李從欣 ，劉國(guó)強(qiáng) ，劉洋 ，張之晗 ，閻偉 ，梁春慧 （.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院藥劑科，石家莊 05005；.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院臨床營(yíng)養(yǎng)科，石家莊 0500）

小分子酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors，TKIs）在臨床應(yīng)用廣泛且效果顯著，對(duì)提高腫瘤患者存活率、改善其生存質(zhì)量具有重要意義[1]。然而，臨床實(shí)踐顯示，部分TKIs具有明顯的心臟毒性，主要表現(xiàn)為QT間期延長(zhǎng)、高血壓、心肌肥厚、左室收縮功能障礙等，嚴(yán)重者可引發(fā)心力衰竭，甚至影響腫瘤患者的治療計(jì)劃及生存期[1-2]。舒尼替尼是一種多靶點(diǎn)TKIs，研究表明，其可導(dǎo)致28%的患者出現(xiàn)不同程度的心臟收縮功能障礙，其中8%的患者可進(jìn)展為心力衰竭[3]。動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，舒尼替尼可劑量依賴(lài)性地降低小鼠心肌細(xì)胞鈣瞬變幅度，抑制心臟肌張力[4]；可通過(guò)顯著抑制腺苷一磷酸活化蛋白激酶、磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）、蛋白激酶A和Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴(lài)性蛋白激酶Ⅱδ等的活性來(lái)影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的心臟功能[5-7]。目前，舒尼替尼致心臟毒性的確切分子機(jī)制尚不明確，且無(wú)特異性的防治策略，導(dǎo)致該藥的臨床應(yīng)用受限[7]。

PI3K是一種進(jìn)化高度保守的激酶家族，其α、β亞型均可參與心肌細(xì)胞Ca2+循環(huán)及興奮收縮偶聯(lián)，敲除PI3K α或β編碼基因可引發(fā)心力衰竭[8]。由于心肌細(xì)胞正常收縮與Ca2+循環(huán)密切相關(guān)，因此本課題組假設(shè)舒尼替尼可通過(guò)抑制PI3K活性而引發(fā)Ca2+調(diào)控紊亂，從而導(dǎo)致心臟收縮功能障礙。人源誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞來(lái)源的心肌細(xì)胞（human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes，hiPSC-CMs）具有人類(lèi)心肌細(xì)胞的基本功能及特點(diǎn)（如心肌細(xì)胞的信號(hào)調(diào)控、離子通道及通道蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)等），同時(shí)能夠?qū)λ幬锘螂娚泶碳ぷ鞒鲂募〖?xì)胞樣反應(yīng)，是目前評(píng)價(jià)藥物致心肌細(xì)胞電生理功能障礙和開(kāi)展心血管疾病研究、藥物臨床前毒性監(jiān)測(cè)的重要細(xì)胞模型[9]?；诖耍狙芯恳允婺崽婺嵴T導(dǎo)hiPSC-CMs建立收縮功能障礙細(xì)胞模型，探討PI3K在此過(guò)程中的作用，為T(mén)KIs等抗腫瘤藥物的心臟毒性機(jī)制研究和藥物臨床前心臟毒性風(fēng)險(xiǎn)篩查提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括CardioExcyte 96型非標(biāo)記心臟安全評(píng)價(jià)系統(tǒng)、NSP-96型電極孔板（德國(guó)Nanion Technology公司），TCS SP5-Ⅱ型激光共聚焦顯微鏡系統(tǒng)（德國(guó)Leica公司），HF90型CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（上海力申科學(xué)儀器有限公司），NanoDrop 100型微量核酸蛋白檢測(cè)儀（美國(guó)Genentech公司），TU-1800型分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），DW-86L388L型-80 ℃生物冰箱（青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

hiPSC-CMs完全培養(yǎng)基購(gòu)自北京賽貝生物技術(shù)有限公司；蘋(píng)果酸舒尼替尼原料藥（貨號(hào)HY-10255，純度99.60%）、陰性對(duì)照阿西替尼原料藥（貨號(hào)HY-10065，純度99.60%）均購(gòu)自美國(guó)MedChemExpress公司；陽(yáng)性對(duì)照阿霉素原料藥（貨號(hào)25316-40-9，純度＞95.0%）購(gòu)自東京化成工業(yè)株式會(huì)社；PI3K的激活劑3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol 3，4，5-triphosphate，PIP3）購(gòu)自美國(guó)Echelon Biosciences公司（貨號(hào)P-3917，純度＞95.0%）；鈣離子熒光探針Fluo-4/AM（貨號(hào)F14217）購(gòu)自美國(guó)Life Technology公司；表面活性劑F127（貨號(hào)9003-11-6）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；SYBR PCR Mix試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司。本研究所用心房鈉尿肽（atrial natriuretic peptide，ANP）、腦鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）和β-肌凝蛋白重鏈（β-myosin heavy chain，β-MHC）的引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度見(jiàn)表1。

