shù)有限公司；蘋果酸舒尼替尼原料藥（貨號HY-10255，純度99.60%）、陰性對照阿西替尼原料藥（貨號HY-10065，純度99.60%）均購自美國MedChemExpress公司；陽性對照阿霉素原料藥（貨號25316-40-9，純度＞95.0%）購自東京化成工業(yè)株式會社；PI3K的激活劑3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol 3，4，5-triphosphate，PIP3）購自美國Echelon Biosciences公司（貨號P-3917，純度＞95.0%）；鈣離子熒光探針Fluo-4/AM（貨號F14217）購自美國Life Technology公司；表面活性劑F127（貨號9003-11-6）購自美國Sigma公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Promega公司；SYBR PCR Mix試劑盒購自日本TaKaRa公司。本研究所用心房鈉尿肽（atrial natriuretic peptide，ANP）、腦鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）和β-肌凝蛋白重鏈（β-myosin heavy chain，β-MHC）的引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列及擴增產(chǎn)物長度見表1。

表1 引物序列及擴增產(chǎn)物長度

1.3 實驗細(xì)胞

hiPSC-CMs購自北京賽貝生物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 hiPSC-CMs的培養(yǎng)

細(xì)胞復(fù)蘇后，分別按30 000、10 000個/孔接種至NSP-96型電極孔板（經(jīng)纖連蛋白鋪底）和48孔板（提前放入6 mm的玻璃小片）內(nèi)，混勻，常溫下放置30 min后，于37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞鋪板復(fù)蘇48 h后，吸棄上清液，加入hiPSC-CMs完全培養(yǎng)基。在給藥前，每24 h更換一半培養(yǎng)基。預(yù)實驗顯示，在復(fù)蘇5 d后，細(xì)胞電信號逐漸達到平臺期，可進行后續(xù)實驗。

2.2 舒尼替尼對hiPSC-CMs收縮力的影響考察

阿霉素和阿西替尼采用二甲基亞砜（DMSO）配制成1 mmol/L的母液，舒尼替尼采用DMSO分別配制成0.5、1、3、5、10 mmol/L的母液，PIP3采用高壓滅菌水配制成1 mmol/L的母液，上述母液均于-20 ℃保存。根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，將阿霉素和阿西替尼的給藥濃度設(shè)為1 μmol/L，分別在給藥前和孵育24 h后，采用CardioExcyte 96系統(tǒng)檢測2種藥物對hiPSC-CMs收縮力的影響，以驗證檢測系統(tǒng)的敏感性。

將hiPSC-CMs按30 000個/孔接種于NSP-96型電極孔板（經(jīng)纖連蛋白鋪底）中，然后以不同濃度[0（對照，含0.1%DMSO溶劑）、0.5、1、3、5、10 μmol/L，根據(jù)本課題組前期預(yù)實驗設(shè)置]舒尼替尼干預(yù)，每個濃度平行設(shè)置4個復(fù)孔。采用CardioExcyte 96系統(tǒng)進行檢測，給藥前30 min記錄給藥前收縮力，給藥后設(shè)定檢測程序：前2 h，每10 min檢測1次收縮信號，觀察舒尼替尼對hiPSC-CMs收縮力的急性抑制作用；給藥2 h后，系統(tǒng)每1 h記錄1次數(shù)據(jù)，記錄至給藥24 h時，然后擬合舒尼替尼抑制hiPSC-CMs收縮力的半數(shù)抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）。

2.3 舒尼替尼對hiPSC-CMs收縮頻率的影響考察

將hiPSC-CMs復(fù)蘇，按30 000個/孔接種于NSP-96型電極孔板（經(jīng)纖連蛋白鋪底），分為對照組（0.1%DMSO）和舒尼替尼組（3.14 μmol/L，根據(jù)“2.2”項下結(jié)果設(shè)置）。采用CardioExcyte 96系統(tǒng)檢測給藥/溶劑前30 min及給藥/溶劑后24 h各組細(xì)胞的收縮頻率。

2.4 舒尼替尼對hiPSC-CMs鈣瞬變幅度和鈣瞬變恢復(fù)時程的影響考察

將hiPSC-CMs復(fù)蘇，按10 000個/孔接種于48孔板（提前放入6 mm的玻璃小片）內(nèi)，分為對照組（0.1%DMSO）和舒尼替尼組（3.14 μmol/L，根據(jù)“2.2”項下結(jié)果設(shè)置），每組設(shè)4個復(fù)孔。作用24 h后，取出細(xì)胞小片置于氧飽和的有鈣臺式液中，隨后用含5 μmol/L Fluo-4/AM的鈣離子熒光探針和0.02%F127的有鈣臺式液，于37 ℃避光孵育20 min；更換有鈣臺式液后，將各組細(xì)胞于37 ℃恒溫浴槽內(nèi)持續(xù)灌流臺式液，通過激光共聚焦顯微鏡線掃模式記錄細(xì)胞自發(fā)鈣瞬變幅度和鈣瞬變恢復(fù)時程。

2.5 舒尼替尼對 hiPSC-CMs中 ANP、BNP、β-MHC mRNA表達水平的影響考察

將hiPSC-CMs復(fù)蘇，按30 000個/孔接種于96孔板中，按“2.3”項下方法分組與干預(yù)，每組設(shè)4個復(fù)孔，作用24 h后，提取hiPSC-CMs總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以cDNA為模板進行PCR。PCR反應(yīng)體系（共20 μL）包括：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL，ddH2O 6 μL，上下游引物各0.8 μL，cDNA 2 μL，ROX 0.4 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法分析目的基因mRNA的表達水平。

2.6 PI3K對舒尼替尼致hiPSC-CMs收縮抑制的影響考察

將hiPSC-CMs復(fù)蘇后，按30 000個/孔接種于NSP-96型電極孔板（經(jīng)纖連蛋白鋪底）中，分為對照組、PIP3組（1 μmol/L，劑量根據(jù)預(yù)實驗設(shè)置）、舒尼替尼組（3.14 μmol/L）和舒尼替尼+PIP3組（3.14 μmol/L舒尼替尼+1 μmol/L PIP3），每組設(shè)4個復(fù)孔。PIP3組和舒尼替尼+PIP3組細(xì)胞提前用PIP3孵育4 h，然后各組再分別用0.1%DMSO或舒尼替尼（3.14 μmol/L）孵育24 h，采用CardioExcyte 96系統(tǒng)檢測各組細(xì)胞的收縮力。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 7、SPSS 20.0、Adobe Illustrator CS5進行圖像處理及數(shù)據(jù)分析，實驗數(shù)據(jù)用±s表示。對服從正態(tài)分布和方差齊性的數(shù)據(jù)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Dunnett’s post hoc檢驗。對不服從正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，采用Mann-Whitney非參數(shù)檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 舒尼替尼對hiPSC-CMs收縮力的影響

由圖1可知，給藥24 h后，阿霉素顯著減弱了hiPSCCMs的收縮力（P＜0.05），而阿西替尼對hiPSC-CMs收縮力并無顯著影響（P＞0.05），這表明檢測系統(tǒng)敏感。由圖2可知，舒尼替尼對hiPSC-CMs收縮力的抑制作用有濃度依賴趨勢，且當(dāng)舒尼替尼濃度≥1 μmol/L時，hiPSC-CMs收縮力呈明顯下降的趨勢。經(jīng)擬合，舒尼替尼抑制hiPSC-CMs收縮力的IC50值為3.14 μmol/L。

圖1 阿西替尼和阿霉素對hiPSC-CMs收縮力的影響[±s，n＝4（阿西替尼）或n＝3（阿霉素）]

圖2 不同濃度舒尼替尼對hiPSC-CMs收縮力的影響（±s，n＝4）

3.2 舒尼替尼對hiPSC-CMs收縮頻率的影響

對照組hiPSC-CMs給溶劑前后，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。舒尼替尼組給藥后，與對照組或給藥前比較，hiPSC-CMs收縮頻率均顯著降低（P＜0.01）。結(jié)果見圖3。

圖3 舒尼替尼對hiPSC-CMs收縮頻率的影響[±s，n＝4（對照組）或n＝3（舒尼替尼組）]

3.3 舒尼替尼對hiPSC-CMs鈣瞬變幅度和鈣瞬變恢復(fù)時程的影響

與對照組相比，舒尼替尼組hiPSC-CMs鈣瞬變幅度顯著降低（P＜0.05），鈣瞬變恢復(fù)時程顯著延長（P＜0.05）。結(jié)果見圖4。

圖4 舒尼替尼對hiPSC-CMs鈣瞬變幅度和鈣瞬變恢復(fù)時程的影響（±s，n＝4）

3.4 舒尼替尼對 hiPSC-CMs 中 ANP、BNP、β-MHC mRNA表達的影響

與對照組比較，舒尼替尼組hiPSC-CMs中ANP、BNP、β-MHC mRNA表達水平均顯著升高（P＜0.01）。結(jié)果見圖5。

圖5 舒尼替尼對hiPSC-CMs中ANP、BNP、β-MHC mRNA表達的影響（±s，n＝4）

3.5 PI3K對舒尼替尼致hiPSC-CMs收縮抑制的影響

與對照組相比，PIP3組hiPSC-CMs收縮力差異無統(tǒng)計學(xué)意義，舒尼替尼組hiPSC-CMs收縮力顯著降低（P＜0.05）；與舒尼替尼組比較，舒尼替尼+PIP3組hiPSCCMs收縮力顯著升高（P＜0.01）。結(jié)果見圖6。