表1 引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度

1.3 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

hiPSC-CMs購(gòu)自北京賽貝生物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 hiPSC-CMs的培養(yǎng)

細(xì)胞復(fù)蘇后，分別按30 000、10 000個(gè)/孔接種至NSP-96型電極孔板（經(jīng)纖連蛋白鋪底）和48孔板（提前放入6 mm的玻璃小片）內(nèi)，混勻，常溫下放置30 min后，于37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞鋪板復(fù)蘇48 h后，吸棄上清液，加入hiPSC-CMs完全培養(yǎng)基。在給藥前，每24 h更換一半培養(yǎng)基。預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示，在復(fù)蘇5 d后，細(xì)胞電信號(hào)逐漸達(dá)到平臺(tái)期，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 舒尼替尼對(duì)hiPSC-CMs收縮力的影響考察

阿霉素和阿西替尼采用二甲基亞砜（DMSO）配制成1 mmol/L的母液，舒尼替尼采用DMSO分別配制成0.5、1、3、5、10 mmol/L的母液，PIP3采用高壓滅菌水配制成1 mmol/L的母液，上述母液均于-20 ℃保存。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將阿霉素和阿西替尼的給藥濃度設(shè)為1 μmol/L，分別在給藥前和孵育24 h后，采用CardioExcyte 96系統(tǒng)檢測(cè)2種藥物對(duì)hiPSC-CMs收縮力的影響，以驗(yàn)證檢測(cè)系統(tǒng)的敏感性。

將hiPSC-CMs按30 000個(gè)/孔接種于NSP-96型電極孔板（經(jīng)纖連蛋白鋪底）中，然后以不同濃度[0（對(duì)照，含0.1%DMSO溶劑）、0.5、1、3、5、10 μmol/L，根據(jù)本課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置]舒尼替尼干預(yù)，每個(gè)濃度平行設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。采用CardioExcyte 96系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，給藥前30 min記錄給藥前收縮力，給藥后設(shè)定檢測(cè)程序：前2 h，每10 min檢測(cè)1次收縮信號(hào)，觀(guān)察舒尼替尼對(duì)hiPSC-CMs收縮力的急性抑制作用；給藥2 h后，系統(tǒng)每1 h記錄1次數(shù)據(jù)，記錄至給藥24 h時(shí)，然后擬合舒尼替尼抑制hiPSC-CMs收縮力的半數(shù)抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）。

2.3 舒尼替尼對(duì)hiPSC-CMs收縮頻率的影響考察

將hiPSC-CMs復(fù)蘇，按30 000個(gè)/孔接種于NSP-96型電極孔板（經(jīng)纖連蛋白鋪底），分為對(duì)照組（0.1%DMSO）和舒尼替尼組（3.14 μmol/L，根據(jù)“2.2”項(xiàng)下結(jié)果設(shè)置）。采用CardioExcyte 96系統(tǒng)檢測(cè)給藥/溶劑前30 min及給藥/溶劑后24 h各組細(xì)胞的收縮頻率。

2.4 舒尼替尼對(duì)hiPSC-CMs鈣瞬變幅度和鈣瞬變恢復(fù)時(shí)程的影響考察

將hiPSC-CMs復(fù)蘇，按10 000個(gè)/孔接種于48孔板（提前放入6 mm的玻璃小片）內(nèi)，分為對(duì)照組（0.1%DMSO）和舒尼替尼組（3.14 μmol/L，根據(jù)“2.2”項(xiàng)下結(jié)果設(shè)置），每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。作用24 h后，取出細(xì)胞小片置于氧飽和的有鈣臺(tái)式液中，隨后用含5 μmol/L Fluo-4/AM的鈣離子熒光探針和0.02%F127的有鈣臺(tái)式液，于37 ℃避光孵育20 min；更換有鈣臺(tái)式液后，將各組細(xì)胞于37 ℃恒溫浴槽內(nèi)持續(xù)灌流臺(tái)式液，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡線(xiàn)掃模式記錄細(xì)胞自發(fā)鈣瞬變幅度和鈣瞬變恢復(fù)時(shí)程。

2.5 舒尼替尼對(duì) hiPSC-CMs中 ANP、BNP、β-MHC mRNA表達(dá)水平的影響考察

將hiPSC-CMs復(fù)蘇，按30 000個(gè)/孔接種于96孔板中，按“2.3”項(xiàng)下方法分組與干預(yù)，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，作用24 h后，提取hiPSC-CMs總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)體系（共20 μL）包括：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL，ddH2O 6 μL，上下游引物各0.8 μL，cDNA 2 μL，ROX 0.4 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法分析目的基因mRNA的表達(dá)水平。