圖6 PI3K對舒尼替尼致hiPSC-CMs收縮抑制的影響（±s，n＝4）

4 討論

目前，TKIs心臟毒性的分子機制研究及臨床藥物毒性篩選大多仍基于動物體內(nèi)模型或動物體外原代細(xì)胞模型、異源表達細(xì)胞模型或非心室來源的心肌細(xì)胞系，不能完全模擬人體心肌細(xì)胞的特征。hiPSC-CMs克服了人和其他動物種屬間的差異和其他細(xì)胞模型的局限性，是理想的人源心肌細(xì)胞研究模型，目前已逐步應(yīng)用于多種藥物的心臟毒性風(fēng)險篩查[10]。相關(guān)研究在動物和非人源細(xì)胞水平觀察了舒尼替尼心臟毒性及相關(guān)分子機制[3，11-12]，但確切的分子機制還不明確。同時，尚缺乏舒尼替尼在hiPSC-CMs水平急性心肌毒性的機制及防治措施的相關(guān)研究。基于此，本研究以hiPSC-CMs為模型細(xì)胞，用舒尼替尼誘導(dǎo)建立收縮功能障礙細(xì)胞模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，舒尼替尼可引發(fā)hiPSC-CMs鈣調(diào)控紊亂，進而抑制細(xì)胞收縮力和收縮頻率，表明在hiPSC-CMs水平建立TKIs致心肌細(xì)胞收縮功能障礙模型具有可行性。但是，本研究所購買的細(xì)胞為正常個體的人誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞，而藥物臨床應(yīng)用誘發(fā)的心臟毒性往往存在個體差異，可能存在基因敏感性[13]。鑒于目前實驗技術(shù)日益成熟，TKIs藥物毒性研究可從臨床出發(fā)，獲得藥物使用過程中發(fā)生了心臟毒性患者的體細(xì)胞，將其誘導(dǎo)成多潛能干細(xì)胞，再進一步分化獲得攜帶特定遺傳背景的hiPSC-CMs[14]，在此基礎(chǔ)上再進行TKIs心臟毒性機制研究，可能對患者的個體化治療更具意義。

心肌細(xì)胞興奮-收縮耦聯(lián)平衡和鈣穩(wěn)態(tài)是心肌收縮的核心環(huán)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，多靶點TKIs伊馬替尼可激活Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ，使其磷酸化水平增強，進而導(dǎo)致新生大鼠心肌細(xì)胞鈣調(diào)控異常，引發(fā)病理性心肌肥厚[15]。另一種TKIs索拉非尼的急性毒性作用則可導(dǎo)致心肌細(xì)胞受磷蛋白磷酸化降低，從而減弱其對心肌肌質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶的親和力，使肌質(zhì)網(wǎng)鈣瞬變幅度降低50%、鈣儲備降低33%，從而抑制心肌細(xì)胞收縮力[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，舒尼替尼可呈濃度依賴趨勢地抑制hiPSC-CMs的收縮，同時可破壞鈣調(diào)控的穩(wěn)態(tài)，具體表現(xiàn)為顯著的鈣瞬變幅度下降和鈣瞬變恢復(fù)時程延長。這與前期相關(guān)研究觀察到的舒尼替尼急性毒性作用會濃度依賴性地降低鈣瞬變幅度，從而減弱心肌細(xì)胞收縮力的結(jié)果一致[4]。這說明舒尼替尼引發(fā)鈣調(diào)控紊亂導(dǎo)致hiPSC-CMs收縮抑制可能和鈣通道內(nèi)流和肌質(zhì)網(wǎng)鈣泵活性降低有關(guān)，與其他體內(nèi)研究和體外細(xì)胞水平結(jié)果相一致[4-6]。前期相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，抑制PI3K活性是舒尼替尼、達沙替尼和厄洛替尼引發(fā)心律失常的重要因素[14]。本研究發(fā)現(xiàn)激活PI3K可顯著改善舒尼替尼導(dǎo)致的心肌收縮功能障礙，進一步提示，抑制PI3K活性是TKIs心臟毒性的分子機制。另外，TKIs按作用靶點可分為單靶點、多靶點，本研究選擇多靶點的舒尼替尼作為代表藥物研究了TKIs的心臟毒性，下一步擬選擇多種TKIs類藥物（包括不同靶點類型、不同抗腫瘤機制）驗證本研究結(jié)論。

綜上所述，本研究證明激活PI3K活性是改善舒尼替尼致心肌毒性的潛在分子機制。