2.6 PI3K對(duì)舒尼替尼致hiPSC-CMs收縮抑制的影響考察

將hiPSC-CMs復(fù)蘇后，按30 000個(gè)/孔接種于NSP-96型電極孔板（經(jīng)纖連蛋白鋪底）中，分為對(duì)照組、PIP3組（1 μmol/L，劑量根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置）、舒尼替尼組（3.14 μmol/L）和舒尼替尼+PIP3組（3.14 μmol/L舒尼替尼+1 μmol/L PIP3），每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。PIP3組和舒尼替尼+PIP3組細(xì)胞提前用PIP3孵育4 h，然后各組再分別用0.1%DMSO或舒尼替尼（3.14 μmol/L）孵育24 h，采用CardioExcyte 96系統(tǒng)檢測(cè)各組細(xì)胞的收縮力。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 7、SPSS 20.0、Adobe Illustrator CS5進(jìn)行圖像處理及數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用±s表示。對(duì)服從正態(tài)分布和方差齊性的數(shù)據(jù)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Dunnett’s post hoc檢驗(yàn)。對(duì)不服從正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，采用Mann-Whitney非參數(shù)檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 舒尼替尼對(duì)hiPSC-CMs收縮力的影響

由圖1可知，給藥24 h后，阿霉素顯著減弱了hiPSCCMs的收縮力（P＜0.05），而阿西替尼對(duì)hiPSC-CMs收縮力并無(wú)顯著影響（P＞0.05），這表明檢測(cè)系統(tǒng)敏感。由圖2可知，舒尼替尼對(duì)hiPSC-CMs收縮力的抑制作用有濃度依賴(lài)趨勢(shì)，且當(dāng)舒尼替尼濃度≥1 μmol/L時(shí)，hiPSC-CMs收縮力呈明顯下降的趨勢(shì)。經(jīng)擬合，舒尼替尼抑制hiPSC-CMs收縮力的IC50值為3.14 μmol/L。

圖1 阿西替尼和阿霉素對(duì)hiPSC-CMs收縮力的影響[±s，n＝4（阿西替尼）或n＝3（阿霉素）]

圖2 不同濃度舒尼替尼對(duì)hiPSC-CMs收縮力的影響（±s，n＝4）

3.2 舒尼替尼對(duì)hiPSC-CMs收縮頻率的影響

對(duì)照組hiPSC-CMs給溶劑前后，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。舒尼替尼組給藥后，與對(duì)照組或給藥前比較，hiPSC-CMs收縮頻率均顯著降低（P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 舒尼替尼對(duì)hiPSC-CMs收縮頻率的影響[±s，n＝4（對(duì)照組）或n＝3（舒尼替尼組）]

3.3 舒尼替尼對(duì)hiPSC-CMs鈣瞬變幅度和鈣瞬變恢復(fù)時(shí)程的影響

與對(duì)照組相比，舒尼替尼組hiPSC-CMs鈣瞬變幅度顯著降低（P＜0.05），鈣瞬變恢復(fù)時(shí)程顯著延長(zhǎng)（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 舒尼替尼對(duì)hiPSC-CMs鈣瞬變幅度和鈣瞬變恢復(fù)時(shí)程的影響（±s，n＝4）

3.4 舒尼替尼對(duì) hiPSC-CMs 中 ANP、BNP、β-MHC mRNA表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，舒尼替尼組hiPSC-CMs中ANP、BNP、β-MHC mRNA表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 舒尼替尼對(duì)hiPSC-CMs中ANP、BNP、β-MHC mRNA表達(dá)的影響（±s，n＝4）

3.5 PI3K對(duì)舒尼替尼致hiPSC-CMs收縮抑制的影響

與對(duì)照組相比，PIP3組hiPSC-CMs收縮力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，舒尼替尼組hiPSC-CMs收縮力顯著降低（P＜0.05）；與舒尼替尼組比較，舒尼替尼+PIP3組hiPSCCMs收縮力顯著升高（P＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 PI3K對(duì)舒尼替尼致hiPSC-CMs收縮抑制的影響（±s，n＝4）

4 討論

目前，TKIs心臟毒性的分子機(jī)制研究及臨床藥物毒性篩選大多仍基于動(dòng)物體內(nèi)模型或動(dòng)物體外原代細(xì)胞模型、異源表達(dá)細(xì)胞模型或非心室來(lái)源的心肌細(xì)胞系，不能完全模擬人體心肌細(xì)胞的特征。hiPSC-CMs克服了人和其他動(dòng)物種屬間的差異和其他細(xì)胞模型的局限性，是理想的人源心肌細(xì)胞研究模型，目前已逐步應(yīng)用于多種藥物的心臟毒性風(fēng)險(xiǎn)篩查[10]。相關(guān)研究在動(dòng)物和非人源細(xì)胞水平觀(guān)察了舒尼替尼心臟毒性及相關(guān)分子機(jī)制[3，11-12]，但確切的分子機(jī)制還不明確。同時(shí)，尚缺乏舒尼替尼在hiPSC-CMs水平急性心肌毒性的機(jī)制及防治措施的相關(guān)研究?；诖?，本研究以hiPSC-CMs為模型細(xì)胞，用舒尼替尼誘導(dǎo)建立收縮功能障礙細(xì)胞模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，舒尼替尼可引發(fā)hiPSC-CMs鈣調(diào)控紊亂，進(jìn)而抑制細(xì)胞收縮力和收縮頻率，表明在hiPSC-CMs水平建立TKIs致心肌細(xì)胞收縮功能障礙模型具有可行性。但是，本研究所購(gòu)買(mǎi)的細(xì)胞為正常個(gè)體的人誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞，而藥物臨床應(yīng)用誘發(fā)的心臟毒性往往存在個(gè)體差異，可能存在基因敏感性[13]。鑒于目前實(shí)驗(yàn)技術(shù)日益成熟，TKIs藥物毒性研究可從臨床出發(fā)，獲得藥物使用過(guò)程中發(fā)生了心臟毒性患者的體細(xì)胞，將其誘導(dǎo)成多潛能干細(xì)胞，再進(jìn)一步分化獲得攜帶特定遺傳背景的hiPSC-CMs[14]，在此基礎(chǔ)上再進(jìn)行TKIs心臟毒性機(jī)制研究，可能對(duì)患者的個(gè)體化治療更具意義。

心肌細(xì)胞興奮-收縮耦聯(lián)平衡和鈣穩(wěn)態(tài)是心肌收縮的核心環(huán)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，多靶點(diǎn)TKIs伊馬替尼可激活Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴(lài)性蛋白激酶Ⅱ，使其磷酸化水平增強(qiáng)，進(jìn)而導(dǎo)致新生大鼠心肌細(xì)胞鈣調(diào)控異常，引發(fā)病理性心肌肥厚[15]。另一種TKIs索拉非尼的急性毒性作用則可導(dǎo)致心肌細(xì)胞受磷蛋白磷酸化降低，從而減弱其對(duì)心肌肌質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶的親和力，使肌質(zhì)網(wǎng)鈣瞬變幅度降低50%、鈣儲(chǔ)備降低33%，從而抑制心肌細(xì)胞收縮力[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，舒尼替尼可呈濃度依賴(lài)趨勢(shì)地抑制hiPSC-CMs的收縮，同時(shí)可破壞鈣調(diào)控的穩(wěn)態(tài)，具體表現(xiàn)為顯著的鈣瞬變幅度下降和鈣瞬變恢復(fù)時(shí)程延長(zhǎng)。這與前期相關(guān)研究觀(guān)察到的舒尼替尼急性毒性作用會(huì)濃度依賴(lài)性地降低鈣瞬變幅度，從而減弱心肌細(xì)胞收縮力的結(jié)果一致[4]。這說(shuō)明舒尼替尼引發(fā)鈣調(diào)控紊亂導(dǎo)致hiPSC-CMs收縮抑制可能和鈣通道內(nèi)流和肌質(zhì)網(wǎng)鈣泵活性降低有關(guān)，與其他體內(nèi)研究和體外細(xì)胞水平結(jié)果相一致[4-6]。前期相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，抑制PI3K活性是舒尼替尼、達(dá)沙替尼和厄洛替尼引發(fā)心律失常的重要因素[14]。本研究發(fā)現(xiàn)激活PI3K可顯著改善舒尼替尼導(dǎo)致的心肌收縮功能障礙，進(jìn)一步提示，抑制PI3K活性是TKIs心臟毒性的分子機(jī)制。另外，TKIs按作用靶點(diǎn)可分為單靶點(diǎn)、多靶點(diǎn)，本研究選擇多靶點(diǎn)的舒尼替尼作為代表藥物研究了TKIs的心臟毒性，下一步擬選擇多種TKIs類(lèi)藥物（包括不同靶點(diǎn)類(lèi)型、不同抗腫瘤機(jī)制）驗(yàn)證本研究結(jié)論。

綜上所述，本研究證明激活PI3K活性是改善舒尼替尼致心肌毒性的潛在分子機(jī)制。